外源激素對仙茅未成熟種子愈傷組織誘導不定芽分化的影響

蘇 艷,楊寶明,楊超振,李永平,李迅東,尹可鎖

1.云南省農(nóng)業(yè)科學院花卉研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部花卉產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(昆明)/國家觀賞園藝工程技術研究中心/云南云科花卉有限公司,云南昆明 650100;2.云南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所/云南省農(nóng)業(yè)跨境有害生物綠色防控重點實驗室,云南昆明 650205;3.云南省農(nóng)業(yè)科學院熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所,云南元謀 651300)

仙茅(CurculigoorchioidesGaertn.)為石蒜科(Amaryllidacean)仙茅屬(CurculigoGaertn.)多年生草本植物,野生資源主要分布于四川、貴州、云南、廣西、廣東等省區(qū)[1-2]。仙茅以根莖入藥,藥用歷史悠久,為我國傳統(tǒng)中藥材,具有藥用和開發(fā)利用價值[3-5]。近年來,隨著對仙茅藥用價值的深入了解及開發(fā)利用的增加,市場需求量逐漸加大。然而,仙茅尚未形成規(guī)模化人工種植,主要依賴挖掘野生資源,導致野生資源遭到嚴重破壞,瀕臨枯竭。開展仙茅組織培養(yǎng)技術研究,既可保護野生自然資源,又可為大規(guī)模人工種植提供優(yōu)良種苗,實現(xiàn)野生資源的合理開發(fā)利用。

關于仙茅的組織培養(yǎng)研究較少,張萍等[5-6]用莖段,張虹等[7-9]、羅春梅等[10-11]、鄒璐等[12-13]、王任翔等[14]、彭海峰等[15]和吳果團[16]都是用幼葉,在外植體的選擇上主要集中在葉片和莖方面。利用細胞全能性在控制嚴格的條件下培育出來的新個體,對技術和環(huán)境設備要求較高,而種子作為外植體具有易獲得數(shù)量較多的外植體、耐消毒、操作簡單等優(yōu)勢,但有關種子作為外植體方面的組織培養(yǎng)研究尚未見報道。筆者以仙茅未成熟種子為外植體,通過愈傷組織誘導、不定芽分化實現(xiàn)植株再生,以期為仙茅組培快繁技術提供了一種新方法。

1 材料與方法

1.1 材料仙茅采自云南玉溪市易門縣浦貝彝族鄉(xiāng)草箐村。

1.2 方法

1.2.1外植體選擇。晴天,選擇生長健壯、長勢良好無病蟲害植株未成熟種子。

1.2.2外植體滅菌。自來水下將種子表面沖洗干凈,然后在無菌工作臺內(nèi),先用75%乙醇溶液浸種子30 s,再用0.1%的氯化汞溶液滅菌6～8 min,用無菌水沖洗3～4次,無菌濾紙吸干表面水分備用。然后用手術刀去除種皮。

1.2.3培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。分為A組(愈傷組織誘導培養(yǎng)基)和B組(不定芽分化培養(yǎng)基)(表1)。A1,MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L;A2,MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L;A3,MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L;A4,MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L;A5,MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L;A6,MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L;A7,MS+6-BA 3.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L;B1,MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L;B2,MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L;B3,MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L;B4,MS+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L;B5,MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L;B6,MS+KT 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L;B7,MS+KT 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L;B8,MS+KT 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L。

表1 不同處理對愈傷組織的影響

以上培養(yǎng)基均為MS+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L;培養(yǎng)基pH 5.8～6.0;培養(yǎng)室溫度(25±2)℃;光照時間12 h/d;光照強度1 600～2 000 lx。

1.2.4愈傷組織誘導。用手術刀去除種皮,接種到A組培養(yǎng)表面,每處理接種3瓶,每瓶接種3粒種子,3次重復。接種10 d后,每隔10 d觀察一次生長情況,40 d后統(tǒng)計出愈率。

1.2.5不定芽分化。將培養(yǎng)得到的愈傷組織切割成0.5 cm2左右的小塊,接種到B組培養(yǎng)基中,每處理接種3瓶,每瓶接種1塊,3次重復。每隔10 d觀察一次生長情況,30 d后統(tǒng)計不定芽分化率。

1.3 數(shù)據(jù)分析利用Excel對試驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。出愈率=分化成愈傷組織的外植體數(shù)/外植體接種數(shù)×100%;增殖系數(shù)=愈傷組織產(chǎn)生的不定芽數(shù)/接種愈傷組織數(shù)。

2 結果與分析

2.1 愈傷組織的誘導及生長情況從表1可以看出,A組7種不同濃度的6-BA和NAA愈傷組織的誘導培養(yǎng)基,經(jīng)差異性分析P=1.976 95E-06<0.05,達顯著水平,說明A組7種誘導培養(yǎng)基對愈傷組織的誘導及生長情況存在顯著差異。7種不同濃度的6-BA和NAA配合使用,可以影響愈傷組織的誘導及愈傷組織的質(zhì)量。6-BA和NAA 7個濃度誘導培養(yǎng)基與出愈率之間的相關系數(shù)達0.953 432 844,說明6-BA和NAA濃度與出愈率之間呈良好的正相關,由此可知,6-BA和NAA濃度的增加,愈傷組織誘導率也隨之提高,出愈時間縮短,出愈量加大。高濃度的6-BA和NAA配合施用,更有利于愈傷組織的誘導。在相同6-BA濃度下,NAA 0.5 mg/L(平均出愈率62%)的誘導效果明顯優(yōu)于NAA 0.2 mg/L(平均出愈率48%)。當6-BA濃度為3.5 mg/L、NAA濃度為0.5 mg/L時,出愈量最大,出愈率最高,達81%,但存在愈傷組織水漬狀、質(zhì)地松散等問題,不利于不定芽的分化。因此,愈傷組織誘導培養(yǎng)基以A6(MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L)較好。

2.2 6-BA和KT對不定芽分化及增殖的影響對B組8種不同濃度的6-BA、KT和0.2 mg/L NAA不定芽分化培養(yǎng)基進行處理,經(jīng)差異性分析P= 0.001 308 535(<0.05),達顯著水平,說明B組8種培養(yǎng)基對不定芽分化及增殖的影響存在顯著差異。表明不同濃度6-BA、KT與0.2 mg/L NAA配合施用,均能使愈傷組織分化出不定芽。不定芽分化數(shù)量和時間,隨著6-BA和KT濃度的增加而提高。當6-BA濃度達2.5 mg/L時,不定芽的分化數(shù)量降低,說明高濃度的6-BA對不定芽的分化和形成有抑制作用。另外,6-BA對不定芽的分化和形成的促進作用優(yōu)于KT,不定芽分化早,生長快,增殖系數(shù)高,提早3～5 d分化出苗,其中以MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L的培養(yǎng)基,不定芽分化最早,增殖系數(shù)達11.7%(表2)。其增殖培養(yǎng)效果見圖1。

圖1 仙茅增殖培養(yǎng)效果Fig.1 Proliferation culture effect of Curculigo orchioides Gaertn.

表2 不同處理對不定芽分化及增殖的影響

3 討論

誘導愈傷組織成敗的關鍵是所使用激素成分和濃度。生長素和細胞分裂素對誘導愈傷組織的產(chǎn)生及促進迅速生長是必需的[17]。在愈傷組織誘導中,當6-BA和NAA濃度配比發(fā)生變化時,誘導出的愈傷組織數(shù)量和質(zhì)量也隨之改變。愈傷組織的數(shù)量和質(zhì)量,隨著6-BA和NAA濃度的增加而提高。當6-BA濃度為3.5 mg/L、NAA濃度為0.5 mg/L時,出愈率最高,達81%,但愈傷組織呈水漬狀,質(zhì)地松散,說明激素濃度偏高;在不定芽的分化培養(yǎng)中,在相同濃度情況下,添加6-BA的處理較KT的處理,平均提早3～5 d分化出不定芽,增殖系數(shù)高,最高增殖系數(shù)達11.7,說明6-BA的促進作用大于KT。當6-BA濃度達2.5 mg/L時,不定芽的分化數(shù)量降低,說明6-BA濃度偏高,抑制了不定芽的分化和形成,導致高頻率的變異[18-21]。

外源激素的種類和濃度對植物器官的脫分化和再分化起決定性的作用。激素的種類、濃度和組合配比,是直接影響愈傷組織誘導、愈傷組織的形態(tài)結構以及不定芽分化的關鍵因素。不同的愈傷組織類型,其分化能力均不相同,只有質(zhì)地致密的愈傷組織才具有較強的分化能力[22]。

在仙茅的組織培養(yǎng)及快繁體系構建中,褐變現(xiàn)象是一個主要問題,影響褐變現(xiàn)象的因素很多,但酚污染是主要原因之一,在組織培養(yǎng)過程中,損傷細胞中酚類物質(zhì)被氧化成醌,變成棕褐色或暗褐色而發(fā)生褐變[23]。此外,黑暗培養(yǎng)有利于減輕仙茅外植體的酚污程度[24-25]。下一步將進一步研究不同方法對仙茅未成熟種子愈傷組織誘導組培褐變的影響,更有效地減輕外植體的褐變現(xiàn)象。

4 結論

該試驗結果表明,仙茅未成熟種子的最佳愈傷組織誘導培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L,出愈率為74%;最佳不定芽分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L,平均增殖系數(shù)達11.7。