聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用于元素形態(tài)分析

唐安娜，石宜靈，杜瑾，孔德明

南開大學化學學院，分析科學研究中心，天津市生物傳感與分子識別重點實驗室，化學國家級實驗教學示范中心，天津 300071

1 元素形態(tài)分析的重要意義

一種元素在樣品中的有效性和毒性既取決于它的物理形態(tài)，也與其化學形態(tài)息息相關(guān)，除了我們生活中常常提到的濃度以外，化合價、有機態(tài)或是無機態(tài)、相態(tài)等因素也屬于元素形態(tài)的范疇。例如：三價鉻在人體葡萄糖代謝中發(fā)揮著重要的作用，而六價鉻卻具有劇毒性和致癌性；元素硒的毒性很小，亞硒酸鈉、硒酸鈉的毒性卻很大。元素形態(tài)分析是分析化學的分支之一，即識別一種或多種元素在某一樣品中的濃度、分散狀態(tài)等物理形態(tài)，或電子組態(tài)、價態(tài)、分子結(jié)構(gòu)等化學形態(tài)的過程。監(jiān)測環(huán)境中的有毒有害物質(zhì)，分析藥品中的有效成分含量和毒性大小、食品中添加劑的用量、裝修材料有毒有害物質(zhì)等，都是元素形態(tài)分析常見的應(yīng)用場景，元素形態(tài)分析對于生產(chǎn)生活具有重要的意義。

2 聯(lián)用技術(shù)在元素形態(tài)分析中的應(yīng)用

由于實際樣品往往由多種元素的不同形態(tài)組成，想要通過單獨某一種儀器實現(xiàn)目標元素的形態(tài)分析是很困難的。不同的樣品處理技術(shù)及檢測器的聯(lián)用在元素形態(tài)分析中能夠起到提高準確性、重現(xiàn)性和可操作性的作用。本文綜述了不同的聯(lián)用技術(shù)在元素形態(tài)分析中的應(yīng)用。

2.1 液相色譜聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用于元素形態(tài)分析

液相色譜是以液體為流動相的高效色譜分析方法，分析速度快，分離效率高，能與不同的分析儀器聯(lián)用進行更為高效的元素形態(tài)分析[1,2]，樣品無需進行汽化，能用于高沸點及熱不穩(wěn)定化合物的分離，適用范圍廣。

2.1.1 液相色譜與電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用

(1) 高效液相色譜與電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用

高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)與電感耦合等離子體質(zhì)譜(Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry，ICP-MS)聯(lián)用(HPLC-ICP-MS)是元素形態(tài)分析研究中應(yīng)用最廣泛的聯(lián)用技術(shù)，關(guān)于As、Hg、Se、Sn等元素的形態(tài)分析研究均有報道。ICP-MS靈敏度高，檢出限低，分析速度快，與HPLC聯(lián)用可實現(xiàn)復雜樣品的分離檢測。

Chen等開發(fā)了一種基于HPLC-ICP-MS的方法[3]，用于分析魚類中的As(III)、As(V)、單甲基胂酸(MMA)、二甲基胂酸(DMA)、砷乙烷(AsB)和Hg(II)、甲基汞(MeHg)。硒酸根Se(VI)、亞硒酸根Se(IV)、硒代胱氨酸(SeCyS)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCyS)、硒脲(SeUr)、硒代蛋氨酸(SeMet)、硒代乙硫氨酸(SeEt)，是常見的硒存在形態(tài)，HPLC-ICP-MS是分析硒形態(tài)重要而有效的技術(shù)手段之一[4]，用于水體、果蔬、中藥等樣品中硒元素形態(tài)的檢測。

Grotti等人引入了窄孔徑色譜柱，并采用死體積很小的接口與之結(jié)合，有效降低了基質(zhì)負荷和峰分散度，同時也能最大限度地減少樣品量和溶劑消耗，提高檢測分辨率和靈敏度。窄孔徑HPLC柱與ICP-MS相結(jié)合，能夠獲得更低的檢測限，實現(xiàn)更快的分離[5]。

(2) 離子色譜與ICP-MS聯(lián)用

離子色譜(Ion Chromatography，IC)是高效液相色譜的一種形式，是分析陰離子和陽離子及小分子極性化合物的一種液相色譜方法，比起普通的液相色譜法，離子色譜引入抑制系統(tǒng)，解決了背景信號干擾，具有分離效果好、靈敏度高和快速方便等優(yōu)點，是對廣泛使用的液相色譜的有益補充。

離子色譜用于金屬陽離子的形態(tài)分析研究較為成熟，涉及鉈(Tl)、釩(V)、鉻(Cr)等多種元素，適用于無機陽離子和有機絡(luò)合物的分離。強陰離子交換色譜與ICP-MS聯(lián)用(IC-ICP-MS)可以用于硒代乙嘌呤、硒(VI)、硒(IV)、二甲基硒化物和二甲基二硒化物的分離與定量分析，對于無機和有機分子均適用[6]。

(3) 尺寸排阻色譜與ICP-MS聯(lián)用

魚類消費是人類接觸汞的主要途徑之一。食物中汞的現(xiàn)有形式，尤其是與蛋白質(zhì)結(jié)合的汞，可能會影響人體對汞的吸收，進而影響其潛在的毒性作用。Nong等使用基于金屬組學和蛋白質(zhì)組學的技術(shù)分析了從七個不同地區(qū)和國家采集的鮭魚和金槍魚肌肉。尺寸排阻色譜(Size Exclusion Chromatography，SEC)與ICP-MS聯(lián)用(SEC-ICP-MS)表明，β-肌動蛋白是一種來自魚肌肉的新型汞結(jié)合蛋白，該蛋白還可以結(jié)合鉍(Bi)、銀(Ag)和銅(Cu)。蛋白質(zhì)是食用魚中主要的汞積累位點，因此，在胃腸道消化后，增加了人體對汞的暴露[7]。

2.1.2 液相色譜與等離子體發(fā)射光譜聯(lián)用

等離子體發(fā)射光譜(Plasma Optical Emission Spectrometry，Plasma-OES)具有靈敏度高、檢出限低、線性范圍寬、測試速度快、應(yīng)用范圍廣及可同時進行多元素測定的特點。液相色譜與等離子體發(fā)射光譜聯(lián)用，已廣泛應(yīng)用于元素形態(tài)分析的研究中[8-10]。

(1) HPLC-MIP-OES。國際上用于鐵元素的形態(tài)分析報道較少。2021年P(guān)roch等將微波誘導等離子體發(fā)射光譜法(Microwave Induced Plasma-OES，MIP-OES)用于鐵形態(tài)分析，采用HPLC與氮等離子體聯(lián)用技術(shù)，可在單次分析的300 s內(nèi)同時測定Fe(II)和Fe(III)。HPLC-MIP-OES使用氮氣發(fā)生器來供應(yīng)氣體，消耗量低，單次分析便宜[8]。

(2) IC-ICP-OESIC-ICP-OES聯(lián)用技術(shù)已用于Se、Cr等元素的形態(tài)分析中[9,10]。沉積物中硒的形態(tài)分析，以正辛烷磺酸鈉鹽為離子對調(diào)節(jié)劑，在BIO Wide Pore RP-C18色譜柱上，實現(xiàn)了亞硒酸鹽、硒酸鹽、硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸、硒代酚胺和二甲基二硒化物的分離，ICP-OES與色譜系統(tǒng)耦合后用于硒元素的在線檢測[7]。

2.1.3 液相色譜與原子熒光聯(lián)用

原子熒光(Atomic Fluorescence Spectrometry，AFS)是目前常用的痕量元素檢測技術(shù)之一，具有維護和操作費用低，能提供與ICP-MS相近的靈敏度，且易于操作等優(yōu)點。色譜-氫化物發(fā)生(HG)-原子熒光光譜聯(lián)用技術(shù)是目前檢測分析硒形態(tài)的最重要且有效的技術(shù)手段之一。在測定水中的烷基汞的研究中，將紫外光照射、氫化物發(fā)生/原子蒸發(fā)與高效液相色譜和原子熒光光譜法聯(lián)用(HPLC-UVCV/HG-AFS)，建立了一種簡便快捷、靈敏度高、選擇性好的天然水中烷基汞的分析方法[11,12]。利用高效液相色譜-雙通道原子熒光聯(lián)用同時進行砷和硒形態(tài)分析，在12 min內(nèi)同時分離了三價砷(As(III))、一甲基砷(MMA)、二甲基砷(DMA)、五價砷(As(V))、硒代胱氨酸(SeCys)、硒代蛋氨酸(SeMet)和四價硒(Se(IV))等化合物。實驗結(jié)果表明，該方法可用于尿樣及藥品中砷和硒形態(tài)的分析[13]。

2.1.4 液相色譜與原子吸收光譜聯(lián)用

原子吸收光譜(Atomic Absorption Spectrometry，AAS)法是測定痕量和超痕量元素的有效方法之一，由于其儀器結(jié)構(gòu)簡單、操作簡便、易于掌握、價格便宜、分析速度快、耗費低、選擇性好、精密度高等優(yōu)點，在冶金、地質(zhì)、化工、醫(yī)藥、刑偵和食品衛(wèi)生等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。Linhart等開發(fā)了一種紫外光化學發(fā)生器，能夠?qū)⒂袡C和無機汞柱后在線轉(zhuǎn)化為冷蒸氣(Hg0)，隨后通過石英管原子吸收光譜法進行檢測。采用反相高效液相色譜分離后成功檢測到汞(II)、甲基汞、乙基汞和苯基汞[14]。

2.2 氣相色譜聯(lián)用技術(shù)

2.2.1 氣相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用

氣相色譜(Gas Chromatography，GC)-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用(GC-ICP-MS)分離效果好，分析速度快，靈敏度高。與液相色譜聯(lián)用技術(shù)相比，GC-ICP-MS無需霧化器，不會增加等離子體本底信號，樣品損耗率極低，常用于氣體和低沸點化合物的分離分析，難揮發(fā)性物質(zhì)的分析需要經(jīng)過處理使其揮發(fā)度增大。GC-ICP-MS可將復雜樣品中的易揮發(fā)性待測元素提取出來，多用于汞、溴元素的形態(tài)分析[15,16]。

分析無機汞、測量汞的總濃度及有機汞的濃度時，常用到GC-ICP-MS分析方法。同樣的方法也應(yīng)用在錫物種的檢測中[16]，經(jīng)過微波消解和衍生化處理，能夠在高有機含量的垃圾滲透液中分離出甲基化、乙基化和丁基化錫化合物。

2.2.2 氣相色譜-原子熒光聯(lián)用

GC分離的樣品以氣體狀態(tài)流出，可不經(jīng)處理直接進入AFS儀器中，實現(xiàn)高效快速檢測，在有機汞、有機鉛、有機錫、有機硒的分離檢測中均有應(yīng)用。

近幾年關(guān)于有機汞的GC-AFS分析研究較多。有機汞最主要的形態(tài)有兩種：甲基汞和乙基汞(其中甲基汞的排放對生物的危害大)，兩者均不易揮發(fā)，大部分GC-AFS分離檢測有機汞的方法是先將甲基汞和乙基汞通過水相衍生化，但因其衍生物很難直接被AFS儀原子化，文獻中多采用在GC和AFS的儀器連接管路之間額外添加高溫裂解加熱裝置，在高溫下甲基汞和乙基汞的衍生化產(chǎn)物被裂解生成氣態(tài)汞原子，從而被檢測。GC-AFS已用于測定海水中甲基汞[17]及生物樣品中的甲基汞、乙基汞[18]等。

與有機汞不同，GC-AFS在有機硒化合物的檢測中，可直接通過氬氫火焰作光源的GC-AFS儀器，無需在兩個儀器中添加額外的裝置。已有研究構(gòu)建了用于二甲基硒化物和二甲基二硒化物的形態(tài)分析以及四甲基錫和四乙基鉛的雙通道同時測定的GC-AFS系統(tǒng)，實現(xiàn)了高效便捷的有機硒元素檢測[19]。

2.2.3 GC-ICP-OES

已開發(fā)了固相微萃取GC-ICP-OES相結(jié)合的方法，用于沉積物和水樣中丁基錫和苯基錫化合物的形態(tài)分析，并通過分析參考沉積物和廢水樣品來驗證該技術(shù)的可靠性[20]。

2.3 毛細管電泳聯(lián)用技術(shù)

毛細管電泳(Capillary Electrophoresis，CE)是以毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅(qū)動力的新型液相分離技術(shù)。CE分離用的電解質(zhì)、緩沖液及其操作pH正好在許多元素形態(tài)的穩(wěn)定范圍內(nèi)，是分離過程中能夠保持原有化學信息的一種難得的分離技術(shù)。此外CE還有分離效率高、分析速度快、樣品適應(yīng)面寬、試劑和樣品消耗量少、重復性好、分離模式多等優(yōu)點。CE在生命科學、生物技術(shù)、臨床醫(yī)學、藥物分析和環(huán)境科學等領(lǐng)域顯示了極其重要的應(yīng)用前景。CE用于元素形態(tài)分析也引起人們的關(guān)注。

2.3.1 CE-ICP-MS

將CE與ICP-MS聯(lián)用，能夠準確識別同種元素的不同形態(tài)具體的存在形式，也能夠精確定量，具有通用性好、分析時間短、分離效率高且分析成本低的特點。CE-ICP-MS能夠提供待測物完整的形態(tài)信息，適用于痕量元素檢測，因此，能將其用于研究蛋白質(zhì)與金屬的相互作用，探究不同金屬與蛋白質(zhì)之間的組合[21]。Shuai等開發(fā)了一種CE-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)，在優(yōu)化的分離條件下，基線分離并測定了六種砷物種，包括亞砷酸鹽、砷酸鹽，單甲基胂酸，二甲基胂甲酸，砷乙烷和砷膽堿。該方法與密閉容器微波輔助萃取法相結(jié)合，成功地用于龍葵樣品中砷的測定[22]。

2.3.2 CE-AAS

氫化物發(fā)生與原子吸收光譜聯(lián)用技術(shù)可擴展AAS對氫化物形成元素的檢測能力，幾乎消除了基體干擾，開辟了解決復雜基體樣品分析新途徑。開發(fā)了一種毛細管電泳、冷蒸氣發(fā)生(CVG)與電熱石英管爐原子吸收光譜(EQTF-AAS)在線耦合系統(tǒng)，用于干金魚肌肉中無機汞和甲基汞的形態(tài)分析[23]。

2.3.3 CE-AFS

基于AFS檢測器的優(yōu)點[24]，Yan等通過CE-AFS在線聯(lián)用，建立了一種測定無機汞、甲基汞、乙基汞EtHg和苯基汞PhHg的半胱氨酸復合物的方法。所開發(fā)的技術(shù)已成功應(yīng)用于標準物質(zhì)(DORM-2，狗魚肌肉)中汞的形態(tài)分析[25]。

2.3.4 CE-ICP-OES

CE-ICP-OES聯(lián)用技術(shù)結(jié)合了CE分離效率高和ICP-OES選擇性好、檢出限低及線性范圍寬等優(yōu)點，為復雜樣品的元素形態(tài)分析提供了一種有力的分析手段[26,27]。通過CE-ICP-OES在線耦合，開發(fā)了一種大鼠血漿中鎂物種形態(tài)分析和游離鎂濃度定量方法[27]。

2.4 微芯片毛細管電泳聯(lián)用技術(shù)

使用電泳作為分離機制的微細加工分析系統(tǒng)可以大大減少分離時間并簡化儀器設(shè)計。在微流體CE系統(tǒng)中，分離通道被蝕刻到固體基質(zhì)中，從而取代了傳統(tǒng)CE中使用的毛細管。通道可以用非常小的直徑蝕刻，更重要的是，通道的壁比毛細管厚得多，這可以實現(xiàn)更有效的熱分散。此外，即使需要溫度控制，實際上從微芯片中分散熱量也比從毛細管中分散熱量要容易得多。微芯片技術(shù)的另一個優(yōu)點是，預蝕刻通道網(wǎng)絡(luò)可用于提供多個流，省略管連接器，從而減少死體積。具有分辨率高、分析快速、樣品試劑消耗低，污染少、體積小、自動化、集成化程度高等優(yōu)點，是一種很有吸引力的形態(tài)分離技術(shù)。

微芯片毛細管電泳(Chip-CE)和元素選擇性檢測器聯(lián)用，具有選擇性好、靈敏度高的特點，AFS十分適合用作Chip-CE形態(tài)分析時的柱后檢測器[28]。Li等采用在線聯(lián)用微芯片毛細管電泳與氫化物發(fā)生原子熒光光譜(HG-AFS)建立了無機砷形態(tài)分析方法[29]。

2.5 流動注射聯(lián)用技術(shù)

流動注射(Flow Injection，F(xiàn)I)在線預富集分離技術(shù)可有效克服手工和間歇式預富集分離操作的缺點。FI與原子光譜的聯(lián)用是實現(xiàn)復雜樣品中超痕量元素全自動測定的行之有效的方法。

2015年Escudero等提出了一種利用FI-HG-ICP-OES對水樣、能量飲料、葡萄酒和茶葉中無機硒進行在線預富集方法。提取和預濃縮步驟使用聚氯乙烯(PVC)柱進行，Se形態(tài)是通過用紫外燈選擇性光還原來實現(xiàn)的。采用兩級分數(shù)階乘設(shè)計，評估實驗變量，包括緩沖液、樣品及洗脫液的流速和濃度等[30]。

3 存在的問題及解決辦法

聯(lián)用技術(shù)用于元素形態(tài)分析已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用(表1)，但仍存在一定局限性，對于固體樣品需要采用提取步驟，復雜的樣品前處理過程可能導致元素形態(tài)發(fā)生變化。開發(fā)簡便、快速、自動化的樣品前處理技術(shù)是解決這個問題的關(guān)鍵，如采用流動注射在線樣品前處理技術(shù)、QuEChERS (Quick,Easy, Cheap, Effective, Rugger, Safe)技術(shù)[31]等。開發(fā)新穎的樣品前處理材料，如：功能化硅基質(zhì)納米材料、COFs (Covalent Organic Frameworks)/MOFs (Metal Organic Frameworks)材料、分子印跡材料等，以提高材料的選擇性和吸附效率。聯(lián)用技術(shù)還受接口問題影響，采用窄孔徑色譜柱，并采用死體積很小的接口與之結(jié)合，有效降低了基質(zhì)負荷和峰分散度，同時也能最大限度地減少樣品量和溶劑消耗，提高檢測分辨率和靈敏度，實現(xiàn)更快的分離。

表1 聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用于元素形態(tài)分析

4 聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用于實驗教學

為了使理論學習和實踐相結(jié)合，我們開發(fā)了聯(lián)用技術(shù)用于元素形態(tài)分析的實驗。實驗一：流動注射編結(jié)反應(yīng)器(KR)在線吸附-火焰原子吸收光譜(FAAS)聯(lián)用技術(shù)測定痕量鉛離子。KR通常是由疏水性材料如聚四氟乙烯(PTFE)等微管編結(jié)而成，分析物與反應(yīng)試劑所形成的中性配合物是通過分子吸附而被富集于KR內(nèi)壁上。操作程序基本上分為兩步：第一步為分析物與配位劑在線形成中性配位化合物，并吸附在KR內(nèi)壁上；第二步為被吸附在KR內(nèi)壁上的分析物洗脫后，采用FAAS在線檢測。實驗二：流動注射微柱在線置換吸附-電熱原子吸收光譜聯(lián)用技術(shù)測定痕量鈀。本實驗使用普通的配位劑吡咯烷二硫代甲酸銨(APDC)和簡單易得的吸附劑(香煙過濾嘴纖維)，首先將Cu與APDC形成的絡(luò)合物預涂覆在填充纖維表面，由于Pd-PDC的穩(wěn)定性比Cu-PDC高，Pd(II)通過與Cu-PDC發(fā)生置換反應(yīng)富集在纖維表面，基體中的那些與APDC絡(luò)合穩(wěn)定性比Cu低的共存金屬離子，由于不能與Cu-PDC進行置換反應(yīng)，不會干擾Pd的測定，從而可對Pd進行選擇性的測定。通過實驗，學生能更深入地理解和掌握聯(lián)用技術(shù)在形態(tài)分析中的應(yīng)用。

5 總結(jié)和展望

聯(lián)用技術(shù)結(jié)合了各種分離技術(shù)和檢測方式的優(yōu)勢，本文通過對各種用于元素形態(tài)分析的聯(lián)用技術(shù)的總結(jié)和比較，了解其適用范圍、對樣品的要求及目前存在的問題，并展望發(fā)展前景。元素形態(tài)分析中的聯(lián)用技術(shù)，可用于關(guān)乎人類生命健康的環(huán)境污染治理、食品安全、疾病診療等領(lǐng)域，具有重要的研究意義。在對知識總結(jié)的基礎(chǔ)上，開發(fā)設(shè)計教學實驗，理論與實踐相結(jié)合，加深學生對知識的理解、掌握和運用。