紅甜菜和糖甜菜塊根中萜類代謝物的比較分析

趙雯雯,劉乃新,梁文召,韓廣源

(1.黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院,哈爾濱 150080;2.哈爾濱海關(guān)技術(shù)中心, 哈爾濱 150023)

0 引言

甜菜體內(nèi)含有豐富的營養(yǎng)成分,包含鉀、鎂、鐵等微量元素,以及甜菜果膠、皂苷、甜菜堿、黃酮、萜類[1]等物質(zhì)。同時(shí),甜菜具有很好的藥用價(jià)值,具有抑菌、抗炎癥[2]、抗腫瘤[3]、抗心律失常、抗人類致病原體和植物致病原體,緩解疲勞、抑制脂質(zhì)氧化、清除氧自由基等[4]生物學(xué)功能。

萜類也稱萜烯,是一類由2個(gè)以上異戊二烯單位構(gòu)成,頭尾連接或尾尾連接的化合物,是植物次生代謝產(chǎn)物的重要組成部分。萜類種類豐富,是天然產(chǎn)物的最大家族,屬于不含脂肪酸的不可皂化脂,很多具有重要生理活性。到目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了95 000多種結(jié)構(gòu)不同的萜類化合物。萜類具備抗炎[5]、抗菌[6]、防治關(guān)節(jié)炎[7]、增強(qiáng)抗氧化能力[8]、治療胰島素抵抗和2型糖尿病[9]、抗腫瘤[10]、體外和體內(nèi)抗錐蟲[11]等特性。此外,對于植物來說,萜類化合物常常在植物中作為防御機(jī)制,保護(hù)植物免受紫外線輻射、寄生蟲、真菌、細(xì)菌和病毒等有害因素的侵害,能響應(yīng)多種生物脅迫和非生物脅迫,萜類物質(zhì)不僅可以作為防御物質(zhì),還可以協(xié)同有益微生物促進(jìn)植物的生長與發(fā)育。因此無論從甜菜根中萜類成分的生物活性價(jià)值還是從甜菜抗逆性方面,研究甜菜根中萜類成分都具有一定的實(shí)際意義。

目前,紅甜菜和糖甜菜根中的萜類成分的比較研究在我國尚未有報(bào)道。本研究采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry,UPLC-MS)技術(shù),結(jié)合代謝組學(xué)分析方法[12],以紅甜菜和糖甜菜根為研究材料,分析萜類化合物的種類和含量差異。為進(jìn)一步開發(fā)具有萜類活性成分的甜菜種質(zhì)資源,培育甜菜新種質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取紅甜菜(B.vulgarisvar.crucenta)和糖甜菜(B.vulgarisvar.Saccharifera)2種栽培型甜菜為試驗(yàn)材料。紅甜菜品系‘一品紅’由哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院程大友教授提供;糖甜菜品系‘HD802’由黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院吳則東研究員提供。

1.2 試劑與儀器

試劑:甲醇、乙腈、甲酸,均為色譜純,甲醇、乙腈品牌為Merck,甲酸品牌為Aladdin。儀器:研磨儀(MM 400),德國Retsch公司;超高效液相色譜(1290 UHPLC),品牌Agilent;串聯(lián)色譜(Applied Biosystems 6500 QTRAP),美國AB Sciex公司;色譜柱(SB-C181.8 μm,2.1 mm×100 mm),品牌Agilent。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品采集和預(yù)處理

選取同一大田,同一生長環(huán)境下的糖甜菜(‘HD802’)和紅甜菜(‘一品紅’)塊根作為試驗(yàn)材料,為減小試驗(yàn)誤差,每個(gè)栽培種選取6株長勢一致的甜菜根,處理備用。

將甜菜塊根斜45°,取甜菜塊根1 cm直徑的圓柱體,置于凍干機(jī)進(jìn)行真空冷凍干燥處理;再移至研磨儀30 Hz條件下研磨1.5 min,至粉末狀;萬分之一天平稱取50 mg凍干粉末,將其溶解于1.2 mL 70% 甲醇提取液中,每間隔30 min的時(shí)間渦旋1次,1次漩渦時(shí)間為30 s,共進(jìn)行6次渦旋;然后將樣品放置于離心機(jī)中,轉(zhuǎn)速12 000 rpm離心3 min,取上清液,0.22 μm微孔濾膜過濾上清液,保存于進(jìn)樣瓶中,用于UPLCMS/MS分析。

1.3.2 色譜條件

色譜柱:Agilent SB-C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);流速0.35 mL/min;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量2 μL。流動(dòng)相:A相為超純水(加入0.1%的甲酸),B相為乙腈(加入0.1%的甲酸),梯度洗脫見表3。

表1 梯度洗脫Table 1 Gradient elution

1.3.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(electrospray ionization,ESI)溫度500 ℃,離子噴霧電壓(IS)5500 V(正離子模式)/-4500V(負(fù)離子模式),離子源氣體I(GSI)、氣體II(GSII)和氣簾氣(CUR)分別設(shè)置為50、60和25 psi,碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為高。QQQ掃描使用MRM模式,并將氣體(氮?dú)?設(shè)置為中等。通過進(jìn)一步去簇電壓(declustering potential,DP)和碰撞能(collision energy,CE)優(yōu)化,完成了各個(gè)MRM離子對的DP和CE。根據(jù)每個(gè)時(shí)期內(nèi)洗脫的代謝物,監(jiān)測一組特定的MRM離子對,以獲得檢測峰圖。

1.3.4 萜類化合物分析

利用軟件Analyst進(jìn)行數(shù)據(jù)采集,基于MWDB(metware database)數(shù)據(jù)庫,根據(jù)混樣質(zhì)控樣本(quality control,QC)的總離子流圖及MRM代謝物檢測多峰圖,對樣品的代謝物進(jìn)行質(zhì)譜定性分析。利用三重四極桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式完成萜類物質(zhì)定量分析,分析方法為:計(jì)算一級質(zhì)譜中的提取離子色譜峰的峰面積,對所有物質(zhì)質(zhì)譜峰進(jìn)行峰面積積分,并對其中同一代謝物在不同樣本中的質(zhì)譜出峰進(jìn)行積分校正,比較分析甜菜塊根萜類化合物的含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Office Excel 2016和SPSS 23.0(IBM Corporation,Armonk,NY,USA)及正交偏最小二乘法判別分析法(Orthogonal Partial Least Squares-Discriminant Analysis,OPLS-DA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本質(zhì)控

樣品經(jīng)HPLC-MS分析,鑒定出的萜類化合物的保留時(shí)間、m/z、MS/MS 碎片離子等信息。結(jié)果顯示代謝物檢測總離子流的曲線重疊性高,即保留時(shí)間和峰強(qiáng)度均一致,表明質(zhì)譜對同一樣品不同時(shí)間檢測時(shí),信號穩(wěn)定性較好。儀器的高穩(wěn)定性為數(shù)據(jù)的重復(fù)性和可靠性提供了重要的保障。從總離子流圖中可看出峰的純度高,達(dá)到試驗(yàn)數(shù)據(jù)后期的分析要求。正/負(fù)離子模式下的總離子流圖見圖1、圖2。

圖1 混樣樣品質(zhì)譜分析總離子(正離子)流圖Fig.1 Totalion flow pattern analysis by mixed essence spectrum (positive)

圖2 混樣樣品質(zhì)譜分析總離子(負(fù)離子)流圖Fig.2 Totalion flow pattern analysis by mixed essence spectrum (negative)

2.2 正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)

OPLS-DA分析結(jié)果顯示,2組甜菜樣本處于95%置信區(qū)間內(nèi),分別處于置信區(qū)間的左側(cè)和右側(cè)。紅甜菜的樣本點(diǎn)間距離更接近,整組的聚集程度要略強(qiáng)于糖甜菜樣本。本次分析共得到2個(gè)主成分。糖甜菜、紅甜菜分析結(jié)果:R2X=0.411,R2Y=0.972,Q2=0.828(圖3),Q2值處于0.5～1,說明OPLS-DA模型的預(yù)測好,不存在過擬合現(xiàn)象。由OPLS-DA得分可看出2種樣品代謝存在明顯種間代謝差異。

圖3 糖甜菜(One-CK)與紅甜菜(Two-CK)對比的OPLS-DA模型分散點(diǎn)圖Fig.3 OPLS-DA model scatter point diagram for comparison of sugar beet (One-CK) and red beet (Two-CK)

2.3 紅甜菜和糖甜菜塊根中萜類物質(zhì)分析

紅甜菜和糖甜菜中共檢測出萜類物質(zhì)48種,分成6種類型(見表2)。13種倍半萜,種類占2種甜菜塊根中萜類物質(zhì)種類的27.08%;7種單萜,種類占2種甜菜塊根中萜類物質(zhì)種類的14.58%;13種二萜,種類占2種甜菜塊根中萜類物質(zhì)種類的27.08%;7種三萜,種類占2種甜菜塊根中萜類物質(zhì)種類的14.58%;7種三萜皂苷,種類占2種甜菜塊根中萜類物質(zhì)種類的14.58%;1種名為布盧門醇C的其他萜類物質(zhì)。

表2 紅甜菜和糖甜菜塊根中萜類物質(zhì)相對含量分析Table 2 Analysis on the relative contents of terpenoids in roots of red beet and sugar beet

2.4 紅甜菜和糖甜菜塊根中萜類物質(zhì)差異分析

比較紅甜菜和糖甜菜塊根中萜類物質(zhì)的相對含量,結(jié)果表明:紅甜菜和糖甜菜差異代謝物共有6種。紅甜菜塊根中高于糖甜菜塊根的萜類成分有4種,包括去氫木香內(nèi)酯,30-去甲常春藤皂苷元、地膚子皂苷Ic和齊墩果酸-3-O-木糖基(1→3)葡萄糖醛酸苷。糖甜菜塊根的萜類成分中高于紅甜菜塊根有2種,分別是女貞苦苷和異雞蛋花素(見表3),其他沒有顯著性差異的萜類代謝物有42種(見圖4)。

圖4 2組樣本差異代謝物比對火山圖Fig.4 Comparison of differential metabolites between two sample groups using a volcano plot

表3 紅甜菜和糖甜菜塊根中萜類差異代謝物Table 3 Differential metabolites of terpenoids in roots of red beet and sugar beet

3 討論

紅甜菜主要作為一種蔬菜,在我國南方地區(qū)較為盛行。而糖甜菜主要作為制糖原料廣泛種植在我國的東北、西北和華北地區(qū)。從2種甜菜中共檢測出48個(gè)萜類物質(zhì),在這48個(gè)萜類成分中去氫木香內(nèi)酯、女貞苦苷、齊墩果酸、地膚子皂苷等萜類成分具有一定的生物活性和藥用價(jià)值。

去氫木香內(nèi)酯是一種天然倍半萜化合物,具有抗氧化、抗炎[13-14]、抗菌[15]、抑制慢性髓系白血病[16]以及抑制喉癌[17]、膠質(zhì)瘤[18]等多種腫瘤細(xì)胞的增殖活性,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等功能。本研究結(jié)果表明,紅甜菜根中去氫木香內(nèi)酯的含量約是糖甜菜中含量的9.72倍。此外,去氫木香內(nèi)脂和木香烴內(nèi)酯作為木香主要的有效成分,具備調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)作用[19],改善胃腸道功能[20]等生物活性。

女貞苦苷是一種環(huán)烯醚萜類物質(zhì)。環(huán)烯醚萜類作為許多中藥的天然有效的生物活性成分,具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗原蟲、保護(hù)活性神經(jīng)、免疫調(diào)節(jié)、降血糖及保肝活性[21]。本研究中,糖甜菜塊根中女貞苦苷的含量是紅甜菜塊根中含量的2.28倍。

齊墩果酸存在于多種植物,具有抗病毒、防骨質(zhì)疏松、治療銀屑病、修復(fù)潰瘍皮膚疤痕等功能[22],還能夠抗高血糖[23],改善脂肪肝病[24],延緩細(xì)胞衰老[25],促進(jìn)骨折愈合[26],治療銀屑病[27],抗癲癇[28],增強(qiáng)果實(shí)抗病性[29]。本研究表明紅甜菜塊根中齊墩果酸的含量為糖甜菜塊根中含量的6.62倍。

地膚子皂苷是一種天然三萜皂苷,能夠抗前列腺癌[30],保護(hù)胃損傷[31]。還可作為祛濕止癢顆?？桂W、抗炎、抗過敏的主要有效成分[32-35]。天然植物地膚子乙醇提取物對羥基,DPPH和ABTS+自由基均有一定的清除能力[36]。本研究結(jié)果表明,紅甜菜塊根中地膚子皂苷的含量約是糖甜菜中含量的3.73倍。

此外,已有研究表明萜類物質(zhì)可以在植物感染病原菌后被誘導(dǎo)并釋放出來,達(dá)到提高植物抗逆性的作用。在本研究中,從甜菜根中檢測出的48個(gè)萜類物質(zhì)是否對甜菜根抗病性有影響尚未有報(bào)道,因此可以作為新的研究課題進(jìn)行深入研究。

4 結(jié)論

紅甜菜和糖甜菜共鑒定得到6類48種萜類代謝物。包括13種倍半萜,7種單萜,13種二萜,7種三萜,7種三萜皂苷以及布盧門醇C。紅甜菜和糖甜菜中的萜類差異代謝物有6種,紅甜菜塊根中相對含量高的成分是去氫木香內(nèi)酯、30-去甲常春藤皂苷元、地膚子皂苷Ic和齊墩果酸-3-O-木糖基(1→3)葡萄糖醛酸苷,糖甜菜塊根中相對含量較高的成分是女貞苦苷和異雞蛋花素。明確不同甜菜根中萜類代謝物的差異,可以為新藥物研發(fā)以及培育具有特殊活性成分的新甜菜品種提供研究基礎(chǔ),萜類成分的植物防御功能有待進(jìn)一步研究。