糙皮側(cè)耳PoEgt2基因克隆及不同發(fā)酵時期表達(dá)水平分析

田 緣,潘 鈺,于 沖,夏海華,胡基華,毛 雪,閆更軒

黑龍江省科學(xué)院微生物研究所,黑龍江哈爾濱 150010)

糙皮側(cè)耳(Pleurotusostreatus)又名平菇,為側(cè)耳科側(cè)耳屬真菌,是一種價廉、味美、質(zhì)優(yōu)的食藥兼用真菌[1],除含豐富的營養(yǎng)物質(zhì)外,還具有抗氧化[2]、降血糖[3]、抗腫瘤[4]等多種藥物功效。糙皮側(cè)耳能產(chǎn)生豐富的生物活性代謝產(chǎn)物,包括甾體類、酚類等次生代謝產(chǎn)物及氨基酸、多糖等多種初生代謝產(chǎn)物[5-7],是洛伐他汀、木聚糖酶等多種活性物質(zhì)的重要生產(chǎn)來源[8]。

作為糙皮側(cè)耳合成的重要次級代謝產(chǎn)物,麥角硫因具有抗衰老、抗氧化、抗炎癥、延長細(xì)胞生存周期、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞形成等多種功效[9-12]。由于麥角硫因制備成本較高,因此其應(yīng)用大多局限于高端化妝品和營養(yǎng)補充劑中。通過生物合成法制備麥角硫因具有原料易獲取、產(chǎn)量可提升等優(yōu)勢,生產(chǎn)菌種的選擇對于麥角硫因的制備至關(guān)重要[13]。研究發(fā)現(xiàn),通過糙皮側(cè)耳發(fā)酵生產(chǎn)麥角硫因的水平可達(dá)0.2 g/L以上[14],但其發(fā)酵產(chǎn)量仍有提升的空間。盡管糙皮側(cè)耳在生產(chǎn)麥角硫因上具有一定優(yōu)勢,但糙皮側(cè)耳中麥角硫因的合成關(guān)鍵酶基因尚不明確。結(jié)合已有研究,推測為可編碼具有甲基轉(zhuǎn)移酶與亞砜合酶活性的雙功能酶EGT1與PLP結(jié)合型C-S裂解酶EGT2[15]。筆者擬利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴增糙皮側(cè)耳的PoEgt2基因,通過采用生物信息學(xué)方法進(jìn)行序列功能分析,并探究其在糙皮側(cè)耳不同發(fā)酵階段的基因表達(dá)情況,旨在為高產(chǎn)麥角硫因的糙皮側(cè)耳菌種改良提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種。糙皮側(cè)耳選育自黑龍江省科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心“黑威平菇1號”。

1.1.2試劑和儀器。馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基購自海博生物技術(shù)有限公司,總RNA提取試劑盒、無縫克隆試劑盒購自Tiangen公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT Reagent Kit及PCR試劑盒PremixTaq購自Takara公司,DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購自康為世紀(jì)有限公司,SOC培養(yǎng)基、氨芐青霉素購自索萊寶公司,克隆載體pMD19-T購自Takara公司,引物合成及測序服務(wù)由上海生工生物工程有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1糙皮側(cè)耳的全基因組測序。糙皮側(cè)耳培養(yǎng)選用馬鈴薯葡萄糖水液體培養(yǎng)基,挑取“黑威平菇1號”斜面菌種約 1 cm2接種至液體培養(yǎng)基,25 ℃160 r/min搖瓶培養(yǎng)5～7 d至可見明顯菌絲。糙皮側(cè)耳菌種的全基因組測序委托上海生工生物有限公司完成。

1.2.2基因的克隆。通過對糙皮側(cè)耳基因組進(jìn)行分析,篩選到一個egt2基因。使用Prime Premier 6.0軟件設(shè)計蛋白編碼區(qū)(CDS)全長引物,并委托上海生工生物有限公司合成。引物序列為F(5′-atgctacagtacttttcatttgagc-3′)、R(5′-ctagtccgcgaagaacttcga-3′),提取糙皮側(cè)耳總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA作為模板,PCR擴增獲得egt2全長。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性3 min,94 ℃變性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,35個循環(huán);最后72 ℃終延伸5 min。

PCR產(chǎn)物通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測,經(jīng)膠回收純化后,連接至pMD19-T克隆載體上。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中,于含氨芐青霉素的SOC瓊脂平板上培養(yǎng),挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定,陽性菌落送至生工生物工程有限公司完成測序。

1.2.3生物信息學(xué)分析?；虻拈_放閱讀框。用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測基因編碼蛋白的分子量和等電點等;利用ProtScale軟件(https://web.expasy.org/protscale/)分析氨基酸序列的疏/親水性;利用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)繪制蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)圖;利用NCBI的BLASTP(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)完成蛋白質(zhì)的同源性分析。

1.2.4qRT-PCR檢測PoEgt2在不同發(fā)酵時期的表達(dá)模式。利用試劑盒分別提取糙皮側(cè)耳不同發(fā)酵時期(2、4、6、8、10 d)的菌絲體總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,然后利用qRT-PCR檢測PoEgt2基因在不同發(fā)酵條件下的表達(dá)量。qRT-PCR的引物為qF(5′-TTCGCCTTACCTGAGTGTCTGTG-3′)、qR(5′-GCAATAGTCGTTGATCGCCTGTTC-3′),以糙皮側(cè)耳β肌動蛋白(β-actin)基因作為內(nèi)參基因,參照Takara TB GREEN I試劑盒說明書,利用ABI Step-one熒光定量PCR儀進(jìn)行擴增。qRT-PCR反應(yīng)條件為:95 ℃變性10 min;95 ℃變性15 s,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸40 s,40個循環(huán)。基因相對表達(dá)量根據(jù)2-ΔΔCt方法計算。

2 結(jié)果與分析

2.1PoEgt2基因克隆提取糙皮側(cè)耳菌絲體的總RNA,以糙皮側(cè)耳“黑威1號”菌絲體提取的RNA反轉(zhuǎn)錄合成的 cDNA 為模板,以PoEgt2-F和PoEgt2-R為引物擴增獲得約1 600 bp的目的片段(圖1),PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后,與pMD19-T克隆載體連接,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)中。轉(zhuǎn)化菌涂布于平板后,挑取單菌落進(jìn)行測序分析,結(jié)果顯示該片段大小為1 641 bp,編碼氨基酸546個(圖2)。

注:M.Marker;1～4. PoEgt2基因PCR產(chǎn)物。Note: M. Marker; 1-4. PoEgt2 gene PCR product.圖1 糙皮側(cè)耳PoEgt2擴增凝膠電泳圖Fig.1 The identification results of PCR of PoEgt2

圖2 PoEgt2基因序列和蛋白質(zhì)序列Fig.2 PoEgt2 gene sequence and protein sequence

2.2PoEgt2基因生物信息學(xué)分析PoEgt2編碼蛋白質(zhì)的理化分析結(jié)果表明,推測分子質(zhì)量為60.48 kD,其理論等電點為8.13,脂肪指數(shù)為90.37,親水性的平均值是-0.030;帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)是44,帶正電荷的殘基總數(shù)為48,不穩(wěn)定性指數(shù)(Ⅱ)為51.36,該蛋白為不穩(wěn)定蛋白,未預(yù)測到跨膜區(qū)和信號肽。用ProtScale在線程序?qū)ζ溆H疏水性、蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測,推測其為親水性蛋白(圖3),其二級結(jié)構(gòu)由40.82% α-螺旋、19.85% β-折疊構(gòu)象延伸鏈和33.15%無規(guī)則卷曲組成(圖4)。SWISS-MODEL構(gòu)建的EGT2蛋白的三級結(jié)構(gòu)(圖5),可見糙皮側(cè)耳EGT2蛋白與已報道的來源于粗糙脈孢霉的C-S裂解酶EGT2相似度為29.93%。

圖3 EGT2蛋白親疏水性預(yù)測結(jié)果Fig.3 Predicted hydrophobicity and hydrophilicity properties of EGT2 protein

圖4 EGT2蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果Fig.4 Predicted secondary structure of EGT2 protein

圖5 EGT2蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果Fig.5 Predicted tertiary structure of EGT2 protein

在NCBI上利用BLASTP對糙皮側(cè)耳的EGT2氨基酸序列進(jìn)行同源序列分析,選擇不同物種同源性較高的序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn),與其同源性最高的是側(cè)耳屬下的真菌,如白黃側(cè)耳(KAG9224528.1,62.45%),刺芹側(cè)耳(KAF9493115.1,57.88%),而同源性最高的非側(cè)耳屬菌為白蛋巢屬的平滑白蛋巢菌(TFK33142.1,40.58%)。然而,對PoEgt2的BLASTN結(jié)果顯示,與其他屬的真菌序列相似性較低。

2.3PoEgt2在不同發(fā)酵時期的表達(dá)模式為探究PoEgt2在糙皮側(cè)耳發(fā)酵生產(chǎn)麥角硫因不同時期的表達(dá)情況,使用qRT-PCR方法對其進(jìn)行定量分析(圖6),結(jié)果發(fā)現(xiàn),PoEgt2在糙皮側(cè)耳發(fā)酵4 d時表達(dá)量最高,而在糙皮側(cè)耳發(fā)酵10 d時表達(dá)量最低,且從發(fā)酵4 d開始,PoEgt2的表達(dá)水平隨時間的延長逐漸下降。

圖6 PoEgt2在糙皮側(cè)耳生產(chǎn)麥角硫因不同發(fā)酵時期的表達(dá)模式Fig.6 Expression levels of PoEgt2 in the production of ergothioneine from Pleurotus ostreatus at different fermentation stages

3 結(jié)論與討論

麥角硫因是一類具有較強抗氧化活性的次級代謝產(chǎn)物,主要來源于大型真菌和部分原核細(xì)菌,現(xiàn)已應(yīng)用于保健食品和高端化妝品中,具有較強的市場潛力[16]。當(dāng)前麥角硫因的獲取來源主要為食用菌的子實體,但原材料制備和分離成本高昂,不宜進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化[17]。工業(yè)化生物發(fā)酵有望成為麥角硫因的主流生產(chǎn)方式,然而麥角硫因的生物合成途徑相對復(fù)雜,不同物種的合成方式有較大差異[18],且由于麥角硫因主要存在于大型食用菌中,后者作為底盤菌株進(jìn)行遺傳改造的難度較大,發(fā)酵周期長,進(jìn)一步限制了麥角硫因的低成本規(guī)模化生產(chǎn)[19]。糙皮側(cè)耳是能夠合成麥角硫因的常見食用菌之一,其培養(yǎng)成本低,未經(jīng)改造發(fā)酵水平即可達(dá)到102 mg/L(培養(yǎng)4 d),因此有作為底盤菌株進(jìn)行改良生產(chǎn)麥角硫因的潛力[20]。據(jù)報道,麥角硫因的合成主要涉及Egt1和Egt2兩個關(guān)鍵酶,在Fe2+和O2存在的條件下,Egt1催化組氨酸甜菜堿和半胱氨酸合成組氨酸甜菜堿半胱氨酸亞砜,再由Egt2催化組氨酸甜菜堿半胱氨酸亞砜轉(zhuǎn)化為麥角硫因[21]。該研究主要進(jìn)行了PoEgt2基因的克隆、生物信息學(xué)和表達(dá)水平分析,以期為后期糙皮側(cè)耳的菌種改良提供基因資源和科學(xué)依據(jù)。

該研究從糙皮側(cè)耳內(nèi)克隆獲得了PoEgt2基因,生物信息學(xué)分析顯示編碼546個氨基酸,編碼蛋白的分子質(zhì)量為60.48 kD。理論等電點為8.13,為親水性蛋白,且未預(yù)測到跨膜區(qū)或信號肽。二級結(jié)構(gòu)由40.82% α-螺旋、19.85% β-折疊構(gòu)象延伸鏈和33.15%無規(guī)則卷曲組成,由于信號肽是分泌性蛋白的決定性因子,結(jié)合Egt2生物學(xué)功能,故推測Egt2為非分泌性蛋白。糙皮側(cè)耳Egt2蛋白和粗糙脈孢霉的C-S裂解酶Egt2相似度為29.93%,推測其生物學(xué)活性存在差異。通過BLASTP對Egt2蛋白進(jìn)行比對分析發(fā)現(xiàn),來源于糙皮側(cè)耳的蛋白序列和其他側(cè)耳屬Egt2蛋白同源性較高,而與非側(cè)耳屬菌的Egt2蛋白同源性較低。糙皮側(cè)耳的發(fā)酵生長時期對Egt2的表達(dá)存在影響,其中在糙皮側(cè)耳發(fā)酵4 d時表達(dá)量最高,隨后逐漸下降,反映麥角硫因在不同發(fā)酵時期的合成速率可能存在差異,后續(xù)將對底物利用率、組氨酸甜菜堿半胱氨酸亞砜水平進(jìn)行測定,以明確麥角硫因的最佳合成時期,為發(fā)酵條件的優(yōu)化提供科學(xué)依據(jù)。