甘蔗核心種質(zhì)花葉病和宿根矮化病自然抗病性調(diào)查與分子檢測

王曉燕,馬永德,單紅麗,李 婕,張榮躍,李銀煳,李文鳳,黃應(yīng)昆

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所,云南開遠(yuǎn) 661699;2.耿馬縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,云南耿馬 677500)

0 引言

蔗糖產(chǎn)業(yè)是我國區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要支柱和邊疆少數(shù)民族地區(qū)農(nóng)民增收、地方財(cái)政增長的主要來源[1]。而甘蔗病害是制約蔗糖產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的重要因素之一,其中甘蔗花葉病和宿根矮化病(ratoon stuning disease,RSD)是重要的種傳甘蔗病害,對甘蔗產(chǎn)量和品質(zhì)影響極大[2-3]。

甘蔗花葉病是一種重要的世界性種傳病害,1892年Musschenbrock在爪哇首次記述了該病,之后在世界各大蔗區(qū)普遍發(fā)生,目前已成為我國蔗區(qū)發(fā)生最普遍,危害最嚴(yán)重的病害之一[3-4]。自然條件下,甘蔗花葉病由馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)的甘蔗花葉病毒(Sugarcanemosaicvirus,SCMV)、高粱花葉病毒(Sorghummosaicvirus,SrMV)、甘蔗線條花葉病毒(Sugarcanestreakmosaicvirus,SCSMV)等引起。目前,我國蔗區(qū)已確定的甘蔗花葉病病原主要有SCSMV、SrMV和SCMV 3種,且在各植蔗省區(qū)均有發(fā)生[5-7]。其中云南蔗區(qū)以SCSMV為主,嚴(yán)重時(shí)檢出率高達(dá)100%[8];福建、四川、廣西、貴州、海南和廣東等蔗區(qū)以SrMV為主,檢出率分別為84.8%、74.6%、65.3%、65.3%、58.8%和55.6%;浙江蔗區(qū)以SCMV為主,檢出率為65.3%[9]。甘蔗宿根矮化病(RSD)是由棒桿菌屬細(xì)菌(Leifsoniaxylisubsp.xyli, Lxx)寄生于蔗株維管束中引起的一種世界性種傳病害,自1944年在澳大利亞昆士蘭首次發(fā)現(xiàn)以來[10],已有美國、南非、毛里求斯、印度、巴西、中國等多個(gè)國家和地區(qū)報(bào)道了該病的發(fā)生,現(xiàn)已遍布世界各蔗區(qū)[11-15]。RSD在我國蔗區(qū)普遍發(fā)生,2009—2012年LI等[16]采用PCR檢測對云南、廣西21個(gè)甘蔗主產(chǎn)區(qū)進(jìn)行抽查,RSD檢出率為74.7%。2013—2014年韋金菊等[17]對廣西9個(gè)主產(chǎn)蔗區(qū)進(jìn)行RSD發(fā)生情況調(diào)查,RSD檢出率為71.22%。2017年沈林波等[18]對廣西、云南、廣東和海南等省12個(gè)代表性蔗區(qū)進(jìn)行抽查,12個(gè)蔗區(qū)均能檢測到RSD,全國平均檢出率為16.56%。

培育和推廣抗病品種是防控甘蔗花葉病和RSD最為經(jīng)濟(jì)有效的措施,而抗病種質(zhì)資源的發(fā)掘利用是抗病育種的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。我國國家甘蔗種質(zhì)資源圃保存有3 000多份珍貴種質(zhì)資源,但這些種質(zhì)資源的甘蔗花葉病和RSD發(fā)生情況及自然抗病性不清,其病原缺乏分子水平的系統(tǒng)檢測鑒定。為此,本研究開展了105份甘蔗核心種質(zhì)資源花葉病和RSD田間自然發(fā)病調(diào)查及抗性評價(jià),并采樣對其病原進(jìn)行分子檢測鑒定,以期為有效開展甘蔗抗花葉病和RSD育種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

國家甘蔗種質(zhì)資源圃(National Germplasm Repository of Sugarcane),國家科技資源共享服務(wù)平臺-作物種質(zhì)資源庫(National Infrastructure for Crop Germplasm Resources)保存的甘蔗核心種質(zhì)資源105份。

1.2 病害調(diào)查與樣品采集

于2021年7月甘蔗花葉病發(fā)生穩(wěn)定期,通過目測蔗株葉片癥狀對國家甘蔗種質(zhì)資源圃保存的105份核心種質(zhì)進(jìn)行甘蔗花葉病田間自然發(fā)病率調(diào)查。每份核心種質(zhì)順序調(diào)查100株,記錄調(diào)查總株數(shù)和花葉病發(fā)病株數(shù),計(jì)算病株率。參照文獻(xiàn)[19]和文獻(xiàn)[20]中的標(biāo)準(zhǔn)按1～5級分級進(jìn)行抗性水平分類。結(jié)合花葉病調(diào)查每份核心種質(zhì)采集病株葉片樣品各1份,用于檢測SCSMV、SrMV、SCMV 3種花葉病病毒。

自然發(fā)病株率=(病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù))×100%

于2021年12月甘蔗成熟期,每份核心種質(zhì)隨機(jī)取6株,每株截取中下部莖節(jié)各1節(jié),每節(jié)切成約7 cm長,縱向“十字”剖為4份,再用鉗子擠壓蔗莖,共取約25 mL的蔗汁于50 mL離心管內(nèi)混勻,樣品放于冰箱中,于-20 ℃保存用于檢測RSD。每取1個(gè)樣品后,取樣工具先用清水沖洗,再用75%酒精進(jìn)行消毒。

1.3 花葉病病毒檢測

參照蔣軍喜等[21]和李文鳳等[22]方法對各核心種質(zhì)病株葉片樣品進(jìn)行SCSMV、SrMV、SCMV 3種花葉病病毒檢測。檢測方法為:各核心種質(zhì)病株樣品稱取葉片0.2 g,采用北京全式金生物技術(shù)有限公司的TransZolPlant試劑盒提取甘蔗葉片總RNA,具體步驟按照說明書操作。以提取的甘蔗葉片總RNA為模板,用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA synthesis SuperMix 試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)并按其說明合成cDNA第一鏈。分別用SCSMV、SrMV和SCMV病毒特異性引物(表1)對反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。SCSMV的PCR反應(yīng)條件為:20 μL PCR擴(kuò)增體系中含ddH2O 9.6 μL、2×Easy Taq PCR SuperMix (北京全式金生物技術(shù)有限公司) 8.0 μL,cDNA模板2 μL,上下游引物各0.2 μL(20 μg/μL);PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。SCMV和SrMV的PCR反應(yīng)條件為:20 μL PCR擴(kuò)增體系中含ddH2O 7.2 μL、2×Easy Taq PCR SuperMix (北京全式金生物技術(shù)有限公司) 10 μL,cDNA模板2 μL,上下游引物各0.4 μL(20 μg/μL);PCR擴(kuò)增程序都為:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。病原檢測陽性對照為經(jīng)檢測鑒定是SCSMV、SrMV和SCMV的植株基因組RNA,陰性對照為莖尖組織脫毒健康植株基因組RNA,空白對照為滅菌雙蒸水。

表1 甘蔗花葉病病原檢測所用引物Table 1 Primers used to detect the pathogens of sugarcane mosaic disease

1.4 RSD檢測

參照LI等[16]和張榮躍等[15]的方法對每份核心種質(zhì)采集的蔗汁樣品進(jìn)行RSD檢測。檢測方法為:各樣品取4 mL蔗汁,采用北京全式金生物技術(shù)公司的Easy Pure plant Genomic DNA Kit植物DNA提取試劑盒提取蔗汁總DNA,具體步驟按照說明書操作。以提取的蔗汁總DNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系含ddH2O 8.6 μL,2×Easy Taq PCR SuperMix (北京全式金生物技術(shù)有限公司) 8 μL,DNA模板3 μL,上下游引物(Lxxl:5′-CCGAAGTGAGCAGATTGACC-3′;Lxx2:5′-ACCCTGTGTTGTTTTCAACG-3′)各0.2 μL(20 μg/μL);擴(kuò)增程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸5 min。預(yù)期擴(kuò)增片段大小為438 bp。RSD陽性對照為經(jīng)檢測鑒定為Lxx的病株蔗汁總DNA,陰性對照為本所脫毒無菌蔗株,空白對照為滅菌去離子水。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗花葉病調(diào)查及SCSMV、SrMV、SCMV病毒檢測結(jié)果

105份甘蔗核心種質(zhì)中,1級高抗到3級中抗的有75份,占71.4%。其中,‘贛蔗75-65’‘桂糖69-349’‘桂糖71-67’‘云輻86-13’‘川寧85-78’‘川糖57-416’‘福農(nóng)91-3623’‘粵農(nóng)86-295’‘粵農(nóng)88-162’‘崖城71-255’‘崖城80-139’‘臺糖134’‘臺糖173’‘新臺糖8號’‘C92-52’‘POJ2878’‘RB72-454’‘Phil72-446’‘FR96-405’‘CP94-1100’‘L116’等21份核心種質(zhì)表現(xiàn)1級高抗,占20.0%;‘桂糖11號’‘云蔗87-58’‘福91-4710’‘福農(nóng)90-6652’‘閩糖69-421’‘閩糖86-2121’‘閩糖92-649’‘崖城84-125’‘崖城84-37’‘臺糖1108’‘臺糖160’‘臺糖172’‘M438-59’‘PR77-3042’‘MY5770’‘Co740’‘RB83-5054’‘Vmc95-09’‘Q170’‘Q200’‘FR97-33’‘FR97-82’‘FR93-344’‘FR93-803’‘FR94-87’‘CP67-412’‘CP89-2377’等27份核心種質(zhì)表現(xiàn)2級抗病,占25.7%;27份核心種質(zhì)表現(xiàn)3級中抗,占25.7%(表2)。

表2 甘蔗核心種質(zhì)花葉病調(diào)查及自然抗病性Table 2 Occurrence investigation and natural resistance of sugarcane core germplasm in mosaic disease

從圖1可以看出,105份核心種質(zhì)樣品檢測出SCSMV、SrMV兩種病毒,所有樣品均未檢測出SCMV病毒。其中,38份核心種質(zhì)受SCSMV單獨(dú)侵染檢測出SCSMV,檢出率為36.2%;15份核心種質(zhì)受SrMV單獨(dú)侵染檢測出SrMV,檢出率為14.3%;20份核心種質(zhì)受SCSMV和SrMV復(fù)合侵染檢測出SCSMV和SrMV,檢出率為19.0%(圖1)。綜合分析結(jié)果顯示,‘贛蔗75-65’‘桂糖69-349’‘桂糖71-67’‘云輻86-13’‘川寧85-78’‘川糖57-416’‘福農(nóng)91-3623’‘粵農(nóng)86-295’‘粵農(nóng)88-162’‘崖城71-255’‘崖城80-139’‘臺糖134’‘臺糖173’‘新臺糖8號’‘C92-52’‘POJ2878’‘RB72-454’‘Phil72-446’‘FR96-405’‘CP94-1100’‘L116’21份核心種質(zhì)對SCSMV和SrMV兩種病毒均表現(xiàn)為高抗,占20.0%;‘桂糖11號’‘云蔗87-58’‘福91-4710’‘福農(nóng)90-6652’‘閩糖69-421’‘閩糖86-2121’‘閩糖92-649’‘崖城84-125’‘崖城84-37’‘臺糖1108’‘臺糖160’‘臺糖172’‘M438-59’‘PR77-3042’‘MY5770’‘Co740’‘RB83-5054’‘Vmc95-09’‘Q170’‘Q200’‘FR97-33’‘FR97-82’‘FR93-344’‘FR93-803’‘FR94-87’‘CP67-412’‘CP89-2377’27份核心種質(zhì)雙抗SCSMV和SrMV兩種病毒,占25.7%。

圖1 105份甘蔗核心種質(zhì)花葉病病原檢測韋恩圖Fig.1 Venn diagram for pathogen detection of mosaic disease in 105 sugarcane core germplasms

2.2 RSD檢測結(jié)果

PCR檢測結(jié)果表明,105份甘蔗核心種質(zhì)中88份感RSD呈陽性,陽性檢出率為83.8%;17份未感RSD呈陰性,占總檢測數(shù)的16.2%(圖2)?？梢?自然條件下,甘蔗核心種質(zhì)易感RSD,比例偏高;而抗RSD甘蔗核心種質(zhì)極少,抗性水平偏低。

圖2 105份甘蔗核心種質(zhì)RSD檢測結(jié)果Fig.2 RSD detection results of 105 sugarcane core germplasms

3 結(jié)論與討論

甘蔗種質(zhì)資源是現(xiàn)代甘蔗育種中抗病基因的重要來源,抗病種質(zhì)資源的發(fā)掘利用是抗病育種的基礎(chǔ)和關(guān)鍵,篩選抗病種質(zhì)、拓寬抗病遺傳基礎(chǔ)對選育抗病品種具有重要意義。本研究對國家甘蔗種質(zhì)資源圃保存的105份甘蔗核心種質(zhì)進(jìn)行花葉病和宿根矮化病田間自然發(fā)病調(diào)查及其病原檢測與抗性評價(jià),分析明確了各核心種質(zhì)對甘蔗花葉病和RSD的自然抗病性,檢測確認(rèn)核心種質(zhì)受SCSMV、SrMV兩種病毒單獨(dú)或復(fù)合侵染,綜合評價(jià)篩選出雙抗SCSMV和SrMV的核心種質(zhì)48份、抗RSD的核心種質(zhì)17份、多抗SCSMV、SrMV和RSD的核心種質(zhì)11份,為深入開展甘蔗抗花葉病和RSD育種提供了豐富的抗病基因源和參考依據(jù)。

分子檢測結(jié)果顯示,105份核心種質(zhì)樣品檢測到SCSMV、SrMV 2種病毒,所有樣品均未檢測出SCMV病毒;38份核心種質(zhì)受SCSMV單獨(dú)侵染,檢出率為36.2%;15份核心種質(zhì)受SrMV單獨(dú)侵染,檢出率為14.3%;20份核心種質(zhì)受SCSMV和SrMV復(fù)合侵染,檢出率為19.0%,由此表明SCSMV是云南蔗區(qū)花葉病主要病原,這與WANG等[8]和李銀煳等[23]的研究結(jié)果一致。而其他學(xué)者研究認(rèn)為,云南蔗區(qū)以SrMV為花葉病主要病原,檢出率為95.0%;SCSMV次之為56.8%[9],這可能與采樣地域、氣候或種苗調(diào)運(yùn)、品種輪換、病毒相互競爭、農(nóng)事操作等有關(guān)。關(guān)于SCSMV和SrMV的田間消長動態(tài)還需進(jìn)一步研究。

為摸清我國不同蔗區(qū)RSD發(fā)生情況和自然抗病性,2009—2017年,張榮躍等[15]、LI等[16]、韋金菊等[17]和沈林波等[18]對云南、廣西不同蔗區(qū)不同主栽品種的RSD發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查,確認(rèn)RSD在各蔗區(qū)普遍發(fā)生,陽性檢出率分別為59.54%、74.7%、71.22%和16.56%。本研究105份甘蔗核心種質(zhì)的RSD陽性檢出率為83.8%,顯著高于以上學(xué)者的研究結(jié)果,可見,甘蔗核心種質(zhì)易感RSD,比例偏高;而抗RSD甘蔗核心種質(zhì)極少,抗性水平偏低。

生產(chǎn)上甘蔗花葉病和RSD的防控措施多樣,其中選育和種植抗病品種是最為經(jīng)濟(jì)有效的措施,鑒于SCSMV已成為甘蔗花葉病主要病原[8,23],RSD發(fā)生嚴(yán)重[15-16],今后應(yīng)加強(qiáng)多抗SCSMV、SrMV和RSD甘蔗新品種選育。而本研究篩選的多抗SCSMV、SrMV和RSD的核心種質(zhì),可作為珍貴抗病基因源,與常用育種親本雜交,選育抗花葉病和RSD甘蔗新品種,供生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。其次,作為防治RSD的主要措施,生產(chǎn)和種植健康種苗已在巴西、古巴、澳大 利亞等國應(yīng)用多年。甘蔗健康種苗的生產(chǎn)主要有溫水脫毒和組培脫毒兩種方法。盧文潔等[24]研究表明溫水脫毒對甘蔗有明顯的增產(chǎn)增糖效果,新植公頃增產(chǎn)最高49 830 kg,1年宿根公頃增產(chǎn)最高達(dá)29 895 kg,2年宿根公頃增產(chǎn)最高達(dá)23 656 kg,蔗糖分提高0.35%～0.86%,宿根年限延長2～3年。組培脫毒既可去除RSD病菌又可脫去甘蔗病毒獲得健康種苗,如2020年González-Arnao等[25]采用冷凍滲透療法和組織培養(yǎng),除去病蔗體內(nèi)SCMV獲得無毒苗。建議在我國各蔗區(qū)建立甘蔗專用健康種苗圃,將其作為防治甘蔗病害和增產(chǎn)增糖的手段,以提供脫毒健康種苗在生產(chǎn)上大面積推廣應(yīng)用,促進(jìn)甘蔗產(chǎn)業(yè)健康、可持續(xù)高質(zhì)量發(fā)展。