青霉素V 鉀的有機半合成及其抑菌效果表征
——推薦一個化學生物學綜合實驗

林詩妍，張雨豪，李翀，王青青，張慧君，魏愛琳，吳麗娜

廈門大學化學化工學院，化學國家級實驗教學示范中心(廈門大學)，福建 廈門 361005

1 引言

青霉素是英國細菌學家亞歷山大·弗萊明發(fā)現(xiàn)的世界上的第一種抗生素，屬于β-內酰胺類抗生素(β-lactams)。青霉素讓猩紅熱、白喉、淋病等許多曾經的不治之癥得到了有效治療[1,2]，但是其大量使用引發(fā)了細菌的耐藥性。為了得到活性更強、對耐藥菌有破壞能力的青霉素，人們將青霉素裂解得到母核6-氨基青霉烷酸(6-Aminopenicilanic acid，6-APA)，以其為原料用化學或生物化學等方法制成帶有各種不同側鏈的青霉素。這樣合成的青霉素稱為半合成青霉素，具有抗酶、耐酸、廣譜抗菌性等優(yōu)點。

青霉素的有機半合成及其抑菌效果表征是囊括知識點極廣的綜合性實驗，目前國外僅有MIT等少數(shù)高校開設相關實驗內容[3]，國內關于該實驗的教學仍為空白。青霉素主要可分為：青霉素G類；青霉素V類；耐酶青霉素；廣譜青霉素；抗綠膿桿菌的廣譜青霉素和氮咪青霉素等。其中青霉素V的鉀鹽具有很好的耐酸性，不易被胃酸破壞，是世界上第一個口服抗生素。為豐富該實驗的教學意義并提高其可推廣性，我們鎖定了青霉素家族中較為常用的青霉素V鉀，優(yōu)化其合成方法，并設計化學生物學實驗表征青霉素的抑菌效果。

為提高青霉素V鉀產品的純度，我們對MIT教學資料中青霉素有機半合成方法進行了改進。首先，引入循環(huán)冷凝裝置使酰化反應由常溫改為在恒定低溫下進行，減少酰氯水解副產物的生成；其次，將硫酸酸化步驟溫度條件由室溫改為冰浴，防止產物的β-內酰胺環(huán)在高溫下被破壞；最后，為徹底除去酰氯水解生成的羧酸等副產物，我們用無水乙醇洗滌粗產物，有效提高產品的純度。以上改進使該實驗具備經濟、高效等優(yōu)點，更適用于高?；A實驗教學。

在青霉素的抑菌效果表征部分，我們采用微量二倍稀釋法進行抑菌實驗，既直觀表征抑菌效果，又精確地確定最低抑菌濃度(MIC)，也使學生掌握酶標儀的使用方法。同時，我們設計了青霉素的牛津杯抑菌實驗，重現(xiàn)當年弗萊明觀察到的抑菌圈，使青霉素的抑菌效果得到更直觀生動的展示。為了進一步豐富該實驗的教學意義、將科研成果融入教學，我們使用可標記細菌細胞壁的小麥胚芽凝集素(WGA)熒光標記結合熒光共聚焦顯微鏡，考察青霉素對細菌細胞壁的破環(huán)，讓學生從機制上了解青霉素的抑菌作用，激發(fā)學生的科研熱情。

本實驗融合了有機化學和化學生物學等多學科知識，讓學生體會到學科的交叉融合和前沿科學研究的魅力。該實驗涉及酰化反應、最低抑菌濃度、抑菌圈、熒光標記等多個知識點，綜合性強，有利于學生視野的拓展；其次，在實驗過程中也能使學生熟練掌握連續(xù)萃取、pH控制、分離純化等基本有機合成操作，以及微量二倍稀釋法測定MIC和牛津杯法抑菌圈實驗等生物實驗操作；此外，讓學生學習使用酶標儀、熒光共聚焦顯微鏡等新型儀器，感受儀器進步在科學研究上的推動作用。

2 青霉素V鉀有機半合成

2.1 合成機理

青霉素V鉀的合成涉及到一個重要的有機反應，即酰化反應(圖1)：以青霉素母核6-APA (1)為起始原料，將其溶解于碳酸氫鈉的丙酮/水溶液，使其轉變?yōu)轸人徕c鹽(2)。隨后，在循環(huán)冷凝裝置控制的5-10 °C低溫條件下[4]，利用苯氧乙酰氯與化合物2的氨基發(fā)生?；磻纯傻玫?α-(苯氧乙?；被?青霉素鈉鹽(3)。

圖1 青霉素V鉀合成的酰化反應

鹽和羧酸之間轉化的過程中涉及兩次萃取操作，以及一次用冷水清洗后的分液、除水操作。首先萃取出水相部分，在冰浴下通過酸化鈉鹽(3)使其轉變?yōu)榍嗝顾豓 (4)[2](圖2)。進一步萃取出有機相部分，加入有機鉀鹽使青霉素V轉變?yōu)樽罱K產物青霉素V鉀(5)。

圖2 青霉素V鉀的合成

最后，用少量丙酮洗滌產物以除去水等雜質，無水乙醇洗滌產物除去苯氧乙酰氯的水解產物苯氧乙酸。

在本實驗中安裝循環(huán)冷凝、萃取、過濾裝置的步驟和保留水相或有機相的連續(xù)兩次的萃取操作，鍛煉了學生基礎有機實驗的操作技能。

2.2 器材與試劑

儀器：磁力攪拌器(Heidolph MR Hei-Teo)、低溫冷卻液循環(huán)泵(庚雨儀器DLDB-5/20)、分析天平、紅外光譜儀(Thermo Nicolet IS10)、核磁共振譜儀(AVANCE III HD 500MHz)、抽濾裝置。

試劑：6-氨基青霉烷酸、苯氧乙酰氯、2-乙基己酸鉀(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，AR)，碳酸氫鈉、乙酸正丁酯(國藥集團化學試劑有限公司，AR)。

2.3 實驗步驟

投料：用橡膠管將循環(huán)冷凝裝置與100 mL雙層夾套燒杯相連，設置溫度為10 °C，雙層夾套燒杯中注水并放置在磁力攪拌器上。用夾子將50 mL圓底燒瓶豎直固定在雙層夾套燒杯中，搭建如圖3所示的裝置。攪拌下依次加入碳酸氫鈉(1.05 g)、丙酮(3 mL)和水(9 mL)，攪拌10 min。在溶液中加入6-APA (0.540 g，0.0025 mol)；

圖3 酰化反應裝置

?；合? mL丙酮中加入苯氧乙酰氯(0.45 mL，0.00325 mol)，在6-APA溶液中緩慢逐滴加入酰氯-丙酮溶液，10 °C下攪拌20 min；

萃?。簩⒎磻旌衔锏谷?50 mL的分液漏斗中，用3 × 6 mL室溫乙酸正丁酯萃取后分液，收集下層水相于50 mL錐形瓶，棄去上層有機相；

酸化：在冰浴冷卻條件下，往水相中加入6 mL冰浴的乙酸正丁酯，用冰浴冷卻過的5 mol·L-1硫酸酸化反應液至pH = 2.0；

反萃?。簩⑷芤旱谷?25 mL分液漏斗中，分出水層棄去，酯層用2 × 6 mL冷水洗滌后分液。收集上層有機相于50 mL錐形瓶，棄去下層水相。使用無水硫酸鈉干燥15-30 min，過濾；

轉變?yōu)殁淃}：濾液收集于50 mL錐形瓶中，在攪拌下加入2 mL 25%的2-乙基己酸鉀的丁醇溶液；

后處理：用少量丙酮清洗，抽濾；用12 mL的無水乙醇清洗，抽濾后自然風干過夜。收集青霉素V鉀產品，產量為0.1744 g，總產率為32.26%；

儀器表征：通過紅外光譜和核磁共振氫譜對產物進行表征。

2.4 結果與討論

2.4.1 青霉素V鉀的紅外光譜表征

通過紅外光譜分析對青霉素V鉀產物結構進行表征，得到的紅外光譜如圖4所示。其中合成產物(改進前)是依照MIT教學實驗方案所得青霉素V鉀[3]，合成產物(改進后)是依照步驟2.3所得青霉素V鉀。商品試劑、改進前后青霉素V鉀產物中的酰胺C＝O鍵的伸縮振動特征峰位于～1680 cm-1，β-內酰胺上C＝O鍵的伸縮振動特征峰位于～1774 cm-1，芳香環(huán)上C―H的伸縮振動特征峰位于～3040 cm-1，與文獻中青霉素紅外光譜的特征峰一致[5]。

圖4 商品試劑與合成青霉素V鉀產物紅外光譜對比

2.4.2 青霉素V鉀的核磁表征

以DMSO為溶劑時青霉素V鉀商品試劑的1H核磁數(shù)據(jù)如圖5所示：1H NMR (400 MHz, DMSOd6)：δ8.42 (d, 1H,J= 8.0 Hz), 7.72 (m, 2H), 6.92 (m, 3H), 5.41 (m, 2H), 4.62 (d, 2H,J= 2.2Hz), 3.88 (s,1H), 1.52 (s, 3H), 1.46 (s, 3H)。與文獻中青霉素的核磁共振氫譜數(shù)據(jù)一致[6]。

圖5 商品試劑與青霉素V鉀合成產物核磁共振氫譜圖對比

改進前青霉素V鉀的合成產物核磁共振氫譜如圖5所示，與商品試劑氫譜比對在δ7.0左右多了兩個雜峰，可能來自底物苯氧乙酰氯水解產生苯氧乙酸。為了除去副產物，我們做了以下改進：用循環(huán)冷凝裝置使?；磻?0 °C下進行，減少酰氯水解副產物的生成；通過查閱資料我們發(fā)現(xiàn)，常溫下苯氧乙酸在無水乙醇中有一定的溶解度，而青霉素V鉀幾乎不溶。為徹底除去酰氯水解等副產物，我們用無水乙醇洗滌粗產物。改進后青霉素V鉀的合成產物核磁氫譜圖中δ7.0左右的兩個雜峰基本已被消除，可判定其基本為青霉素V鉀純品。

3 青霉素V鉀的抑菌效果表征

3.1 青霉素抑菌原理

青霉素是一種β-內酰胺類抗生素，其抗菌效果主要來源于其結構中的β-內酰胺環(huán)。在細菌細胞壁合成的轉肽階段，由于青霉素的β-內酰胺環(huán)與細胞壁肽聚糖單體五肽尾末端中的D-丙氨酰-D-丙氨酸結構相似，可與后者競爭轉肽酶的活性中心[7](圖6)，阻止兩個肽聚糖單體之間肽橋的形成，造成細菌細胞壁的缺損，從而起到殺死細菌的作用。由于哺乳動物的細胞沒有細胞壁，青霉素在殺死細菌的同時，不損害人體自身細胞[8]。

圖6 青霉素的抑菌原理：與肽聚糖中的D-丙氨酰-D-丙氨酸競爭轉肽酶活性中心

3.2 器材與試劑

儀器：酶標儀(SpectraMax iD5)、渦旋儀(SCILOGEX MX-F)、酶標板、牛津杯(Tansoole)、移液槍、恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9162)、4 °C 冰箱、渦旋儀(SCILOGEX MX-F)、小型臺式冷凍離心機(eppendoff 5424R)、搖床(SUKUN SKY-2102C)。

材料：金黃色葡萄球菌CICC 23656減毒株。

試劑：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基，上海生工)、商品化青霉素V鉀(上海生工)、青霉素V鉀藥片(哈藥集團)、無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司，AR)、1 × HBSS (Hank’s平衡鹽溶液，0.22 μm濾膜過膜，上海生工)、WGA熒光染料(1 × HBSS配制，1 mg·mL-1，賽默飛世爾科技)。

以下實驗均采用無菌操作。

3.3 微量二倍稀釋法測定最低抑菌濃度

3.3.1 實驗步驟

菌液配制：挑取3個金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, S. aureus)單菌落于LB培養(yǎng)基中，250 r·min-1、37 °C振蕩培養(yǎng)12 h (～109CFU·mL-1)；用LB培養(yǎng)基以10倍梯度稀釋法稀釋至終濃度～106CFU·mL-1；

配制青霉素V鉀溶液：① 取青霉素V鉀片1片(含青霉素V鉀236 mg)，超聲溶于2.36 mL超純水中，得到濃度為100 mg·mL-1的原液；② 取商品化青霉素V鉀100 mg溶于1 mL超純水中，得到濃度為100 mg·mL-1的原液；③ 取半合成青霉素10 mg溶于1 mL超純水中，得到濃度為10 mg·mL-1的原液。根據(jù)具體實驗需要，將抗生素原液用LB培養(yǎng)基以10倍梯度稀釋法稀釋至所需濃度(本實驗中將三組青霉素稀釋至1 μg·mL-1)。

最低抑菌濃度(MIC)的測定：最低抑菌濃度是指藥物抑制微生物生長的最低濃度[8]。采用微量二倍稀釋法確定青霉素V鉀的MIC，如圖7所示：(1) 在酶標板的每個孔中加入LB培養(yǎng)基75 μL；(2) 在每排的第1孔加配好的青霉素V鉀溶液75 μL，然后對青霉素V鉀溶液進行二倍稀釋。即第1孔中加入青霉素V鉀溶液后用移液槍充分吹吸混勻(至少三次以上)，然后吸取75 μL加入第2孔再充分吹打，照此重復直至第10孔，第10孔中吸出75 μL棄去；(3) 在第1孔至第10孔中加入稀釋好的菌液75 μL，吹吸混勻；(4) 在同一塊板上的第11孔做陰性對照，即僅加LB培養(yǎng)基150 μL不加菌液；第12孔做陽性對照，即僅加150 μL菌液不加青霉素V鉀溶液。

圖7 微量二倍稀釋法確定最低抑菌濃度

每種青霉素重復上述操作3次，分別使用3組菌液做平行實驗。加樣完成后，酶標板于37 °C搖床中孵育12 h，在酶標儀中選擇600 nm作為測定波長。(酶標板中，第1孔至第10孔青霉素V鉀濃度分別為0.250、0.125、6.25 × 10-2、3.13 × 10-2、1.56 × 10-2、7.81 × 10-3、3.91 × 10-3、1.96 × 10-3、9.77 ×10-4、4.88 × 10-4μg·mL-1，第11號孔作為無菌陰性對照，第12號孔作為有菌陽性對照，如圖8所示)。

圖8 藥品、商品試劑和合成青霉素V鉀在酶標板中的濃度分布

3.3.2 結果與討論

振蕩孵育12 h后，從搖床中取出酶標板(圖9)，肉眼可觀察到第5列與第6列之間存在明顯的渾濁度差異，說明細菌在第5列左右開始生長，此前濃度的青霉素均無細菌生長，抑菌效果較強。

圖9 微量二倍稀釋法確定青霉素V鉀MIC

用酶標儀進行抑菌效果的精確測定，酶標板中各孔的吸光值如圖10熱圖所示。藥品組、商品試劑組和合成產物組的OD600值均在第5列開始有所增加，說明合成的青霉素V鉀與商品化藥品具有相似的抑菌效果，進一步證明了該合成產物的純度。三組青霉素V鉀的MIC在1.56 × 10-2-3.13 × 10-2μg·mL-1之間。

圖10 藥品、商品試劑和合成青霉素V鉀的抑菌效果的熱圖展示

3.4 牛津杯法抑菌實驗

3.4.1 實驗步驟

牛津杯滅菌：提前準備四個牛津杯浸泡于無水乙醇中滅菌；

青霉素V鉀配制：將3.3.1中配制好的1 μg·mL-1青霉素V鉀稀釋至5 × MIC、10 × MIC、20 ×MIC；

指示菌懸液配制：挑取S. aureus單菌落于LB培養(yǎng)基中，250 r·min-1、37 °C振蕩培養(yǎng)12 h (～109CFU·mL-1)；用LB培養(yǎng)基以10倍梯度稀釋法稀釋至終濃度～106CFU·mL-1；

雙層平板制備：取平板傾注LB培養(yǎng)基10 mL，使其在平板內均勻攤布，放置于水平臺面上凝固，作為底層。另取4.5 mL提前融化的LB培養(yǎng)基冷卻至50 °C左右，加入0.5 mL稀釋好的指示菌懸液，混合均勻后，倒入平板中，使其在底層上均勻攤布，作為菌層。放置在水平臺上冷卻。將牛津杯從無水乙醇中取出并風干。用鑷子將4個無菌的牛津杯輕輕放入培養(yǎng)基平板中，呈正方形排列，如圖11所示；

圖11 牛津杯在培養(yǎng)基平板中的排列

牛津杯加樣：牛津杯中分別加入5 × MIC、10 × MIC和20 × MIC青霉素V鉀溶液和LB培養(yǎng)基各0.20 mL；

菌液擴散及指示菌培養(yǎng)：將培養(yǎng)基平板放置于4 °C冰箱中使青霉素V鉀溶液擴散12 h，再放置于37 °C恒溫箱中培養(yǎng)12 h[4]，觀察結果。

3.4.2 結果與討論

青霉素V鉀的牛津杯抑菌情況如圖12所示，經過測量，青霉素V鉀濃度為5 × MIC、10 × MIC、20 × MIC的牛津杯抑菌圈大小分別為14.30、17.66、21.45 mm，陰性對照LB培養(yǎng)基的牛津杯未出現(xiàn)抑菌圈。已知：抑菌直徑 ≥ 20 mm，為極度抑菌；15 mm ≤ 抑菌直徑 ≤ 20 mm，為高度抑菌；10 mm ≤抑菌直徑 ≤ 15 mm，為中度抑菌；抑菌直徑 ≤ 10 mm為無抑菌作用[9]。因此，濃度為5 × MIC的青霉素V鉀溶液具有中度抑菌作用；濃度為10 × MIC的青霉素V鉀具有高度抑菌作用；濃度為20 × MIC的青霉素V鉀溶液具有極度抑菌作用。

圖12 不同濃度青霉素V鉀的抑菌圈測定

3.5 青霉素作用機理的Alexa Fluor 633-WGA熒光標記結合共聚焦熒光顯微鏡表征

3.5.1 WGA熒光標記原理

小麥胚芽凝集素(WGA)是廣泛應用于細胞生物學的凝集素。WGA識別糖受體尾N-乙酰葡萄糖胺，傾向于與其二聚體和三聚體結合[10]。細菌細胞壁肽聚糖、幾丁質、軟骨糖胺聚糖和糖脂也能與WGA結合，當熒光染料與WGA耦聯(lián)時，可用于細菌細胞壁的標記。

3.5.2 實驗步驟

Alexa Fluor 633-WGA (flWGA)染色：分別取27 μL微量二倍稀釋法實驗中4號孔和12號孔的菌液至1.5 mL滅菌EP管中，用1 × HBSS洗滌一次(4 °C、12000 g、8 min)，按合適的染色比例進行flWGA染色(預實驗染色比例為1.33 × 106CFU·μL-1，即1 μL 1 mg·mL-1flWGA染1.33 × 106CFU的菌)，建議使用20 μL 1 mg·mL-1flWGA；37 °C、250 r·min-1避光振蕩培養(yǎng)1 h 30 min；

洗滌：染色完成的菌液用1 × HBSS洗滌兩次(4 °C、12000 g離心8 min)，最終用1 × HBSS調節(jié)濃度約為109CFU·mL-1；

固定：以上菌液經4 °C、12000 g離心8 min，相同體積的4%多聚甲醛(PFA) 37 °C水浴30 min；

重懸：細菌固定完成后4 °C、12000 g離心8 min，1 × HBSS洗滌一次，后用相同體積重懸，置于4 °C冰箱保存；

制片：在載玻片中滴入8 μL重懸菌液，蓋上蓋玻片；

觀察：使用熒光共聚焦顯微鏡成像。設置激發(fā)光源波長為632 nm，熒光通道波長為647-662 nm，使用100 ×油鏡作為物鏡。

3.5.3 結果與討論

細胞壁有固定細胞外形和提高機械強度，使細菌免受滲透壓等外力損傷的作用[11]，為驗證青霉素通過阻礙細菌細胞壁合成的抑菌機理，我們對熒光共聚焦成像結果進行分析：如圖13a，未受青霉素作用的金黃色葡萄球菌呈典型的葡萄串狀排列，熒光場顯示flWGA將細菌細胞壁染成紅色，完整地包裹在細胞外圍。MIC濃度的青霉素作用12小時后(圖13b)，有些細菌細胞壁部分殘缺，缺少細胞壁機械固定作用的細菌明顯溶脹，細菌體積比正常菌體明顯增大在熒光共聚焦顯微鏡下顯示出紅色的殘影。

圖13 熒光共聚焦顯微鏡表征青霉素作用細菌細胞壁完整性

通過對青霉素作用的細菌細胞壁的熒光表征，我們驗證了青霉素的殺菌機理為阻礙生長期細菌的細胞壁合成，從而影響細菌細胞壁的完整度，使細菌因缺少細胞壁的機械保護作用而溶脹破碎。

4 實驗安排及建議

(1) 本實驗所需要的時間為12課時，其中青霉素V鉀的有機半合成需要6個課時完成，微量二倍稀釋法實驗和牛津杯抑菌實驗需要3個課時完成，青霉素作用機理的flWGA熒光標記結合共聚焦熒光顯微鏡表征作為展示實驗需要3個課時完成。建議將本實驗作為學生的綜合實驗。

(2) 考慮到細菌培養(yǎng)和培養(yǎng)基配制的時間要求，建議教學組提前準備好指示菌菌液及LB培養(yǎng)基。學生完成微量二倍稀釋法實驗和牛津杯抑菌實驗后，教學組負責將酶標板和固體培養(yǎng)基由37 °C恒溫環(huán)境轉移至4 °C冰箱中保存，待學生查看實驗結果。

(3) 為節(jié)約實驗耗材與方便學生實驗操作，建議微量二倍稀釋法測定最低抑菌濃度在實際教學中可適當簡化實驗步驟，如學生僅需完成商品試劑和合成產物的MIC測定。

(4) 考慮到flWGA熒光標記結合共聚焦熒光顯微鏡表征實驗操作對本科生要求較高，建議將本部分以展示實驗的形式開設，即學生完成制片，共聚焦熒光顯微鏡的操作由教師展示并和同學們一起觀察成像結果。

(5) 實驗前學生需要查閱青霉素的發(fā)展歷史及抑菌作用機理。要求學生學習鞏固大學三年級學習的?；磻獧C理和熒光共聚焦顯微鏡的使用。

(6) 實驗主要針對大學四年級化學生物學專業(yè)學生開設，每2人一組進行實驗。要求組內成員合理分工，協(xié)作完成實驗。實驗也可作為綜合拓展實驗為化學中心科學實驗班及化學專業(yè)高年級學生開設。

(7) 實驗完成后，建議實驗報告以研究型論文格式提交，要求對實驗結果進行討論和總結。

(8) 若以拓展實驗的形式開設，學生在實驗中可自行選擇合成青霉素的側基，以合成不同類型的青霉素；自行設計青霉素的濃度，以確定最低抑菌濃度和表征抑菌效果。

5 結語

對標國家建設一流課程的“兩性一度”(高階性、創(chuàng)新性和一定的挑戰(zhàn)度)要求，我們引進MIT實驗課程“Synthesis and Biological Testing of Penicillins”，對其進行了改進和拓展。我們通過改進實驗步驟提高了有機合成部分青霉素產品的純度，設計化學生物手段表征青霉素的抑菌效果和抑菌機制，該實驗的流程如圖14所示。希望能更有效推廣這個科學內涵豐富且極具展示度的綜合性實驗。

圖14 青霉素V鉀有機半合成及其抑菌效果表征

該實驗綜合有機化學和化學生物學的實驗原理和操作方法，是集化學合成與生物表征為一體的綜合性強的實驗。該實驗所涉及的綜合實驗技術和前沿知識將幫助學生通過不同的視角理解化學生物學這個交叉學科。

6 創(chuàng)新性

1) 引入循環(huán)冷凝裝置控制低溫，冰浴條件下酸化和無水乙醇后處理，提高青霉素產品純度。

2) 引入微量稀釋法、牛津杯抑菌法表征青霉素抑菌效果，flWGA熒光標記結合熒光共聚焦顯微鏡展示青霉素抑菌機理。

3) 模擬探索性科學研究過程，實現(xiàn)學科交叉融合，激發(fā)學生科研熱情。

致謝：感謝廈門大學化學國家級實驗教學示范中心周金梅高級實驗師及有關技術人員的幫助和指導。