超分子組裝體動(dòng)態(tài)重構(gòu)綜合實(shí)驗(yàn)

李盼盼，王仲瑞，王旭

山東大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，濟(jì)南 250100

科學(xué)家們因其在超分子化學(xué)與耗散結(jié)構(gòu)研究方面的貢獻(xiàn)而分別獲得了1977年和1987年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)[1,2]。這些重要成果是人類向生命體深入學(xué)習(xí)而獲得的。在生物系統(tǒng)中，化學(xué)燃料或能量的輸入可激活結(jié)構(gòu)單元，使其自組裝形成瞬態(tài)結(jié)構(gòu)。生命體利用這種受控于耗散熱力學(xué)的非平衡超分子組裝來(lái)調(diào)整其結(jié)構(gòu)和功能以實(shí)現(xiàn)自我調(diào)節(jié)[3-8]。受此啟發(fā)，研究者們?cè)O(shè)計(jì)出了一系列化學(xué)燃料驅(qū)動(dòng)的、瞬態(tài)的、遠(yuǎn)離熱力學(xué)平衡態(tài)的超分子體系，并將其應(yīng)用于智能材料的研究和開(kāi)發(fā)[9-16]。開(kāi)發(fā)非平衡組裝體系并探究其組裝機(jī)制可以加深對(duì)生命體的理解，并在設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)新型智能材料中發(fā)揮重要作用。

利用非平衡組裝可以制備出結(jié)構(gòu)、功能、壽命可調(diào)的瞬態(tài)材料，其中以瞬態(tài)水凝膠材料最為典型[17]。近年來(lái)，科學(xué)家通過(guò)模仿生命系統(tǒng)中的組裝-解組裝行為并結(jié)合化學(xué)反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，制備出了多種可應(yīng)用于藥物控釋及信息加密等領(lǐng)域的瞬態(tài)水凝膠材料[9,10,15]。與此同時(shí)，對(duì)合成體系非平衡組裝機(jī)制的深入研究同樣備受關(guān)注。設(shè)計(jì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)，可使學(xué)生初步接觸超分子化學(xué)領(lǐng)域的前沿問(wèn)題，激發(fā)其學(xué)習(xí)興趣與熱情，并鍛煉其綜合實(shí)驗(yàn)技能。

在本實(shí)驗(yàn)中，將構(gòu)建一個(gè)宏觀上表現(xiàn)出沉淀→凝膠→沉淀轉(zhuǎn)變現(xiàn)象的非平衡組裝體系，并提出超分子組裝體動(dòng)態(tài)重構(gòu)機(jī)制。該實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，現(xiàn)象明顯，適合實(shí)驗(yàn)教學(xué)，除基礎(chǔ)操作外，還加入透射電子顯微鏡(TEM)、熒光光譜儀、圓二色譜儀的使用，讓學(xué)生在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不僅可以學(xué)習(xí)到非平衡組裝體系的構(gòu)建方法及組裝機(jī)制，還能滿足學(xué)生學(xué)習(xí)現(xiàn)代科學(xué)表征技術(shù)的需求。

1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h2>

(1) 了解非平衡組裝的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用前景。

(2) 掌握非平衡組裝體系的構(gòu)建方法。

(3) 掌握?qǐng)A二色光譜和熒光光譜用于非平衡組裝體系研究的分析方法。

2 實(shí)驗(yàn)原理

G-四分體是四個(gè)鳥(niǎo)嘌呤通過(guò)Hoogsteen氫鍵連接形成的環(huán)狀平面，兩個(gè)或兩個(gè)以上的G-四分體通過(guò)π-π堆積形成G-四鏈體[18,19]。鳥(niǎo)苷5’-單磷酸二鈉鹽(GMP)在酸性條件下可形成G-四分體和G-四鏈體結(jié)構(gòu)，GMP的磷酸基團(tuán)使其具有pH響應(yīng)性和離子結(jié)合能力(圖1)[19]。因此，將GMP與化學(xué)燃料驅(qū)動(dòng)的pH計(jì)時(shí)反應(yīng)合理地結(jié)合在一起，即可構(gòu)建非平衡組裝體系。尿素-脲酶計(jì)時(shí)反應(yīng)是一個(gè)經(jīng)典的、常用來(lái)控制超分子體系性質(zhì)的pH計(jì)時(shí)反應(yīng)[20,21]。鑭離子(La3+)的交聯(lián)作用可進(jìn)一步放大組裝體，從而便于直接觀測(cè)體系的相轉(zhuǎn)變行為。而且，GMP、La3+、脲酶(urease)在堿性和酸性條件下分別組裝成納米顆粒和納米纖維，在宏觀上則分別表現(xiàn)為沉淀與凝膠(圖2)。因此，在本實(shí)驗(yàn)中，向初始pH為8的GMP/La/urease體系中加入化學(xué)燃料(酸性尿素溶液)，體系pH迅速下降，GMP/La/urease從沉淀狀態(tài)變成凝膠態(tài)；與此同時(shí)，體系中的urease催化分解尿素產(chǎn)生氨，使得體系pH緩慢上升，達(dá)到一定pH后，GMP/La/urease從凝膠態(tài)變?yōu)槌恋頎顟B(tài)，至此，實(shí)現(xiàn)了沉淀→凝膠→沉淀動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)換，即超分子組裝體的動(dòng)態(tài)重構(gòu)(圖3)。該體系還可通過(guò)反復(fù)添加化學(xué)燃料實(shí)現(xiàn)沉淀→凝膠→沉淀重復(fù)轉(zhuǎn)變。

圖1 GMP的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

圖2 GMP/La/urease體系在不同pH下的宏觀狀態(tài)

圖3 GMP/La/urease體系的超分子組裝體動(dòng)態(tài)重構(gòu)過(guò)程

3 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)所用儀器和實(shí)驗(yàn)所用試劑詳見(jiàn)表1、表2。

表1 主要實(shí)驗(yàn)儀器

4 實(shí)驗(yàn)步驟

4.1 溶液配制

濃度為200 mmol·L-1的GMP水溶液的配制：稱取8.144 g GMP，少量蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至容量瓶，用蒸餾水定容至100 mL。

濃度為16 mmol·L-1的La(NO3)3水溶液的配制：稱取0.6928 g La(NO3)3，少量蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至容量瓶，用蒸餾水定容至100 mL。

配制濃度為5 mg·mL-1的脲酶水溶液：稱取0.05000 g脲酶，少量蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至容量瓶，用蒸餾水定容至10 mL。

配制化學(xué)燃料：稱取9 g尿素，用100 mL濃度為1 mol·L-1的檸檬酸緩沖液(pH = 4)溶解。

4.2 非平衡組裝體系的構(gòu)建

(1) 取0.5 mL濃度為200 mmol·L-1的GMP水溶液、0.5 mL濃度為16 mmol·L-1的La(NO3)3溶液、0.4 mL濃度為5 mg·mL-1的脲酶水溶液、0.4 mL蒸餾水，混合均勻，得到帶有沉淀的溶液，取出少量樣品進(jìn)行TEM分析，并測(cè)定此時(shí)體系的pH、熒光光譜和圓二色光譜。

(2) 向上述沉淀中加入0.2 mL化學(xué)燃料(酸性尿素溶液)，混合均勻，靜置1 min，得到不透明水凝膠。觀察變化并定時(shí)拍攝照片、取樣進(jìn)行TEM分析、測(cè)定pH、熒光光譜和圓二色光譜。

5 結(jié)果與討論

5.1 加入化學(xué)燃料后，GMP/La/urease體系狀態(tài)隨時(shí)間的變化

如圖4所示，向初始pH = 8的GMP/La/urease體系中加入化學(xué)燃料(最終濃度為：9 mg·mL-1尿素，0.1 mol·L-1檸檬酸緩沖液，pH = 4)后，GMP/La/urease體系的pH迅速下降，沉淀快速變成凝膠。于此同時(shí)，化學(xué)燃料中的尿素在體系中脲酶的催化下會(huì)緩慢分解產(chǎn)生氨，使得體系pH升高，GMP/La/urease凝膠逐漸變成了沉淀。以上沉淀→凝膠→沉淀動(dòng)態(tài)變化的結(jié)果說(shuō)明GMP/La/urease體系在非平衡組裝過(guò)程中一直存在超分子組裝體，該非平衡組裝過(guò)程是一個(gè)超分子組裝體動(dòng)態(tài)重構(gòu)的過(guò)程。

圖4 加入化學(xué)燃料后，GMP/La/urease體系狀態(tài)隨時(shí)間變化

5.2 加入化學(xué)燃料后，GMP/La/urease體系pH隨時(shí)間的變化

向GMP/La/urease體系中加入化學(xué)燃料，體系的pH會(huì)隨時(shí)間變化而發(fā)生變化，結(jié)果如圖5所示。從圖中可看出，化學(xué)燃料的加入使得體系pH呈現(xiàn)先降后升的趨勢(shì)，這主要是由于化學(xué)燃料中包含的酸性緩沖液使得體系pH快速下降，而化學(xué)燃料中的尿素在脲酶催化下分解生成氨，從而使得體系pH緩慢上升。pH的變化是導(dǎo)致GMP/La/urease組裝行為發(fā)生變化的主要原因。

圖5 加入化學(xué)燃料后，GMP/La/urease體系pH隨時(shí)間變化

5.3 GMP/La/urease非平衡組裝過(guò)程中微觀結(jié)構(gòu)的變化

本實(shí)驗(yàn)利用透射電子顯微鏡觀察GMP/La/urease體系非平衡組裝過(guò)程中微觀結(jié)構(gòu)的變化。如圖6所示，未加入化學(xué)燃料時(shí)，GMP/La/urease形成了不規(guī)則的納米顆粒，這主要是因?yàn)榇藭r(shí)體系處于堿性狀態(tài)，GMP上的磷酸基團(tuán)質(zhì)子化程度較低，帶負(fù)電荷較多，與金屬離子之間的靜電相互作用更強(qiáng)；加入化學(xué)燃料后，不規(guī)則聚集體變成了納米纖維，體系變?yōu)樗嵝原h(huán)境，GMP上的磷酸基團(tuán)質(zhì)子化程度變高，GMP與La3+之間的相互作用以離子-偶極相互作用為主，形成了G-四鏈體結(jié)構(gòu)，urease作為交聯(lián)劑將纖維連接在一起形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。隨著時(shí)間的推移，納米纖維解離，重新變回了不規(guī)則的聚集體。TEM結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)GMP/La/urease體系在沉淀→凝膠→沉淀變化過(guò)程中一直存在超分子組裝體，該非平衡組裝過(guò)程是一個(gè)超分子結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)重構(gòu)的過(guò)程。

圖6 加入化學(xué)燃料后，GMP/La/urease體系在不同時(shí)間時(shí)的TEM圖

5.4 GMP/La/urease非平衡組裝過(guò)程中熒光性質(zhì)的變化

如圖7所示，硫黃素T (ThT)分子由一個(gè)苯胺環(huán)和一個(gè)苯并噻唑環(huán)組成，這兩個(gè)環(huán)可以圍繞C―C鍵自由旋轉(zhuǎn)，導(dǎo)致ThT熒光很低，當(dāng)ThT與G-四鏈體特異性結(jié)合時(shí)，這種旋轉(zhuǎn)被限制，ThT的熒光得以增強(qiáng)，基于此原理，ThT被廣泛用作檢測(cè)G-四鏈體結(jié)構(gòu)的熒光指示劑。在本實(shí)驗(yàn)中，將ThT加入GMP/La/urease中，然后加入化學(xué)燃料，通過(guò)測(cè)定非平衡組裝過(guò)程中熒光強(qiáng)度的變化來(lái)監(jiān)測(cè)該過(guò)程中超分子組裝體的結(jié)構(gòu)演化。從圖8中的結(jié)果可看出，GMP/La/urease/ThT在490 nm處的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，說(shuō)明化學(xué)燃料的加入使得GMP/La/urease非平衡組裝體系中暫時(shí)出現(xiàn)了G-四鏈體結(jié)構(gòu)。隨后，熒光強(qiáng)度的下降表明G-四鏈體結(jié)構(gòu)發(fā)生了解離。

圖7 ThT的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

圖8 GMP/La/urease/ThT體系隨時(shí)間變化的熒光強(qiáng)度

5.5 GMP/La/urease非平衡組裝過(guò)程中圓二色性的變化

圓二色光譜學(xué)是用來(lái)檢測(cè)G-四鏈體結(jié)構(gòu)的常用方法之一，因此，本實(shí)驗(yàn)中用圓二色光譜學(xué)監(jiān)測(cè)了GMP/La/urease非平衡組裝過(guò)程中超分子組裝體的結(jié)構(gòu)演化，結(jié)果如圖9所示。在加入化學(xué)燃料后，GMP/La/urease在240 nm處的圓二色信號(hào)出現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，表明G-四鏈體先形成后解離的動(dòng)態(tài)變化。該結(jié)果與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，都說(shuō)明了本實(shí)驗(yàn)中非平衡組裝的機(jī)制是超分子結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)重構(gòu)，而不是傳統(tǒng)的組裝-解組裝機(jī)制，也證實(shí)了合成非平衡組裝體系的多樣性。

圖9 GMP/La/urease/ThT體系隨時(shí)間變化的圓二色性

6 實(shí)驗(yàn)組織運(yùn)行建議

(1) 本實(shí)驗(yàn)是利用酶促計(jì)時(shí)反應(yīng)調(diào)控超分子組裝體的動(dòng)態(tài)重構(gòu)，與大多數(shù)傳統(tǒng)的自組裝過(guò)程和非平衡組裝過(guò)程均不同，建議本科高年級(jí)開(kāi)設(shè)。建議學(xué)生課前做好預(yù)習(xí)，閱讀相關(guān)文獻(xiàn)資料，理解非平衡組裝的特點(diǎn)及其與自組裝的區(qū)別，理解本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理。

(2) 化學(xué)燃料中的尿素可與酸反應(yīng)或發(fā)生水解，為了避免化學(xué)燃料失去作用，建議本實(shí)驗(yàn)中所用化學(xué)燃料現(xiàn)配現(xiàn)用，以保證非平衡組裝體系的成功構(gòu)建。

(3) 化學(xué)燃料中尿素濃度對(duì)氨單位時(shí)間內(nèi)的產(chǎn)生量影響較大，進(jìn)而影響體系pH變化速率和瞬態(tài)凝膠壽命，尿素濃度越高，氨單位時(shí)間內(nèi)的產(chǎn)生量越大，體系pH升高得越快，瞬態(tài)凝膠的壽命越短，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中教師可根據(jù)課程時(shí)間選擇合適的尿素濃度來(lái)調(diào)節(jié)瞬態(tài)凝膠的壽命。

(4) 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前建議教師向?qū)W生講解實(shí)驗(yàn)原理、儀器使用方法及注意事項(xiàng)等。

(5) 本實(shí)驗(yàn)為綜合性實(shí)驗(yàn)，涉及大型儀器的使用，建議每名學(xué)生獨(dú)立完成非平衡組裝體系的構(gòu)建及照片拍攝、pH監(jiān)測(cè)，結(jié)構(gòu)及性質(zhì)表征可分組進(jìn)行，共同學(xué)習(xí)儀器的使用并分析、討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

(6) 每名學(xué)生需在課后獨(dú)立完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告，積極思考，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和分析。在完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告的過(guò)程中鞏固知識(shí)，深刻理解非平衡組裝原理。

7 結(jié)語(yǔ)

本文介紹了一個(gè)大學(xué)化學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)，主要包括了超分子組裝體動(dòng)態(tài)重構(gòu)體系的構(gòu)建方法、機(jī)理研究及性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的表征方法等相關(guān)內(nèi)容。非平衡組裝體系的構(gòu)建和機(jī)理研究是目前比較熱門(mén)的科研方向，本文將最新的科研成果轉(zhuǎn)化為化學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)的教學(xué)內(nèi)容，有助于提高學(xué)生對(duì)科學(xué)研究的興趣，引領(lǐng)學(xué)生了解科技前沿，培養(yǎng)學(xué)生科學(xué)思維。通過(guò)實(shí)驗(yàn)操作，可鍛煉學(xué)生實(shí)驗(yàn)操作能力，使學(xué)生掌握大型儀器的使用方法及數(shù)據(jù)分析方法，提升學(xué)生綜合技能，為學(xué)生日后科研工作奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。