腦脊液二代測序在結(jié)核性腦膜炎中的臨床研究

張小麗 陳梅 李明峽 韓本發(fā)

摘要：目的 觀察結(jié)核性腦膜炎的臨床診斷中腦脊液二代測序技術(shù)在早期診斷中的應(yīng)用價值。方法選取2019年2月～2019年8月我院胸科收治的12名懷疑患有結(jié)核性腦膜炎的患者，以跟蹤隨訪的方式對其最終的診斷結(jié)局進(jìn)行了解，并且同時將腦積液標(biāo)本用二代測序技術(shù)實施檢測。對比檢測結(jié)果與病原數(shù)據(jù)庫，分析結(jié)果的實際情況。在對比中，二代測序結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)為檢測到結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群唯一對比序列，并且顯示陽性。未檢測到的唯一對比序列則認(rèn)定為陰性。將符合腦脊液結(jié)合分支桿菌的具體樣本進(jìn)行培養(yǎng)，涂片陽性以及檢測陽性四項指標(biāo)的對比檢驗中至少有一項符合陽性標(biāo)準(zhǔn)，即可判定為患有結(jié)核性腦膜炎。在臨床上，若懷疑患有結(jié)核性腦膜炎，并且在同步應(yīng)用抗結(jié)核治療方法后有效果的患者可以納入臨床診斷患者范圍內(nèi)，若其他病原學(xué)依據(jù)或臨床檢測結(jié)果能排除結(jié)核性腦膜炎患病，則可判定為非結(jié)核性腦膜炎患者。以上述判定依據(jù)為基礎(chǔ)，分析二代測序技術(shù)在結(jié)合性腦膜炎早期診斷中的敏感性水平和特異程度。結(jié)果 不同檢測方法在不同診斷標(biāo)準(zhǔn)背景下的診斷特異度均達(dá)到100%，傳統(tǒng)方法和X-pert、二代測序技術(shù)在實踐應(yīng)用中顯示出的敏感性差異程度較高，前兩種檢測方法與二代測序技術(shù)檢測方法的敏感性具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。結(jié)論 二代測序技術(shù)能夠快速有效地檢測出腦脊液中的結(jié)核分支桿菌復(fù)合群，敏感性和特異程度都相對更高，可應(yīng)用于結(jié)核性腦膜炎的早期診斷中。

關(guān)鍵詞：腦脊液二代測序技術(shù)；結(jié)核性腦膜炎；早期診斷

結(jié)核性腦膜炎主要的感染誘因是結(jié)核分枝桿菌，這種細(xì)菌會對人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成直接影響。隨著感染頻率的提高，現(xiàn)階段結(jié)核性腦膜炎的發(fā)病率也呈現(xiàn)出逐步提高的趨勢。由于腦膜炎疾病治療的難度相對較大，治療時間成本也相對更高[1～2]。如何在早期針對這類疾病進(jìn)行有效診斷并給予針對性治療，是降低治療成本、提高治療有效性的重要條件。

二代測序技術(shù)是從序列病原微生物的鑒定角度出發(fā)，發(fā)揮作用的創(chuàng)新技術(shù)，在實踐應(yīng)用中能夠基于人體中樞神經(jīng)感染細(xì)菌的情況進(jìn)行初步診斷[3～4]。本研究選取疑似結(jié)核性腦膜炎的患者12例為研究對象，通過臨床診斷以及二代測序技術(shù)預(yù)測診斷對比，明確該技術(shù)在結(jié)核性腦膜炎治療過程中的應(yīng)用價值。

1研究對象與方法

1.1 研究對象

采用前瞻性研究，結(jié)合患者入院治療時間，選擇固定時間區(qū)間的12例疑似結(jié)核性腦膜炎患者為研究對象，患者最大年齡65歲，最小年齡28歲，平均年齡（39.22±5.17）歲；男8例，女4例。所有參與研究的患者均要進(jìn)行前期生命體征、病史評估，同時了解其疾病癥狀，給予初步檢查。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡＞18歲；臨床診斷初步懷疑患有結(jié)核性腦膜炎，患者已出現(xiàn)結(jié)核性腦膜炎的典型臨床癥狀，且生命體征其出現(xiàn)波動，具體表現(xiàn)為體溫升高，頭部劇烈疼痛，部分患者還出現(xiàn)嘔吐和腦膜刺激現(xiàn)象[5]；將所有腦脊液樣本送至專門研究所的二代測序平臺進(jìn)行檢測，確保樣本符合此檢測技術(shù)應(yīng)用的客觀要求，腦脊液總量不得低于2 mL；所有患者均知曉本研究并簽署同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：確認(rèn)感染其他病菌，而非結(jié)核性腦膜炎病菌的患者；送檢樣本總量低于2 mL的患者；合并其他類型的免疫系統(tǒng)或腫瘤類疾病的患者；由于個人原因在本研究期間主動退出的患者。

1.3 診斷主要依據(jù)

確診患有結(jié)核性腦膜炎的診斷依據(jù)為腦脊液的結(jié)合分支桿菌培養(yǎng)或圖片結(jié)果均顯示為陽性，并且應(yīng)用專業(yè)的 Xpert檢測方法顯示陽性，結(jié)核分支桿菌的核酸檢測結(jié)果四項中也有一項呈現(xiàn)陽性。臨床診斷依據(jù)方面，排除了感染其他病原體或腫瘤以及免疫性疾病，但患者在疾病治療的過程中應(yīng)用治療結(jié)核性腦膜炎的藥物顯示治療有效。

排除結(jié)核性腦膜炎患者的依據(jù)：一是患者明確判定為其他感染，而非結(jié)核分支桿菌感染，具體的感染病菌包括布魯桿菌，隱球菌或其他病毒；二是患者若符合腫瘤疾病或自身免疫性疾病等一系列未感染此類疾病的診斷結(jié)果，則可判定其未患上結(jié)核性腦膜炎。

1.4 檢測方法

本研究的檢測工作均送檢專門的檢測平臺，觀察符合率指標(biāo)。檢測到分支桿菌復(fù)合群的唯一對比序列，則可判定為陽性，未檢測到判定為陰性。及時排除背景序列的影響，分析檢測結(jié)果時，唯一對比序列最少1條，最高180條以上，平均序列數(shù)達(dá)到18條左右。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 觀察隊列標(biāo)本和診斷結(jié)果的符合情況

確診患者10例，應(yīng)用常規(guī)Xpert檢測方法檢測到的確診患者6例，培養(yǎng)后陽性患者3例。結(jié)核分枝桿菌檢測確診患者6例，臨床診斷患者8例。

2.2 二代測序技術(shù)和傳統(tǒng)診斷技術(shù)檢測結(jié)核分支桿菌的效能分析

診斷結(jié)果：分支桿菌培養(yǎng)陽性和核酸陽性患者6例，應(yīng)用二代測序技術(shù)檢測陽性，傳統(tǒng)檢測技術(shù)檢測陰性患者6例。在12例確診患者中，經(jīng)過二代測序技術(shù)診斷確診的患者10例，診斷敏感度83.3%。較之傳統(tǒng)檢測方法，二代測序技術(shù)在檢測敏感度相對更高（P＜0.05）。見表1。

2.3 二代測序方法與Xpert方法的敏感度和特異度比較

兩種檢測方法的敏感度和特異度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

3討論

結(jié)核病屬于細(xì)菌感染類疾病，患者在患病后由于細(xì)菌感染，會出現(xiàn)生命體征異?；蚵詡魅拘约膊?。相關(guān)研究結(jié)果顯示，因結(jié)核病而死亡的病例在占比方面呈現(xiàn)出逐步提升的狀態(tài)，腦脊液結(jié)核也屬于由于細(xì)菌直接侵犯人的腦細(xì)胞造成的一種疾病，是除了肺結(jié)核外嚴(yán)重程度相對更高的一種疾病類型，病殘率和病死率較高。臨床需堅持早發(fā)現(xiàn)、早治療的防治原則[6]，避免患者疾病惡化，危及其生命。臨床診斷與專業(yè)技術(shù)診斷方法都可用于此類疾病的診斷，且專業(yè)技術(shù)診斷方法所應(yīng)用的設(shè)備也在實際中存在差異，這也是這類疾病診斷存在客觀困難的主要原因。在長期的診斷工作總結(jié)中，難治性結(jié)核腦膜炎的患者呈現(xiàn)出不斷增加的發(fā)展趨勢，這也給早期診斷工作帶來了新的挑戰(zhàn)，結(jié)核病之所以會發(fā)展到難治的狀態(tài)，主要由于患者在患病初期未能及時得到診斷，患者患病后自身對于疾病的敏感性以及對一些真正的敏感性也存在不足，導(dǎo)致患病后未能及時就診和確診。

從目前的實際情況出發(fā)分析可知，目前診斷結(jié)核性腦膜炎的金標(biāo)準(zhǔn)集中在應(yīng)用腦脊液檢測達(dá)到疾病判斷。診斷腦脊液的過程中，需要精確判定結(jié)核分支桿菌的具體感染情況。但從實際出發(fā)來講，腦脊液涂片在染色時，由于其抗酸特征，染色直接可判定陽性的概率相對較低，只能達(dá)到10%左右。由此可見，直接檢測腦脊液并參照圖片進(jìn)行疾病診斷，在準(zhǔn)確率方面會受到一定的影響。但現(xiàn)階段針對這類結(jié)核病的診斷也出現(xiàn)了一些新型的技術(shù)，如分子診斷技術(shù)、二代測序技術(shù)都能夠從實際出發(fā)提升疾病診斷的有效率，為疾病診斷提供了非常重要的技術(shù)支持。

二代測序技術(shù)的主要特征在于高通量。測序技術(shù)常見應(yīng)用在糖尿病、腫瘤疾病以及產(chǎn)婦的產(chǎn)前診斷過程中。隨著該技術(shù)在各個疾病診斷的過程中得到應(yīng)用，目前在針對腦脊液診斷時也開始應(yīng)用該技術(shù)，主要通過對病原體進(jìn)行檢測，判斷患者是否能夠確診疾病。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)報道信息顯示，此種技術(shù)在臨床應(yīng)用時，需要納入多方面評價指標(biāo)，且評價工作的全面性精準(zhǔn)性也要達(dá)到一定程度。二代測序技術(shù)是此類技術(shù)中非常典型的技術(shù)類型，不僅能夠保證檢測效果的通量，也能夠確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確性達(dá)到更高的水平，在臨床診斷中占據(jù)非常重要的地位。另外，該技術(shù)作為一種分子診斷技術(shù)，在細(xì)菌、真菌和病毒的診斷中也能發(fā)揮一定的作用，這對傳染性疾病的診斷來說有非常重要的意義。本研究結(jié)果顯示，不同檢測方法在不同診斷標(biāo)準(zhǔn)背景下的診斷特異度均達(dá)到100%，傳統(tǒng)方法和X-pert、二代測序技術(shù)在實踐應(yīng)用中顯示出的敏感性差異程度較高，前兩種檢測方法與二代測序技術(shù)檢測方法的敏感性比較具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。由此可見，該技術(shù)在早期診斷檢測中具有非常顯著的應(yīng)用價值。

二代測序技術(shù)對病原體具有非常顯著的檢測應(yīng)用效果。同時，對未知病原體也能夠發(fā)揮一定的檢測作用。在此種技術(shù)應(yīng)用時，可實施全基因組測序分析，這一分析過程能夠直接將細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果中具有相似度且不好區(qū)分的相關(guān)病原進(jìn)行精準(zhǔn)辨認(rèn)。同時，能夠保證對陽性患者具備敏感性較高的檢測狀態(tài)。從檢測速度上來講，二代測序技術(shù)比傳統(tǒng)檢測技術(shù)在檢測工作落實的用時上相對更短。因此，在同等檢測結(jié)果的背景下，二代測序技術(shù)的應(yīng)用效率也會更高。但從實際出發(fā)來講，此種技術(shù)在應(yīng)用中也會遇到一些現(xiàn)實問題，主要表現(xiàn)在以下幾方面：一是在標(biāo)本制備環(huán)節(jié)容易受到外部環(huán)境條件的限制。應(yīng)用二代測序技術(shù)雖然能夠直接檢測出DNA的類型，并且確認(rèn)病原體的具體情況，但對RNA類型的病原體還未能做到同步取得預(yù)期的檢測效果。二是目前此類技術(shù)的檢測費用相對較高，這與檢測技術(shù)未能全面普及有直接的關(guān)系。在實際應(yīng)用中，此種技術(shù)的應(yīng)用也會受到一定的限制，不能直接用于檢測結(jié)核性腦膜炎的病菌。應(yīng)用前，需要判斷患者是否具有耐藥性，若一部分患者具有耐藥性，則患病后初步診斷時無法得到預(yù)期的良好效果。

綜上所述，應(yīng)用二代測序技術(shù)進(jìn)行結(jié)核性腦膜炎的診斷檢測具有檢測效果和檢測敏感度均較高的特征，在這類疾病的早期診斷中有非常顯著的應(yīng)用價值。但進(jìn)行診斷價值評估時，應(yīng)分別從臨床診斷和確診患者的實際情況兩方面入手進(jìn)行診斷判斷，提高診斷結(jié)果預(yù)判的可靠性。

參考文獻(xiàn)

[1] 張麗華，羅松，許書添，等.兩次腦脊液宏基因二代測序診斷系統(tǒng)性紅斑狼瘡并發(fā)進(jìn)行性多灶性白質(zhì)腦病[J].腎臟病與透析腎移植雜志，2022，31（6）：595-600.

[2] 張金莉.腦脊液二代測序診斷成人皮疹陰性水痘-帶狀皰疹病毒腦炎1例[J].實用醫(yī)技雜志，2022，29（10）：1119-1120.

[3] 何思科，衛(wèi)靜雯，馮家鳴，等.腦脊液宏基因組二代測序輔助診斷艾滋病合并弓形蟲腦炎一例[J].華西醫(yī)學(xué)，2022，37（8）：1268-1270.

[4] 謝馨，張明杰，范進(jìn)，等.頭顱影像結(jié)合腦脊液二代測序診斷咽峽炎鏈球菌群致硬膜下積膿一例[J].華西醫(yī)學(xué)，2022，37（8）：1261-1263.

[5] 張綿，曾東，鄭華.宏基因組二代測序?qū)χ匕Y監(jiān)護病房內(nèi)膿毒癥患者治療及預(yù)后的影響研究[J].黑龍江醫(yī)學(xué)，2022，46（9）：1032-1034.

[6] 羅智強，廖建湘.兒童廣州管圓線蟲腦膜炎3例臨床特點及腦脊液宏基因二代測序診斷價值分析[J].中國實用兒科雜志，2022，37（1）：59-62.