楓香葉片變色期全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析

劉雄盛 尹國平 肖玉菲 蔣燚 王仁杰 黃榮林 姜英 王勇

摘?要：楓香因其樹形優(yōu)美，入秋后葉色紅艷或橙黃，極具觀賞價(jià)值，是優(yōu)良的景觀生態(tài)樹種。為了解楓香葉片變色及其次級(jí)代謝過程的遺傳基礎(chǔ)，該文以楓香5個(gè)葉片變色期葉片混合樣品為材料，利用單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)（PacBio平臺(tái)）對(duì)其進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。結(jié)果表明：（1）全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共獲得41.04 Gb的高質(zhì)量數(shù)據(jù)，從中鑒定出全長(zhǎng)非嵌合序列563 180條，通過聚類和去冗余，獲得27 269條高質(zhì)量全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本。在27 269條全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本中預(yù)測(cè)到2 035條長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA），并檢測(cè)出14 892個(gè)簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）位點(diǎn)和1 856個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。（2）基因注釋結(jié)果表明，NR、GO、COG、KEGG 等8個(gè)數(shù)據(jù)庫共注釋了24 857條轉(zhuǎn)錄本，KEGG數(shù)據(jù)庫共獲得了124個(gè)條代謝途徑，主要有核糖體、碳代謝、氨基酸生物合成等，在類黃酮和葉綠素代謝途徑中分別有49和71個(gè)轉(zhuǎn)錄本參與。上述結(jié)果初步揭示了楓香葉片變色期轉(zhuǎn)錄組信息以及功能特性，為后續(xù)研究楓香葉片變色分子機(jī)制、色素代謝合成途徑和調(diào)控、相關(guān)功能基因克隆以及葉色改良提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞： 楓香， 葉片變色期， 單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)， 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組， 基因功能注釋

中圖分類號(hào)：Q781

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2023）09-1710-11

收稿日期：2022-06-04

基金項(xiàng)目：廣西優(yōu)良用材林資源培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自主課題（2019-A-03-02）；廣西林業(yè)科技推廣示范項(xiàng)目（桂林科研 ［2021］26號(hào)）。

第一作者： 劉雄盛（1988-），碩士，副研究員，主要從事林木遺傳育種研究，（E-mail）517261654@qq.com。

*通信作者：王勇，碩士，高級(jí)工程師，主要從事森林生態(tài)研究，（E-mail）12084474@qq.com。

Sequencing and analysis of full-length transcriptome from

Liquidambar formosana leaves in discoloration stage

LIU Xiongsheng， YIN Guoping， XIAO Yufei， JIANG Yi， WANG Renjie，

HUANG Ronglin， JIANG Ying， WANG Yong*

（ Guangxi Key Laboratory of Superior Trees Resource Cultivation， Guangxi Zhuang

Autonomous Region Forestry Research Institute， Nanning 530002， China ）

Abstract：Liquidambar formosana is an excellent landscape ecological tree species because its beautiful tree shape and red or orange leaves in autumn. In order to understand the genetic basis of discoloration and secondary metabolism of L. formosana leaves， the mixed samples of L. formosana leaves in five leaf discoloration stages were used for full-length transcriptome sequencing using single-molecule real-time sequencing technology （PacBio platform）. The results were as follows： （1） High-quality 41.04 Gb data were obtained by full-length transcriptome sequencing， from which 563 180 full-length non-chimeric sequences were identified， and 27 269 high-quality full-length transcripts were obtained by clustering and de-redundancy. In 27 269 full-length transcripts， 2 035 long-chain non-coding RNA （lncRNA） were predicted， and 14 892 simple sequence repeat （SSR） sites and 1 856 transcription factors were detected. （2） The results of gene annotation showed that a total of 24 857 transcripts were annotated in eight databases such as NR， GO， COG and KEGG， etc.， 124 metabolic pathways were obtained in KEGG database， including ribosome， carbon metabolism， amino acid biosynthesis and so on， and 49 and 71 transcripts were involved in flavonoid and chlorophyll metabolism respectively. The above results preliminarily reveal the transcriptome information and functional characteristics of L. formosana leaves during the leaf discoloration stage， and provide basic data for the follow-up study of the molecular mechanism of leaf discoloration， the pathway and regulation of pigment metabolism and synthesis， the cloning of related functional genes and the improvement of leaf color.

Key words： Liquidambar formosana， leaf discoloration stage， single-molecule real-time sequencing technology， full-length transcriptome， gene function annotation

隨著人們對(duì)觀賞植物需求的日益增加，彩葉樹種因其色相豐富、色澤艷麗、觀賞價(jià)值高等特點(diǎn)備受關(guān)注（王振興等，2016）。彩葉樹種葉色變化機(jī)制及其影響因素也隨之成了研究的熱點(diǎn)（李衛(wèi)星等，2017）。近年來，學(xué)者們對(duì)彩葉樹種葉色變化做了大量研究，研究?jī)?nèi)容逐漸從葉片變色過程中表型形態(tài)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化（杜文文等，2019；梁玲等，2020）、生態(tài)適應(yīng)意義（Menzies et al.， 2016；陳穎卓和黃至歡，2016）和生理生化特征（Junker & Ensminger， 2016；馮露等，2017；趙東輝等，2019）到葉色變化分子調(diào)控機(jī)制（陸小雨等，2020；Gao et al.， 2021）。葉片內(nèi)葉綠素、花青素、類胡蘿卜素等色素含量變化是彩葉植物葉色變化的直接原因（Jiang et al.， 2016；李衛(wèi)星等，2017）。目前，葉色變化分子機(jī)制研究主要集中在葉綠素、類胡蘿卜素和花青素等色素合成與調(diào)控有關(guān)基因、轉(zhuǎn)錄因子、miRNA（MicroRNA）及其靶基因的表達(dá)模式和功能等方面（Guan et al.， 2014；Yang et al.， 2015；Li et al.， 2015；Gao et al.， 2020），為植物葉色形成的遺傳和基因組研究、葉色調(diào)控以及彩葉植物資源開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

楓香（Liquidambar formosana）隸屬金縷梅科（Hamamelidaceae）楓香樹屬（Liquidambar），為落葉喬木，主要分布于中國秦嶺和淮河以南各省（區(qū)）海拔1 000 m以下的低山次生林內(nèi)，在越南北部、老撾和朝鮮南部亦有分布（黃寧等，2021）。楓香適應(yīng)性強(qiáng)，天然易更新，適宜紅、黃壤土，有荒山先鋒樹種之稱（羅紫東等，2016）。入秋后，楓香葉片逐漸變?yōu)榧t色或橙黃，極具觀賞價(jià)值（王冬雪等，2017），然而，在不同區(qū)域楓香葉色表現(xiàn)差異較大，具明顯區(qū)域性，推測(cè)楓香葉色可能具有特異的調(diào)控機(jī)制。目前，對(duì)于楓香葉色變化的研究主要集中在葉色變化過程中的光合作用（羅紫東等，2016）、色素含量（劉儒等，2017；王冬雪等，2019）等生理生化方面。在分子生物學(xué)方面，Wen等（2014）利用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)楓香秋葉衰老時(shí)基因表達(dá)譜進(jìn)行了研究，并對(duì)秋季變色和葉片衰老過程中可能的基因調(diào)控進(jìn)行了討論。然而，由于二代測(cè)序技術(shù)讀取序列短，拼接時(shí)無法提供長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，且會(huì)丟失可變剪接等重要信息。因此，目前，對(duì)于楓香葉片變色分子機(jī)制的研究仍然缺乏遺傳信息，限制了楓香葉色資源的開發(fā)利用。

PacBio單分子實(shí)時(shí)（single-molecule real-time， SMRT）測(cè)序技術(shù)測(cè)序讀長(zhǎng)遠(yuǎn)超Illumina等二代測(cè)序技術(shù)，因此可以對(duì)完整的mRNA直接進(jìn)行從頭測(cè)序，從而得到轉(zhuǎn)錄本的全長(zhǎng)信息，具有發(fā)現(xiàn)更多可變剪切序列和新功能基因，改善基因組注釋，鑒定更多的長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long-chain non-coding RNA， lncRNA）以及準(zhǔn)確定位融合基因等特點(diǎn)（Tian et al.， 2018；夏麗飛等，2020），廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄組學(xué)、表觀遺傳學(xué)和大型基因組組裝等領(lǐng)域（趙陸滟等，2019；吳志銘等，2020）。夏麗飛等（2020）利用PacBio單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)獲得紫鵑茶樹（Camellia sinensis var.asssamica）全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本信息，為其變色機(jī)制研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。Jia等（2020）對(duì)高山杜鵑（Rhododendron lapponicum）進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得75 002個(gè)高質(zhì)量全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，為其花色形成機(jī)制研究提供參考。本研究通過PacBio的單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)進(jìn)行楓香葉片變色期全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲取高質(zhì)量全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分析和功能注釋，旨在為后續(xù)研究楓香葉片變色分子機(jī)制、色素代謝合成途徑和調(diào)控、相關(guān)功能基因的克隆以及葉色改良提供遺傳基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

楓香葉片變色期材料采自廣西壯族自治區(qū)百色市德?？h紅葉森林公園（23°21′19″ E、106°39′5″ N），采用平均木法，選取5株生長(zhǎng)健壯的楓香植株。在每株楓香樹上選取東、南、西、北4個(gè)方向的枝條做好標(biāo)記，自2018年9月底開始，每15～20 d采集樣品1次，每次采樣時(shí)在每株楓香的每個(gè)枝條上采集5片完整葉片進(jìn)行混合，共采集了5次樣品。各時(shí)期葉片顏色如圖1所示。

1.2 RNA提取和cDNA文庫構(gòu)建

采用Trizol試劑提取楓香各時(shí)期葉片樣品的總RNA（ribonucleic acid），用1.2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA降解和污染情況。使用NanoDrop 2000分光光度計(jì)測(cè)量RNA的純度、濃度和吸收峰。進(jìn)一步用Aligent Bioanalyzer 2100檢測(cè)RNA質(zhì)量。RNA檢測(cè)合格后，取各時(shí)期28S/18S＞1，且RIN＞6.5的RNA 等量混合，使用SMARTerTM PCR cDNA Synthesis Kit合成mRNA（messenger RNA）的全長(zhǎng)cDNA（complementary DNA），通過PCR（polymerase chain reaction）擴(kuò)增放大全長(zhǎng)cDNA進(jìn)行末端修復(fù)，并連接SMRT啞鈴型接頭進(jìn)行核酸外切酶消化，獲得一個(gè)1～6 kb的文庫。在Pacific Bioscience RS II平臺(tái)上進(jìn)行SMRT測(cè)序（委托百邁客生物科技有限公司）。

1.3 測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制和序列聚類

將原始序列中長(zhǎng)度小于50 bp的片段和準(zhǔn)確性小于0.90的序列過濾，獲取到過濾后的測(cè)序數(shù)據(jù)。根據(jù)序列中的接頭，將序列轉(zhuǎn)換成環(huán)形一致序列CCS（circular con-sensus），再根據(jù)CCS判斷是否有3′引物、5′引物以及PolyA，將序列分成全長(zhǎng)和非全長(zhǎng)序列。將來自同一轉(zhuǎn)錄本的全長(zhǎng)序列聚類，相似的聚成一簇，每個(gè)簇得到一條一致序列，校正后，獲得用于后續(xù)分析的高質(zhì)量序列（丁玉梅等，2020）。

1.4 轉(zhuǎn)錄組完整性評(píng)估和結(jié)構(gòu)分析

使用CD-HIT（Cluster Database at High Identity with Tolerance）軟件去除轉(zhuǎn)錄本中的冗余序列，獲得非冗余轉(zhuǎn)錄本序列；利用BUSCO（Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs）對(duì)去冗余后的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行完整性評(píng)估；使用TransDecoder軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本編碼區(qū)序列及對(duì)應(yīng)氨基酸序列預(yù)測(cè)；利用CPC（Coding Potential Calculator）分析、CNCI（Coding-Non-Coding Index）分析、Pfam（Protein Families）蛋白結(jié)構(gòu)域分析、CPAT（Coding Potential Assessment Tool）分析4種方法預(yù)測(cè)lncRNA；篩選500 bp以上的轉(zhuǎn)錄本，利用MISA（MIcroSAtellite identification tool）軟件做SSR（simple sequence repeat）分析。

1.5 轉(zhuǎn)錄本功能注釋

使用BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）軟件將得到的非冗余轉(zhuǎn)錄本序列與NR（Non-Redundant Protein Sequence Database）、Swiss-Prot（Swiss-Prot Protein Sequence Database）、GO（Gene Ontology）、COG（Clusters of Orthologous Groups of Proteins）、KOG（Clusters of Orthologous Groups for Eukaryotic Complete Genomes）、eggNOG（Evolutionary Genealogy of Genes： Non-supervised Orthologous Groups Database）、Pfam、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，獲得轉(zhuǎn)錄本的注釋信息（鄒智等，2021）；利用iTAK（Plant Transcription Factor & Protein Kinase Identifier and Classifier）軟件鑒定轉(zhuǎn)錄因子。

2?結(jié)果與分析

2.1 楓香葉片變色期全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建

使用2個(gè)SMRT cell進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得41.04 Gb清潔數(shù)據(jù)。從中提取到731 849條CCS，約計(jì)1 178 416 098 bp。CCS平均長(zhǎng)度為1 610 bp（圖2：A），測(cè)序平均深度為46×（圖2：B）。從731 849條CCS中鑒定出全長(zhǎng)非嵌合序列FLNC（full length reads non-chimeric）563 180條，占比為76.95%，其長(zhǎng)度分布如圖2：C所示。對(duì)FLNC進(jìn)行聚類，獲得50 736條一致序列，校正后，共得到50 282條（99.11%）高質(zhì)量一致序列，長(zhǎng)度分布如圖2：D所示。對(duì)獲得的高質(zhì)量一致序列去冗余，得到27 269條全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本。

2.2 編碼區(qū)序列、lncRNA和SSR分析

通過編碼區(qū)序列及對(duì)應(yīng)氨基酸序列的預(yù)測(cè)，共獲得25 408個(gè)開放閱讀框ORF（open reading frame），其中，20 281條ORF是完整的，占比79.57%。lncRNA預(yù)測(cè)分析中，CPC、CNCI、CPAT和Pfam分別預(yù)測(cè)到3 028、2 848、5 132和6 406條lncRNA，2 035條為共有序列（圖3：A）。利用MISA軟件篩選500 bp以上的轉(zhuǎn)錄本，共獲得14 892個(gè)SSR位點(diǎn)，其中單堿基SSR有5 124個(gè)，數(shù)目最多，其平均密度約為每Mb 43.5個(gè)（圖3：B）。

2.3 轉(zhuǎn)錄本功能注釋

8個(gè)數(shù)據(jù)庫的功能注釋結(jié)果顯示（表1），共注釋24 857條序列，占總轉(zhuǎn)錄本的91.15%。在NR注釋的物種中，葡萄（Vitis vinifera）占比最高，為36.39%，其次是可可樹（Theobroma cacao，7.09%）、蓮（Nelumbo nucifera，6.71%）、麻楓樹（Jatropha curcas，3.41%）等（圖4）。

GO注釋的17 535個(gè)轉(zhuǎn)錄本中，包含生物過程（49 314）、細(xì)胞組分（36 008）、分子功能（21 366）3大類51個(gè)亞類。其中，生物過程中代謝過程和細(xì)胞過程占比較高，分別為69.4%和59.1%；細(xì)胞組分中細(xì)胞區(qū)域和細(xì)胞占比較高，分別為47.1%和46.8%；分子功能中催化活性和結(jié)合功能占比較高，分別為53.3%和47.8%（圖5）。

COG注釋中， 一般功能預(yù)測(cè)（20.11%）所占比例最高，其次為轉(zhuǎn)錄（9.34%）、轉(zhuǎn)錄信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制（8.81%）以及復(fù)制、重組和生物發(fā)生（8.29%）等（圖6）。

KEGG數(shù)據(jù)庫中共注釋10 666個(gè)轉(zhuǎn)錄本，根據(jù)代謝途徑分為機(jī)體系統(tǒng)（289）、代謝（6 596）、遺傳信息處理（2 920）、環(huán)境信息處理（304）、細(xì)胞過程（542）5個(gè)一級(jí)代謝通路和18個(gè)二級(jí)代謝通路以及124個(gè)三級(jí)代謝通路（圖7）。其中，碳水化合物代謝（1 919）、翻譯（1 735）、全局和概述圖（1 318）、氨基酸代謝（1 167）以及折疊、分類、降解（1 044）等二級(jí)代謝通路注釋的轉(zhuǎn)錄本較多。三級(jí)代謝通路中核糖體（693）、碳代謝（617）、氨基酸的生物合成（473）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工（437）、剪接體（348）、糖酵解/糖異生（296）、氧化磷酸化（292）、RNA運(yùn)轉(zhuǎn)（269）、光合生物體中的碳固定（239）、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（235）等注釋的轉(zhuǎn)錄本較多。

2.4 轉(zhuǎn)錄因子

使用iTAK軟件共預(yù)測(cè)得到轉(zhuǎn)錄因子1 856個(gè)，分屬159個(gè)基因家族。其中，RLK-Pelle_LRK10L-2家族轉(zhuǎn)錄因子最多，為97個(gè)，其次為RLK-Pelle_DLSV，為66個(gè)。圖8顯示了轉(zhuǎn)錄因子數(shù)排名前20的基因家族。

3?討論與結(jié)論

近年來，SMRT測(cè)序已成為全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組研究的最可靠、有效的策略， 特別是對(duì)于沒有參考基因組序列的非模式植物（潘敏等，2020；鄒智等，2021）。本研究應(yīng)用SMRT測(cè)序技術(shù)，在PacBio RS II平臺(tái)上對(duì)楓香葉片變色期進(jìn)行了研究，總共產(chǎn)生了41.04 Gb的測(cè)序數(shù)據(jù)，從中共提取到731 849條全長(zhǎng)序列，全長(zhǎng)非嵌合序列占76.95%，測(cè)序質(zhì)量較好，能夠滿足后續(xù)挖掘基因信息的需要。SMRT測(cè)序技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)錄本的長(zhǎng)度比下一代高通量測(cè)序技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)錄本的長(zhǎng)度要長(zhǎng)（Jia et al.， 2020）。本研究中，楓香葉片變色期轉(zhuǎn)錄本的平均長(zhǎng)度為1 610 bp，遠(yuǎn)高于Wen等（2014）利用Illumina測(cè)序技術(shù)得到的楓香綠葉和紅葉轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度（165 bp），這說明PacBio SMRT測(cè)序技術(shù)是獲取轉(zhuǎn)錄本序列，特別是獲取長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本序列的有效方法。

lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度大于200 nt的RNA分子，參與調(diào)節(jié)植物的發(fā)育和生長(zhǎng)、次生代謝和植物的逆境反應(yīng)（Liu et al.， 2019）。本研究中，我們用4種方法在楓香變色期全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組中獲得2 035條lncRNAs，這些lncRNAs將為進(jìn)一步研究楓香葉色變化分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。SMRT測(cè)序獲得的轉(zhuǎn)錄本開發(fā)SSR標(biāo)記是一種有效可行的方法（夏麗飛等，2020）。本研究分析楓香葉片變色期全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組，共檢測(cè)到14 892個(gè)SSR位點(diǎn)，單堿基SSR數(shù)量最多。楓香分布范圍廣，抗逆性強(qiáng)，葉片呈色特異。因此，上述SSR位點(diǎn)為楓香遺傳多樣性研究、比較基因組學(xué)研究、基因作圖研究、種群遺傳學(xué)研究和其他類型的遺傳研究提供有價(jià)值的遺傳工具（李文燕等，2020；Wu et al.， 2020）。

在8個(gè)數(shù)據(jù)庫中，有24 857個(gè)楓香葉片變色期轉(zhuǎn)錄本通過序列比對(duì)進(jìn)行了注釋，注釋轉(zhuǎn)錄本比例為91.15%，遠(yuǎn)高于Wend等（2014）利用二代測(cè)序技術(shù)注釋的轉(zhuǎn)錄本比例（56%）。這表明本研究鑒定到大量楓香葉片中的基因。剩下的2 412個(gè)轉(zhuǎn)錄本沒有BLAST匹配，可能代表了楓香葉片特異的基因或未知基因。NR注釋結(jié)果表明，楓香葉片全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組序列信息與葡萄最相似（36.39%），與Wend等（2014）的研究結(jié)果一致。GO、COG和KEGG分類結(jié)果表明，大量轉(zhuǎn)錄本參與轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、重組和修復(fù)，并具有催化活性，具有不同的分子功能，有10 666份轉(zhuǎn)錄本被分配到特定的途徑，參與多種生物學(xué)途徑。因此，我們的研究結(jié)果為進(jìn)一步開展楓香葉色變化的分子研究提供了豐富的遺傳信息。

植物葉片內(nèi)葉綠素、花青素以及類胡蘿卜素含量比例和分布決定了葉片的顏色，而色素代謝主要受結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控（Becker et al.， 2014；李衛(wèi)星等，2017；陳璇等，2020）。相關(guān)研究表明，葉綠素含量降低，花色素苷大量積累是導(dǎo)致楓香葉片變紅的直接原因（劉儒等，2017；Yin at al.， 2022）。前人研究表明，HEMA1（glutamyl-tRNA reductase 1）、CAO（chlorophyllide a oxygenase）等基因是調(diào)控葉綠素合成的重要基因（Wu et al.， 2007），NYC1（nonyellow coloring 1）和NOL（non yellow coloring1-like）基因在葉綠素降解過程中起關(guān)鍵作用（Sato et al.， 2007），HD-Zip、WRKY 和GATA家族的轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控葉綠素含量（An et al.， 2014; 李衛(wèi)星等，2017）。在本研究的葉綠素代謝途徑中，有27個(gè)轉(zhuǎn)錄本被注釋為HEMA（glutamyl-tRNA reductase）、PPOX（protoporphyrinogen oxidase）、CHLD（magnesium chelatase subunit D）、CHLM（magnesium chelatase subunit M）、POR（light-dependent protochlorophyllide reductase）、CAO、NYC1、NOL、HCAR ［7-Hydroxymethylchlorophylla （hmchl） reductase］基因，有17、55、19個(gè)轉(zhuǎn)錄本分別屬于HD-Zip、WRKY 和GATA家族。尤其是在葉綠素降解過程中起關(guān)鍵作用的NYC1和NOL基因，可能是調(diào)控楓香葉片葉綠素含量的關(guān)鍵基因。

C4H（cinnamate 4-hydroxylase）、CHS（chalcone synthase）、F3H（flavanone 3-hydroxylase）、F3′H（flavonoid 3′-hydroxylase）、F3′5′H（flavonoid-3′，5′-hydroxylase）、DFR（dihydroflavonol-4-reductase）和ANS（anthocyanidin synthase）是調(diào)控植物花青素生物合成的關(guān)鍵酶，直接影響花青素合成（許倩等， 2020；Jia et al.， 2020），MYB和bHLH家族的轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)節(jié)花青素生物合成中基因的表達(dá)起著關(guān)鍵作用（劉愷媛等，2021）。本研究中，有49個(gè)轉(zhuǎn)錄本參與類黃酮生物合成途徑，在花青素合成途徑中，有31個(gè)轉(zhuǎn)錄本被注釋為編碼C4H、HCT（shikimic acid/quinic acid hydroxy cinnamyl transferase）、CYP98A（cytochrome P450）、C3′H（p-coumaroyl shikimate/quinate 3′-hydroxylas）、CHS、F3H、CYP75B1（cytochrome P450 75B1）、DFR、ANS的關(guān)鍵基因，有36和46個(gè)轉(zhuǎn)錄本分別屬于MYB和bHLH家族。這些參與葉綠素代謝和花青素生物合成的基因?qū)⒂兄诤罄m(xù)進(jìn)一步理解楓香的葉色調(diào)控機(jī)制。

綜上所述，本研究楓香葉片變色期全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共獲得41.04 Gb的高質(zhì)量數(shù)據(jù)，獲得27 269條高質(zhì)量全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，并注釋了24 857條轉(zhuǎn)錄本，還預(yù)測(cè)到2 035條lncRNA，檢測(cè)出14 892個(gè)SSR位點(diǎn)和1 856個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。初步揭示楓香葉片變色期轉(zhuǎn)錄組信息以及功能特性，為后續(xù)開展楓香葉色變化分子調(diào)控機(jī)制以及葉色改良研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

AN Y， HAN X， TANG S， et al.， 2014. Poplar GATA transcription factor PdGNC is capable of regulating chloroplast ultrastructure， photosynthesis， and vegetative growth in Arabidopsis under varying nitrogen levels ［J］. Plant Cell， 119（2）： 313-327.

BECKER C， KLAERING HP， KROH LW， et al.， 2014. Cool-cultivated red leaf lettuce accumulates cyanidin-3-O-（6-O-malonyl）-glucoside and caffeoylmalic acid ［J］. Food Chem， 146： 404-411.

CHEN YZ， HUANG ZH， 2016. A mini review on adaption of young leaf redness ［J］. Biodivers Sci， 24（9）： 1062-1067.［陳穎卓， 黃至歡， 2016. 紅色幼葉的適應(yīng)意義探討 ［J］. 生物多樣性， 24（9）： 1062-1067.］

CHEN X， XIE J， YUE YZ， et al.， 2020. Advances in research on leaf coloration mechanism of colored leaf plants ［J］. Acta Bot Boreal-Occident Sin， 40（2）： 358-364.［陳璇， 謝軍， 岳遠(yuǎn)征， 等， 2020. 彩葉植物葉片呈色分子機(jī)制研究進(jìn) ［J］. 西北植物學(xué)報(bào)， 40（2）： 358-364.］

DU WW， CUI GF， WANG JH， et al.， 2019. Effects of foliar variegation structure on leaf color in Begonia gulinqingensis ［J］. Guihaia， 39（6）： 812-820.［杜文文， 崔光芬， 王繼華， 等， 2019. 古林箐秋海棠葉斑結(jié)構(gòu)對(duì)葉色的影響 ［J］. 廣西植物， 39（6）： 812-820.］

DING YM， GAO T， BAO HH， et al.， 2020. The identification and key genes analysis of NBS type disease-resistance gene from Cucurbita fcifotia ［J］. Plant Physiol J， 56（9）： 1833-1844.［丁玉梅， 高婷， 暴會(huì)會(huì)， 等， 2020. 黑籽南瓜NBS類抗病基因的鑒別及關(guān)鍵基因分析 ［J］. 植物生理學(xué)報(bào)， 56（9）： 1833-1844.］

FENG L， WU JY， JU YQ， et al.， 2017. Leaf color characteristics and photosynthetic characteristics of purple-leafed Lagerstroemia indica ‘Ebony Ember’ ［J］. J Beijing For Univ， 39（12）： 93-101.［馮露， 吳際洋， 鞠易倩， 等， 2017. 紫葉紫薇呈色生理及光合特性研究 ［J］. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 39（12）： 93-101.］

GAO TM， WEI SL， CHEN J， et al.， 2020. Cytological， genetic， and proteomic analysis of a sesame （Sesamum indicum L.） mutant Siyl-1 with yellow-green leaf color ［J］. Genes Genom， 42（1）： 25-39.

GAO YF， ZHAO DH， ZHANG JQ， et al.， 2021. De novo transcriptome sequencing and anthocyanin metabolite analysis reveals leaf color of Acer pseudosieboldianum in autumn ［J］. BMC Genomics， 22（1）： 383.

GUAN XY， PANG MX， NAH G， et al.， 2014. MiR828 and miR858 regulate homoeologous MYB2 gene functions in Arabidopsis trichome and cotton fibre development ［J］. Nat Commun， 5（1）： 3050-3059.

HUANG N， LIU GN， YANG JS， et al.， 2021. Effects of gibberellin concentration and soaking seed time on seed germination of Liquidambar formosana Hance ［J］. Seed， 40（3）： 97-101.［黃寧， 劉革寧， 楊繼生， 等， 2021. 赤霉素濃度和浸種時(shí)間對(duì)楓香種子萌發(fā)的影響 ［J］. 種子， 40（3）： 97-101.］

JIA XP， TANG L， MEI XY， et al.， 2020. Single-molecule long-read sequencing of the full-length transcriptome of Rhododendron lapponicum L. ［J］. Sci Rep， 10（1）： 6755.

JIANG XR， PENG JG， JIA MX， et al.， 2016. Relationship between leaf reddening， ROS and antioxidants in Buxus microphylla during overwintering ［J］. Acta Physiol Plant， 38： 199.

JUNKER LV， ENSMINGER I， 2016. Relationship between leaf optical properties， chlorophyll fluorescence and pigment changes in senescing Acer saccharum leaves ［J］. Tree Physiol， 36（6）： 694-711.

LI WY， CUI BY， LIU QJ， 2020. Full-length transcriptome sequencing， annotation and SSR prediction of Job’s tears （Coix lachryma-jobi） seedling leaves ［J］. Mol Plant Breed， 18（15）： 4855-4870.［李文燕， 崔百元， 劉勤堅(jiān)， 2020. 薏苡苗期葉片全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、注釋及SSR預(yù)測(cè) ［J］. 分子植物育種， 18（15）： 4855-4870.］

LI WX， YANG XB， HE ZC， et al.， 2017. Research advances in the regulatory mechanisms of leaf coloration ［J］. Acta Hortic Sin， 44（9）： 1811-1824.［李衛(wèi)星， 楊舜博， 何智沖， 等， 2017. 植物葉色變化機(jī)制研究進(jìn)展 ［J］. 園藝學(xué)報(bào)， 44（9）： 1811-1824.］

LI Y， ZHANG ZY， WANG P， et al.， 2015. Comprehensive transcriptome analysis discovers novel candidate genes related to leaf color in a Lagerstroemia indica yellow leaf mutant ［J］. Genes Genom， 37（10）： 851-863.

LIANG L， HUANG YQ， CHEN XH， 2020. Anatomical structure and pigment content of Davidia involucrate leaves and bracts with different colors ［J］. Acta Bot Boreal-Occident Sin， 40（9）： 1539-1548.［梁玲， 黃玉瓊， 陳小紅， 2020. 不同色彩珙桐葉片和苞片解剖結(jié)構(gòu)及色素含量比較研究 ［J］. 西北植物學(xué)報(bào)， 40（9）： 1539-1548.］

LIU KY， WANG ML， XIN HB，et al.， 2021. Anthocyanin biosynthesis and regulate mechanisms in plants： a review ［J］. Chin Agric Sci Bull， 37（14）： 41-51.［劉愷媛， 王茂良， 辛海波， 等， 2021. 植物花青素合成與調(diào)控研究進(jìn)展 ［J］. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)， 37（14）： 41-51.］

LIU R， YUAN QQ， YUAN XP， et al.， 2017. The relationship with change of pigment content in leaves of differentLiquidambar formosana families and change of leaf color ［J］. S Chin For Sci， 45（4）： 46-49.［劉儒， 原勤勤， 袁小平， 等， 2017. 不同楓香家系葉片色素含量變化及其與葉色變化的關(guān)系 ［J］. 南方林業(yè)科學(xué)， 45（4）： 46-49.］

LIU S， WU L， QI HR， et al.， 2019. LncRNA/circRNA-miRNA-mRNA networks regulate the development of root and shoot meristems of Populus ［J］. Ind Crop Prod， 133： 333-347.

LU XY， CHEN Z， TANG F， et al.， 2020. Combined transcriptomic and metabolomic analysis reveals mechanism of anthocyanin changes in red maple （Acer rubrum） leaves ［J］. Sci Silv Sin， 56（1）： 38-54.［陸小雨， 陳竹， 唐菲， 等， 2020. 轉(zhuǎn)錄組與代謝組聯(lián)合解析紅花槭葉片中花青素苷變化機(jī)制 ［J］. 林業(yè)科學(xué)， 56（1）： 38-54.］

LUO ZD， GUAN HD， ZHANG XP， et al.， 2016. Changes in photosynthetic capacity during leaf senescence of Liquidambar formosana ［J］. Chin J Appl Ecol， 27（10）： 3129-3136.［羅紫東， 關(guān)華德， 章新平， 等， 2016. 楓香葉片衰老過程中光合能力的變化 ［J］. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)， 27（10）： 3129-3136.］

MENZIES IJ， YOUARD LW， LORD JM， et al.， 2016. Leaf colour polymorphisms： a balance between plant defence and photosynthesis ［J］. J Ecol， 104（1）： 104-113.

PAN M， YU XD， CAI ZP， et al.， 2020. Transcriptome data analysis of Artocarpus heterophyllus stems and leaves ［J］. Chin J Trop Crop， 41（7）： 1288-1297.［潘敏， 于旭東， 蔡澤坪， 等， 2020. 菠蘿蜜莖葉全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組分析 ［J］. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 41（7）： 1288-1297.］

SATO Y， MORITA R， NISHIMURA M， et al.， 2007. Mendels gene cotyledon gene encodes a positive regulator of the chlorophyll-degrading pathway ［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 104（35）： 14169-14174.

TIAN JY， FENG SJ， LIU YL， et al.， 2018. Single-molecule long-read sequencing of Zanthoxylum bungeanum Maxim. transcriptome： identification of aroma-related genes［J］. Forests， 9（12）： 765-777.

WANG DX， DE YJ， SHI X， et al.， 2017. Change of leaf color of fourLiquidambar formosana families under different environmental conditions ［J］. For Res， 30（3）： 503-510.［王冬雪， 德永軍， 施翔， 等， 2017. 4個(gè)楓香家系在不同環(huán)境下的葉色變化 ［J］. 林業(yè)科學(xué)研究， 30（3）： 503-510.］

WANG DX， SUN HJ， DE YJ， et al.， 2019. Change of leaf color of Liquidambar formosana seedlings under different light quality treatments ［J］. For Res， 32（4）： 158-164.［王冬雪， 孫海菁， 德永軍， 等， 2019. 不同光質(zhì)處理對(duì)楓香幼苗葉色的影響 ［J］. 林業(yè)科學(xué)研究， 32（4）： 158-164.］

WANG ZX， YU YF， CHEN L， et al.， 2016. Advances in leaf pigment composition， structure and photosynthetic characteristics of colored-leaf plants ［J］. Plant Physiol J， 52（1）： 1-7.［王振興，于云飛， 陳麗， 等， 2016. 彩葉植物葉片色素組成、結(jié)構(gòu)以及光合特性的研究進(jìn)展 ［J］. 植物生理學(xué)報(bào)， 52（1）： 1-7.］

WEN CH， LIN SS， CHU FH， 2014. Transcriptome analysis of a subtropical deciduous tree： autumn leaf senescence gene expression profile of Formosan Gum ［J］. Plant Cell Physiol， 56（1）： 163-174.

WU ZM， ZHANG X， HE B， 2007. A chlorophyll deficient rice mutant with impaired chlorophyllide esterification in chlorophyll biosynthesis ［J］. Plant Physiol， 145（1）： 29-40.

WU QC， ZANG FQ， XIE XM， et al.， 2020. Full-length transcriptome sequencing analysis and development of EST-SSR markers for the endangered species Populus wulianensis ［J］. Sci Rep， 10（1）： 16249.

WU ZM， FENG YH， YANG ZQ， 2020. Preliminary analysis of SNPs related to rosin formation in Pinus massoniana based on transcriptome sequencing ［J］. Guangxi For Sci， 49（2）： 157-160.［吳志銘， 馮源恒， 楊章旗， 2020. 基于馬尾松轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的產(chǎn)脂相關(guān)SNPs初步分析 ［J］. 廣西林業(yè)科學(xué)， 49（2）： 157-160.］

XIA LF， SUN YN， SONG WX， et al.， 2020. Full-length transcriptome analysis of Zijuan tea （Camellia sinensis var. asssamica （Masters） kitamura） base on PacBio platform ［J］. Genom Appl Biol， 39（6）： 2646-2658.［夏麗飛， 孫云南， 宋維希， 等， 2020. 基于PacBio平臺(tái)的紫娟茶樹全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組分析 ［J］. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)， 39（6）： 2646-2658.］

XU Q， ZHANG C， WU JW， et al.， 2020. Research progress in biosynthesis of anthocyanins ［J］. Chem Ind For Prod， 40（3）： 1-11.［許倩， 張晨， 吳嘉維， 等， 2020. 花青素的生物合成研究進(jìn)展 ［J］. 林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)， 40（3）： 1-11.］

YANG YX， CHEN XX， XU B， et al.， 2015. Phenotype and transcriptome analysis reveals chloroplast development and pigment biosynthesis together influenced the leaf color formation in mutants of Anthurium andraeanum ‘Sonate’ ［J］. Front Plant Sci， 6： 139-155.

ZHAO DH， GAO YF， RONG LP， et al.， 2019. Study on physiological change of Acer pseudo-sieboldianum leaf color in autumn ［J］. Non-wood For Res， 37（2）： 114-119.［趙東輝， 高玉福， 榮立蘋， 等， 2019. 紫花槭秋季葉片呈色生理變化研究 ［J］. 經(jīng)濟(jì)林研究， 37（2）： 114-119.］

ZHAO LY， CAO SY， LONG YS， et al.， 2019. Applications and research progresses of full-length transcriptome sequencing in plants ［J］. J Plant Genet Resour， 20（6）： 1390-1398.［趙陸滟， 曹紹玉， 龍?jiān)茦洌?等， 2019. 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在植物中的應(yīng)用研究進(jìn)展 ［J］. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)， 20（6）： 1390-1398.］

ZOU Z， ZHAO YG， ZHANG L， et al.， 2021. Single-molecule real-time （SMRT）-based full-length transcriptome analysis of tigernut （Cyperus esculentus L.） ［J］. Chin J Oil Crop Sci， 43（2）： 229-235.［鄒智， 趙永國， 張麗， 等， 2021. 基于單分子實(shí)時(shí)測(cè)序的油莎豆全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組分析 ［J］. 中國油料作物學(xué)報(bào)， 43（2）： 229-235.］

（責(zé)任編輯?周翠鳴）