微弧氧化涂層促進(jìn)3D打印個(gè)性化鈦種植體骨愈合的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究

徐延，于晴，房睿，閻旭，叢芳，王文茉，張桂榮

（1. 沈陽(yáng)市口腔醫(yī)院綜合門(mén)診，沈陽(yáng) 110002； 2. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·附屬口腔醫(yī)院干診科，沈陽(yáng) 110002； 3. 沈陽(yáng)市口腔醫(yī)院科教科，沈陽(yáng) 110002）

種植體與其周?chē)墙M織結(jié)合是口腔種植成功的關(guān)鍵。目前，臨床上多采用形態(tài)規(guī)則的錐形或柱狀種植體，這些種植體與拔牙窩外形不吻合，初期穩(wěn)定性較差。3D打印個(gè)性化鈦種植體為仿牙根形態(tài)設(shè)計(jì)，可更好模擬自然牙的傳力特性和牙根的應(yīng)力分布特性，提高了骨與種植體的結(jié)合率［1］。電子束熔融 （electron beam melting，EBM） 是一種3D打印技術(shù)，采用電子束作為能量源，是使材料完全熔化后再冷卻凝固成型的三維實(shí)體制造方法。EBM后期無(wú)需熱處理，工藝流程簡(jiǎn)化，可精準(zhǔn)控制材料的孔隙結(jié)構(gòu)，多孔部分和致密實(shí)體部分可一次成型，具有良好的結(jié)構(gòu)連續(xù)性［2］。

鈦種植體表面致密的氧化鈦層具有生物惰性，無(wú)促進(jìn)成骨能力。鈦種植體在模擬體液或者機(jī)體內(nèi)幾乎不能誘導(dǎo)羥基磷灰石的沉積，只是與骨組織形成一般的骨整合，因此骨結(jié)合率較低［3］。鈦種植體表面進(jìn)行改性等活化處理，可增強(qiáng)種植體與骨的結(jié)合，預(yù)防種植體周?chē)俏眨?］。近年來(lái)隨著材料學(xué)表面處理工藝的發(fā)展，應(yīng)用微弧氧化表面處理成為鈦種植體表面改性研究的熱點(diǎn)。微弧氧化由陽(yáng)性氧化技術(shù)升級(jí)而來(lái)，可將鈦合金表面改性形成微納米生物活性鈦涂層，促進(jìn)成骨細(xì)胞在種植體表面黏附，增強(qiáng)附著力［5］。另外，微弧氧化技術(shù)操作方便、成本低，能有效調(diào)整所制備表面涂層的微觀結(jié)構(gòu)和元素，提高種植體的成骨性和抗菌性［6］。本研究通過(guò)EBM技術(shù)制備個(gè)性化鈦種植體，并在其表面制備微弧氧化涂層，探討微弧氧化涂層對(duì)3D打印個(gè)性化鈦種植體骨愈合的作用，旨在為復(fù)合涂層3D打印鈦種植體的臨床應(yīng)用提供依據(jù)，并為提高臨床種植成功率及使用壽命提供新思路。

1 材料與方法

1.1 3D打印個(gè)性化根形鈦種植體的設(shè)計(jì)與制作

通過(guò)CT （日本HITACHI公司） 檢查獲取實(shí)驗(yàn)犬目標(biāo)牙牙根原始形態(tài)數(shù)據(jù)，將DICM格式原始圖像導(dǎo)入Mimicis10.0 軟件中，選取雙側(cè)第四前臼齒作為目標(biāo)牙，獲取目標(biāo)牙圖像數(shù)據(jù)，建立三維模型并進(jìn)行修整處理，將種植體設(shè)計(jì)為表面孔徑300 μm、孔隙率70%的多孔結(jié)構(gòu)，通過(guò)EBM 3D打印機(jī) （瑞典Arcam公司） 制作出與目標(biāo)牙牙根形態(tài)高度吻合的個(gè)性化鈦種植體，共16個(gè)。見(jiàn)圖1。

圖1 個(gè)性化鈦種植體三維模型及制備完成的種植體樣本

1.2 微弧氧化涂層制備

噴砂拋光30 s （去除種植體3D打印過(guò)程中表面未完全熔融的殘留顆粒），丙酮清洗3D打印鈦種植體試樣15 min （去除表面鈦金屬粉末）。鹽酸∶硫酸∶去離子水按照2 ∶1 ∶1比例配置酸洗液，將種植體置入酸洗液酸蝕5 min，酸蝕后的種植體依次用無(wú)水乙醇、蒸餾水超聲清洗各10 min，常溫氮?dú)飧稍?。?6個(gè)3D打印個(gè)性化種植體均分為2組：微弧氧化涂層組和對(duì)照組。微弧氧化涂層組種植體置入含有乙酸鈣、磷酸二氫鈉、碳化硅納米顆粒的電解質(zhì)溶液中處理10 min，進(jìn)行表面微弧氧化；對(duì)照組種植體不做處理。通過(guò)掃描電鏡 （EVO10，德國(guó)ZEISS公司） 觀察種植體表面形態(tài)，使用X射線能譜儀 （XPS，美國(guó)ThermoVG公司） 檢測(cè)種植體的元素組成。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、分組及手術(shù)方法

健康雄性成年比格犬4只，年齡12～18個(gè)月，體質(zhì)量12～15 kg，沈陽(yáng)康平實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供。微創(chuàng)拔除4只實(shí)驗(yàn)犬下頜雙側(cè)第四前臼齒，保證骨壁完整無(wú)破壞。每只實(shí)驗(yàn)犬共有2個(gè)近中和2個(gè)遠(yuǎn)中拔牙窩，共16個(gè)拔牙窩。將16個(gè)拔牙窩隨機(jī)分為2組，一組拔牙窩內(nèi)植入微弧氧化涂層組鈦種植體，另一組拔牙窩植入對(duì)照組鈦種植體。手術(shù)方法：將個(gè)性化種植體冠方牙體部分截去，依據(jù)相應(yīng)的方向植入拔牙窩內(nèi)，輕敲擊或按壓就位，使種植體頂端與牙槽嵴頂平齊在無(wú)張力下縫合創(chuàng)口，10 d后拆除縫線。見(jiàn)圖2。術(shù)后抗感染治療，常規(guī)半流食飼養(yǎng)，定期觀察實(shí)驗(yàn)犬生命體征及植入?yún)^(qū)組織愈合情況。所有犬的選擇、管理、手術(shù)方案以及術(shù)前準(zhǔn)備處理工作都符合國(guó)際動(dòng)物保健和使用委員會(huì)的要求。

圖2 拔除犬下頜第四前臼齒，并將種植體植入拔牙窩內(nèi)

1.4 影像學(xué)觀察

術(shù)后2個(gè)月進(jìn)行CT檢查，觀察種植體周?chē)俏占肮怯锨闆r。

1.5 組織形態(tài)學(xué)分析

術(shù)后2個(gè)月安樂(lè)死實(shí)驗(yàn)犬，在種植體外周0.5 cm處截?cái)喃@取帶種植體的下頜骨標(biāo)本，于4%多聚甲醛中固定24 h。采用梯度乙醇進(jìn)行標(biāo)本脫水，將脫水后的組織用環(huán)氧樹(shù)脂包埋，然后使用硬組織切片機(jī)（300-CP，德國(guó)EXAKT公司） 沿頰舌向種植體長(zhǎng)軸切片 （厚度50 μm）。切片進(jìn)行甲苯胺藍(lán)試劑染色，然后利用光學(xué)顯微鏡 （日本Olympus公司） 觀察組織形態(tài)。利用 Image-Pro Plus 6.0 軟件計(jì)算骨長(zhǎng)入面積率和骨結(jié)合率。其中，骨長(zhǎng)入面積率 （%） =骨與種植體接觸的實(shí)際面積/種植體能提供骨長(zhǎng)入的總面積×100；骨結(jié)合率 （%） =骨與種植體實(shí)際接觸面的總長(zhǎng)度/種植體能提供骨接觸面的總長(zhǎng)度×100。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用 SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用表示，2組比較采用t檢驗(yàn)，P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組掃描電鏡結(jié)果

結(jié)果顯示，微弧氧化涂層組鈦種植體表面較粗糙，形成TiO2膜層，表面有較多孔洞，多呈圓形、橢圓形分布；對(duì)照組鈦種植體表面呈現(xiàn)波浪狀多孔結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖3。X射線能譜儀檢測(cè)結(jié)果顯示，微弧氧化涂層組表面除了鈦合金所含元素外，還具有Ca、P、Si、O、Na等元素；對(duì)照組表面僅含有鈦合金元素，見(jiàn)圖4。

圖3 2組掃描電鏡結(jié)果比較

圖4 X射線能譜元素分析結(jié)果

2.2 2組術(shù)后觀察及CT檢查結(jié)果

結(jié)果顯示，術(shù)后2個(gè)月2組犬體征良好，種植體牙齦軟組織創(chuàng)口愈合良好，周?chē)例l未見(jiàn)紅腫，未見(jiàn)種植體脫落現(xiàn)象。2組種植體周?chē)鶡o(wú)低密度影像，未見(jiàn)骨吸收，骨愈合良好，未見(jiàn)骨折、骨裂。見(jiàn)圖5。

圖5 術(shù)后2個(gè)月2組種植體CT影像

2.3 2組組織形態(tài)學(xué)結(jié)果

術(shù)后2個(gè)月制取硬組織切片并利用光學(xué)顯微鏡觀察，鏡下種植體顯示為黑色，骨組織顯示為藍(lán)色。結(jié)果顯示，鏡下見(jiàn)骨結(jié)合界面清晰，2組種植體周?chē)胁煌潭裙墙Y(jié)合，表面均有不同程度新生骨長(zhǎng)入。微弧氧化涂層組種植體表面被較多新生骨包繞，結(jié)合緊密，且結(jié)合面積較廣泛；種植體外層孔隙內(nèi)可見(jiàn)有新生骨組織充填，且與周?chē)妆诰o密結(jié)合。對(duì)照組種植體表面新生骨附著較少，部分新生骨組織呈游離狀態(tài)；新生骨與種植體之間可見(jiàn)空泡區(qū)域，骨結(jié)合面積較小且結(jié)合不緊密。見(jiàn)圖6。

圖6 2組組織形態(tài)學(xué)比較

微弧氧化涂層組與對(duì)照組骨長(zhǎng)入面積率分別為34.9%±2.4%、24.6%±3.6%，骨結(jié)合率分別為40.8%±3.4%、29.6%±3.6%，微弧氧化涂層組骨長(zhǎng)入面積率、骨結(jié)合率均顯著高于對(duì)照組 （均P< 0.05）。

3 討論

種植義齒修復(fù)已在臨床牙列缺損治療中廣泛應(yīng)用。與傳統(tǒng)的早期種植和延期種植相比，即刻種植具有縮短手術(shù)時(shí)間、減少治療周期、降低治療成本等優(yōu)點(diǎn)。臨床上即刻種植更多應(yīng)用于前牙的種植修復(fù)。已有研究［7］顯示磨牙區(qū)即刻種植骨結(jié)合良好。但在即刻種植時(shí)，現(xiàn)有螺紋狀和柱狀結(jié)構(gòu)的單牙根式種植體與天然牙牙根形狀不同，與拔牙后的牙槽窩形狀不一致，種植體與骨組織間常存在間隙，既影響種植體初期穩(wěn)定性，又影響種植體和骨組織間的骨性愈合，進(jìn)而影響種植手術(shù)的成功率［8］。本實(shí)驗(yàn)中個(gè)性化鈦種植體為仿天然牙根形態(tài)設(shè)計(jì)，可以與其牙槽窩形態(tài)匹配，植入時(shí)不需要制備種植窩，種植體與牙槽窩之間可以更好模擬天然牙根的應(yīng)力分布特性。傳統(tǒng)純鈦種植體由于材料彈性模量過(guò)高導(dǎo)致應(yīng)力遮擋效應(yīng)而容易造成周?chē)啦酃俏?、種植體脫落［9］。研究［10-11］表明，3D打印技術(shù)可制造表面具有多孔結(jié)構(gòu)的鈦合金個(gè)性化種植體，調(diào)節(jié)孔隙率和孔徑使種植體具有與骨組織相匹配的彈性模量，適宜的彈性模量可有效減小鈦的應(yīng)力屏障作用，多孔結(jié)構(gòu)也可使個(gè)性化鈦種植體與牙槽骨之間結(jié)合面積增大，增強(qiáng)種植體初期穩(wěn)定性。本實(shí)驗(yàn)個(gè)性化鈦種植體表面多孔結(jié)構(gòu)的孔徑為300 μm，孔隙率為70%，形成具有凹面和孔隙的類(lèi)骨小梁結(jié)構(gòu)，有利于骨細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)骨結(jié)合，其中表層的多孔結(jié)構(gòu)能夠避免應(yīng)力集中造成的牙槽骨壁吸收，同時(shí)牙根內(nèi)部的實(shí)心結(jié)構(gòu)也可以保證種植體的強(qiáng)度。本實(shí)驗(yàn)中多孔結(jié)構(gòu)厚度略薄，未來(lái)可增加多孔層厚度，更有利于骨組織長(zhǎng)入。目前，制作個(gè)性化根形鈦合金種植體多選用選擇性金屬熔融 （selective laser melting，SLM） 和 EBM 技術(shù)［12］。與以激光為能源的SLM技術(shù)比較，EBM技術(shù)制備的樣本是在真空環(huán)境下完成，因而避免了樣本制作過(guò)程中受到污染；且EBM技術(shù)以電子束作為熱源，能量利用率較SLM高，加工速度快［13］。

本實(shí)驗(yàn)在含有Ca、P和Si等元素的電解質(zhì)中通過(guò)微弧氧化技術(shù)在種植體表面制備多孔TiO2涂層。有研究［14］顯示多孔TiO2涂層具有較高的表面能和較大的表面粗糙度，能更好促進(jìn)成骨細(xì)胞黏附和擴(kuò)散。本研究結(jié)果顯示，術(shù)后2個(gè)月微弧氧化涂層組種植體表面骨結(jié)合比對(duì)照組更加廣泛、緊密，空泡區(qū)域較少，接觸成骨更明顯；微弧氧化涂層組骨長(zhǎng)入面積率及骨結(jié)合率均高于對(duì)照組 （均P< 0.05），說(shuō)明微弧氧化TiO2涂層能明顯促進(jìn)骨愈合，具有良好的骨誘導(dǎo)能力，使骨組織快速沉積到種植體表面，從而促進(jìn)骨質(zhì)礦化和改建，與以往研究［14-15］結(jié)果一致。

綜上所述，EBM 3D 打印技術(shù)可制作出與目標(biāo)牙形態(tài)完全一致的鈦種植體，微弧氧化涂層可促進(jìn)3D 打印個(gè)性化鈦種植體骨愈合。微弧氧化涂層個(gè)性化鈦種植體可作為一種性能優(yōu)良的種植體在口腔種植修復(fù)中應(yīng)用。本研究樣本量較小，微弧氧化涂層促進(jìn)3D 打印個(gè)性化鈦種植體骨愈合的具體機(jī)制尚未明確，今后需進(jìn)一步論證。