紫外-熒光檢測器串聯(lián)高效液相色譜法測定維生素B2片含量的實驗設(shè)計

謝一凡，姚莉韻,＊，楊若林，蔡玉興，金玉杰，李寧

1 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗教學(xué)中心，上海 200025

2 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，藥物化學(xué)與生物信息學(xué)中心，上海 200025

維生素B2也稱核黃素(化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1)，缺乏可引起口角炎、舌炎、貧血等[1]。維生素B2廣泛參與機(jī)體各種物質(zhì)和能量代謝，是許多酶系統(tǒng)的重要輔基組分，也是嬰幼兒配方乳粉中的一個重要營養(yǎng)指標(biāo)[2]。

圖1 維生素B2的結(jié)構(gòu)式

由于維生素B2結(jié)構(gòu)中含共軛雙鍵，既有紫外吸收又有熒光特性，故常采用紫外分光光度法[3]、熒光分光光度法[4]和高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)[5]進(jìn)行含量測定。紫外分光光度法和熒光分光光度法由于不分離樣品，所含微量雜質(zhì)會影響測試結(jié)果；而HPLC法利用色譜柱分離后再進(jìn)行測定，能排除雜質(zhì)干擾，但常規(guī)HPLC法一般只采用單一檢測器(紫外)，對檢測靈敏度會有影響。因此采用串聯(lián)雙檢測器的HPLC法，對維生素B2片的含量測定具有更高的靈敏度[6]。

儀器分析實驗是我校醫(yī)學(xué)檢驗專業(yè)學(xué)生的一門重要課程，教學(xué)目的是了解儀器的構(gòu)造、掌握儀器的性能和操作方法，并為后續(xù)檢驗專業(yè)實踐打下基礎(chǔ)。基于此目標(biāo)，我們將與專業(yè)關(guān)聯(lián)度不大的“HPLC法測定槐角提取液中槐甙的含量”實驗[7]，改為“HPLC法檢測維生素B2片的含量”。實驗方案設(shè)計中，從提高學(xué)生學(xué)習(xí)興趣、培養(yǎng)其科學(xué)思維和創(chuàng)新能力的目標(biāo)出發(fā)，將高廣譜性可變波長紫外檢測器(variable wavelength UV detector，UVD)和高特異性熒光檢測器(fluorescence detector，F(xiàn)LD)串聯(lián)應(yīng)用于HPLC法中，實驗中學(xué)生不僅能掌握兩種檢測器的原理和操作，而且通過對紫外和熒光色譜圖測試結(jié)果差異性的比較學(xué)習(xí)，能拓展學(xué)生對現(xiàn)有知識的應(yīng)用，提高學(xué)生發(fā)現(xiàn)問題、解決問題的能力，進(jìn)而提高其創(chuàng)新能力[8,9]。

1 實驗方法

1.1 儀器與試劑

儀器：高效液相色譜儀(Agilent1100，美國Agilent，配UVD/FLD)。XS105電子分析天平(Mettler Toledo，瑞士)，USC-302超聲波清洗儀(上海波龍電子設(shè)備有限公司)，刻度移液管，棕色容量瓶(500 mL，50 mL，10 mL)，石英玻璃比色皿(Q)，普通玻璃比色皿(G)。色譜柱(ZORBAX Eclipse PlusC18柱4.6 × 100 mm，3.5 μm)，純水儀(Thermo)。

試劑：維生素B2標(biāo)準(zhǔn)品(上海展云化工有限公司，含量97.5%-102.0%)，維生素B2藥片(南京白敬宇制藥有限責(zé)任公司，產(chǎn)品批號：200603)。乙腈(HPLC級，美國TEDIA)，乙酸(HPLC級，美國TEDIA)。

1.2 溶液配制

(1) 儲備液配制：準(zhǔn)確稱取10.00 mg維生素B2標(biāo)準(zhǔn)品，溶于適量1%乙酸溶液(超聲避光)，轉(zhuǎn)入500 mL棕色容量瓶中，用1%乙酸溶液定容至刻度，得20 μg·mL-1的溶液。再移取此溶液2.50 mL于50 mL棕色容量瓶中，用1%乙酸溶液定容至刻度，得1 μg·mL-1的儲備液，置于陰暗處。

(2) 系列標(biāo)準(zhǔn)液配制：取4個10 mL棕色容量瓶，避光下分別移入2.00、4.00、6.00、8.00 mL儲備液，用1%乙酸溶液定容至刻度，配成0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)液。

(3) 樣品液配制：避光條件下，稱取4片維生素B2藥片總重為266.10 mg (平均每片重66.53 mg)。將維生素B2藥片置于研缽中研細(xì)，稱取約10.00 mg粉末于50 mL棕色容量瓶中，加入40 mL 1%乙酸溶液，超聲溶解，用1%乙酸溶液定容至刻度。移取此溶液2.00 mL于50 mL棕色容量瓶中，用1%乙酸溶液稀釋定容至刻度。用一次性過濾針吸取0.8 mL溶液，0.22 μm微孔過濾膜過濾至棕色樣品瓶中，得樣品液供測試用。

1.3 色譜條件

色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18柱(4.6 × 100 mm，3.5 μm)，流動相為1%乙酸溶液-乙腈(82 : 18，V/V)，流速0.8 mL·min-1；紫外檢測波長268 nm；熒光檢測激發(fā)波長274 nm、發(fā)射波長523 nm，柱溫20 °C；進(jìn)樣量10 μL；PMT-GAIN為16。

2 實驗結(jié)果和討論

2.1 激發(fā)波長和發(fā)射波長的優(yōu)化

按“1.3”中色譜條件，取濃度為0.60 μg·mL-1維生素B2標(biāo)準(zhǔn)液，做熒光發(fā)射光譜圖和激發(fā)光譜圖的試驗，進(jìn)行發(fā)射光譜曲線及激發(fā)光譜曲線測試，從圖上求得維生素B2的最大發(fā)射波長和最大激發(fā)波長：λEm= 523 nm，λEx= 274 nm。

2.2 專屬性考察

分別取空白液、標(biāo)準(zhǔn)液(c= 0.60 μg·mL-1)和樣品液，按“1.3”色譜條件，分別測定后記錄色譜圖。圖2、圖3分別為UVD、FLD的色譜圖。

圖2 紫外檢測器的色譜圖

圖3 熒光檢測器的色譜圖

由圖2和3可知，維生素B2在UVD和FLD中出峰時間分別是2.38 min和2.43 min (FLD串聯(lián)在UVD后面，故出峰時間不同)。維生素B2能被完全分離，且峰形良好，空白不干擾待測組分測定，樣品液無其他雜質(zhì)峰干擾。表明專屬性滿足方法學(xué)驗證要求。從色譜圖上可發(fā)現(xiàn)，相同濃度樣品在FLD中峰高達(dá)3500 (Y軸標(biāo)尺范圍：0-4000)；而在UVD中峰高只有8 (Y軸標(biāo)尺范圍：0-50)，說明熒光檢測器靈敏度遠(yuǎn)高于紫外檢測器。

2.3 儀器精密度考察

取濃度為0.60 μg·mL-1維生素B2標(biāo)準(zhǔn)液，按“1.3”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次。HPLC結(jié)果顯示，UVD中維生素B2保留時間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.24%，峰面積RSD為0.075%。FLD中維生素B2保留時間RSD為0.26%，峰面積RSD為0.35%。表明儀器精密度達(dá)到HPLC質(zhì)量分析方法學(xué)認(rèn)證要求。圖4中藍(lán)色為UVD色譜峰、紅色為FLD色譜峰。

圖4 五次重復(fù)進(jìn)樣的色譜圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品測定

按“1.3”色譜條件，分別測定系列標(biāo)準(zhǔn)液，以濃度(x)與對應(yīng)色譜峰峰面積(y)進(jìn)行線性擬合。由圖5可見，在濃度0.20-1.00 μg·mL-1范圍內(nèi)線性良好，回歸方程分別為y= 60.499x- 0.0744，R2= 1(UVD)；y= 38908x+ 367.26，R2= 1 (FLD)。

圖5 維生素B2的標(biāo)準(zhǔn)曲線

按“1.3”色譜條件測定樣品液，利用回歸方程計算樣品液中維生素B2的濃度，換算后得每片藥片中維生素B2含量為4.64 mg (表1)，與藥片標(biāo)示含量(5.0 mg)接近。

表1 某組學(xué)生維生素B2含量測定的結(jié)果

2.5 維生素B2穩(wěn)定性考察

取濃度為1.0 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)液2份，分別加入玻璃比色皿和石英比色皿中，置于窗臺上10、20、30 min后取樣測試(晴天，15 °C)，比較色譜峰面積的變化。發(fā)現(xiàn)樣品置于兩種比色皿中的變化無差異，維生素B2的主峰均隨時間增加而變小，而3.03 min出現(xiàn)的雜質(zhì)峰隨放置時間增加而變大。實驗證實，維生素B2溶液置于玻璃或石英比色皿中，都會發(fā)生光降解反應(yīng)，即紫外光和可見光下維生素B2都不穩(wěn)定，因此，維生素B2應(yīng)避光放置。

3 實驗安排

課堂實驗中面對的學(xué)生來自不同地區(qū)，存在化學(xué)基礎(chǔ)知識及學(xué)習(xí)能力上的差異，給教學(xué)過程帶來一定的困擾。我們采用了啟發(fā)式、問題式和討論式等以學(xué)生為中心的教學(xué)模式，使不同知識層次的學(xué)生能自主選擇時間、地點及次數(shù)進(jìn)行學(xué)習(xí)，從而提高總體教學(xué)效果[10]。在本實驗設(shè)計中，課前先將關(guān)于儀器構(gòu)造原理及操作方法的介紹等微視頻和針對性的思考題上傳至校內(nèi)網(wǎng)絡(luò)教學(xué)平臺(PC端)及“學(xué)習(xí)通”超星平臺(手機(jī)端)上供學(xué)生預(yù)習(xí)，教師通過在線答疑、逐步引導(dǎo)學(xué)生找出解決問題的思路和方法，讓學(xué)生體會到自主學(xué)習(xí)的快樂[11]。課內(nèi)操作實驗完成后，安排學(xué)生寫實驗報告時，進(jìn)行樣品光照穩(wěn)定性的互動交流，進(jìn)一步培養(yǎng)學(xué)生的科研思維和創(chuàng)新意識。

4 教學(xué)效果評價

通過三年的教學(xué)實踐(醫(yī)學(xué)檢驗本科專業(yè))，結(jié)果表明，所設(shè)計的分析方法穩(wěn)定、實驗效果突出，完全適合于儀器分析實驗教學(xué)。學(xué)生普遍認(rèn)為該實驗貼近生活，有趣味并能學(xué)到理論課上接觸不到的知識，如“通過此實驗證實了維生素B2在日光中的不穩(wěn)定性”，拓展了許多知識面。

實驗前完成思考題的過程中，學(xué)生通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料、與教師在線互動，既達(dá)到預(yù)習(xí)效果又能提升分析問題、解決問題能力。課堂教學(xué)中，由于前期學(xué)習(xí)準(zhǔn)備充分，學(xué)生能很熟練地操作儀器，獲得良好的實驗成果。我們針對3屆學(xué)生共150人發(fā)放問卷調(diào)查，結(jié)果顯示，對實驗效果的總體滿意率達(dá)91% (圖6)。其中非常滿意為27%，滿意為64%，一般為9%。

圖6 問卷調(diào)查結(jié)果

5 結(jié)語

熒光分析法因具有更高的靈敏度，因而被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)及藥物分析等領(lǐng)域中[12-14]。此實驗設(shè)計將熒光檢測器與紫外檢測器串聯(lián)應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗專業(yè)的實驗教學(xué)中，既提高了HPLC法檢測的靈敏度，又能通過比較法學(xué)習(xí)強(qiáng)化學(xué)生對知識理解力，拓展學(xué)生的思維，同時也為學(xué)生在未來工作中，能熟練操作各種分析儀器打下良好的基礎(chǔ)。

本文也為其他院校的教師推廣一個提高儀器分析實驗教學(xué)的方法。利用科研上閑置或使用率低的儀器，通過校資產(chǎn)管理處的調(diào)撥信息，將相關(guān)儀器與原有的教學(xué)儀器進(jìn)行整合，擴(kuò)大教學(xué)資源，提高教學(xué)質(zhì)量和教學(xué)效率。本文利用教研室長期閑置的熒光檢測器與原HPLC上的紫外檢測器串聯(lián)，通過選擇具有熒光的維生素B2為檢測樣品。通過這一過程，學(xué)生在不需要增加學(xué)時數(shù)和工作量的情況下，學(xué)習(xí)了二種檢測器的使用，了解了各自的性能特點。進(jìn)行比較學(xué)習(xí)更能提高學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣和理解能力。

兩種檢測器聯(lián)用在實際工作也有其優(yōu)越性，當(dāng)樣品(尤其是生物樣品)需要監(jiān)控測定的組分是多個，其中有些有紫外吸收、有些有熒光發(fā)射，通過檢測器串聯(lián)的方法，使每個組分都能得到最佳的檢測，尤其是具有熒光的低含量組分，在熒光檢測器中既可消除復(fù)雜的背景干擾，又能很好地被檢測出來，并且一步就完成，節(jié)省時間，提高效率。通過本實驗，學(xué)生可初步了解被檢測樣品特點和檢測器的選擇的關(guān)系，為其未來科研工作提供很好的幫助。

檢驗專業(yè)的醫(yī)科生，更需要具備一個理科生的素質(zhì)。動手能力，以及操作各種大型儀器檢測數(shù)據(jù)的能力對他們尤其重要。針對檢驗專業(yè)的學(xué)生，不僅實踐了串聯(lián)檢測器在HPLC中的應(yīng)用，在教學(xué)過程中也拓展了質(zhì)譜技術(shù)及液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的知識，并在課程網(wǎng)站上發(fā)布了大量相關(guān)知識及虛擬實驗。扎實的理論知識和技術(shù)上的活用是我們培養(yǎng)高素質(zhì)人才的目標(biāo)。

不同廠家生產(chǎn)的維生素B2片含量存在差異，國家藥典對其含量有一定要求，因此，設(shè)計一種準(zhǔn)確、快速的含量檢測方法具有實際意義，此實驗設(shè)計方案也可用于藥廠對其產(chǎn)品的質(zhì)量控制。