EMS誘導紅陽獼猴桃耐寒突變體的篩選及轉錄組分析

楊娜 葉琴霞 魏卓 張漢堯

摘?要：紅陽獼猴桃（Actinidia chinensis var. chinensis ‘Hongyang’）具有較高的經(jīng)濟價值和營養(yǎng)價值，以及較好的市場開發(fā)前景。但近年紅陽獼猴桃產(chǎn)區(qū)如云南、四川等多地多次遭遇倒春寒等極端天氣，其抗寒性差的缺點限制了發(fā)展空間。該研究通過在組培的過程中使用甲基磺酸乙酯（EMS）誘導紅陽獼猴桃突變體，進而篩選出耐寒突變體，并通過轉錄組分析探究其脅迫響應機制。該研究以紅陽獼猴桃葉片為實驗材料，在組培時（4.4 g·L-1 MS+4.5 g·L-1 瓊脂+1.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA+15 g·L-1蔗糖+0.01～0.10 g·L-1 EMS）利用EMS誘導技術誘導突變體，并在低溫環(huán)境下篩選出耐寒突變體。選出的耐寒突變體和正常紅陽獼猴桃組培苗先進行4 ℃ 12 h寒脅迫處理，再進行轉錄組測序分析。結果表明：（1）通過初步的表型鑒定，當EMS處理濃度為0.06 g·L-1時誘導的部分突變體具有一定的耐寒性；（2）在轉錄組測序數(shù)據(jù)GO功能富集分析中，富集條目最多的是生物學過程；（3）利用KEGG數(shù)據(jù)庫分析時，共篩選到21個差異表達基因在15條通路中得到注釋且均為上調(diào)表達，其中內(nèi)質網(wǎng)中的蛋白質加工通路（ath04141）中富集的差異表達基因最多，并且該通路內(nèi)的sHSF、Hsp70和NEF可能與耐寒機制調(diào)控有關。綜上研究結果為紅陽獼猴桃耐寒種質資源的研究與利用提供了材料基礎及理論依據(jù)。

關鍵詞： 獼猴桃， 甲基磺酸乙酯（EMS）， 耐寒突變體， 轉錄組， 熱激蛋白

中圖分類號：Q943

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2023）09-1700-10

收稿日期：2022-07-10

基金項目：國家自然科學基金（32160556）。

第一作者： 楊娜（1999-），碩士研究生，主要從事遺傳育種研究，（E-mail）yangna1999@swfu.edu.cn。

*通信作者：張漢堯，教授，博士生導師，從事植物和微生物分子遺傳研究，（E-mail）zhanghanyao@swfu.edu.cn。

Screening and transcriptome analysis of EMS-induced

cold-tolerant mutants in Hongyang kiwifruit

YANG Na， YE Qinxia， WEI Zhuo， ZHANG Hanyao*

（ Key Laboratory of Forest Resources Conservation and Utilization of the Ministry of Education in

Southwest China， Southwest Forestry University， Kunming 650224， China ）

Abstract：The Hongyang kiwifruit （Actinidia chinensis var. chinensis ‘Hongyang’） has high economic and nutritional values and good prospects for market development. However， in recent years Hongyang kiwifruit production areas such as Yunnan and Sichuan have been subjected to extreme weather such as inversions on several occasions， and its poor cold resistance has limited its scope for development. In this study， ethyl methanesulfonate （EMS） was used to induce mutants of Hongyang kiwifruit in a tissue culture process， which led to the screening of cold-tolerant mutants and the investigation of their stress response mechanisms through transcriptome analysis. In this study， mutants were induced using EMS induction technology using Hongyang kiwifruit leaves as experimental material in tissue culture （4.4 g·L-1 MS + 4.5 g·L-1 agar + 1.5 mg·L-1 6-BA + 0.1 mg·L-1 NAA + 15 g·L-1 sucrose + 0.01-0.10 g·L-1 EMS） and screened for cold-tolerant mutants under low temperature. Selected cold-tolerant mutants and normal Hongyang kiwifruit tissue culture seedlings were subjected to 4 ℃ 12 h cold stress treatment， while later， transcriptome sequencing analysis was performed. The results were as follows： （1） According to the preliminary phenotypic identification， some of the mutants induced by the 0.06 g·L-1 EMS were phenotypically resistant to cold; （2） In the GO functional enrichment analysis of transcriptome sequencing data， the most enriched entries were in the biological processes; （3） When using KEGG database analysis， a total of 21 differentially expressed genes （DEGs） were annotated in 15 pathways， and which were all up-regulated. The protein processing pathway （ath04141） in the endoplasmic reticulum had the most DEGs， and sHSF， Hsp70， and NEF in this pathway may be related to the regulation of cold-tolerantmechanisms. The above findings provide a material basis and theoretical rationale for the research and utilization of cold-tolerant germplasm resources of Hongyang kiwifruit.

Key words： kiwifruit， ethyl methanesulfonate （EMS）， cold-tolerant mutant， transcriptome， heat shock protein

紅陽獼猴桃（Actinidia chinensis var. chinensis ‘Hongyang’）果心呈血紅色放射狀，味甜可口，含有較高的維生素C、維生素E、多種游離氨基酸及礦物質成分，且含有獨特的花青素，是兼具保健及美容功能于一體的重要經(jīng)濟作物（張維等，2021）。紅陽獼猴桃屬于早熟型品種，對低溫尤為敏感（馬秋詩，2014）。紅陽獼猴桃對種植區(qū)環(huán)境要求較高，需要達到夏季無酷暑、冬季無嚴寒（黃永紅等，2016）。南方多省市近年日降溫幅度都超過10 ℃，不斷刷新歷史氣溫最低值，這些氣候變化導致溫度驟降，對獼猴桃產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生一定影響，嚴重時導致獼猴桃樹體直接凍死（李化龍等，2021）。隨著紅陽獼猴桃生產(chǎn)的迅速發(fā)展和種植面積的不斷擴大，氣候的異常變化嚴重制約其發(fā)展，低溫脅迫成為影響其生長、果實質量和產(chǎn)量的主要因素之一。因此，培育出耐寒性強的紅陽獼猴桃種質資源已成為生產(chǎn)中的重要研究內(nèi)容之一。

近年來，耐寒誘變育種已經(jīng)被廣泛運用于各個植物遺傳育種中的抗寒品種選育中，技術也趨于成熟（陳祥韋，2017）。其中，甲基磺酸乙酯（ethyl methanesulfonate， EMS）是目前世界上公認最有效的用于抗性品種選育的化學誘變劑之一，其具有使用方便、特殊性較好、誘變所產(chǎn)生的后代遺傳性狀比其他誘變育種的后代更穩(wěn)定等優(yōu)點（王元東等，1999；彭波等，2007）。王小華等（2010）對柱花草愈傷組織進行化學誘變處理，并通過篩選抗寒突變體選育出優(yōu)良種質資源。陳祥韋（2017）利用EMS誘變技術處理海雀稗愈傷組織，并對再生植株進行耐寒性鑒定，進而篩選出耐寒材料獲得海雀稗耐寒突變體。曹冠男（2018）篩選出EMS誘變小麥的最適處理組合，在所構建的突變?nèi)后w中篩選出豐富的表型變異。孫慧（2019）以海濱木槿為材料，利用不同濃度EMS進行誘變處理，選擇合適的誘變濃度和時間，通過對后期幼苗變異表型的觀察、生理指標的測定以及亞顯微結構的比較進行抗寒性的篩選與鑒定，獲得了海濱木槿抗寒新品種。胡松梅等（2019）在設置0 ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)經(jīng)EMS誘導后的鐵皮石斛突變體，篩選出20株耐寒能力較高的突變體。

植物轉錄組學研究是基于RNA水平對某一特定植物器官或組織在某種特定條件下進行其細胞內(nèi)發(fā)生的基因轉錄、轉錄后調(diào)控、調(diào)控后表達的研究，是目前研究基因組水平變化最直接和最常用的方式（崔凱等，2019）。周鶴瑩（2020）利用冬棗和金絲小棗冷凍脅迫的轉錄組數(shù)據(jù)分析差異表達基因，揭示了ZJDREB1和ZJSOD1在提高棗抗凍過程中的作用。楊寧等（2020）利用EMS誘導技術與轉錄組測序技術相結合，對矮化性狀及其調(diào)控的相關基因進行了一系列分析。如今，RNA測序方法已成為分子生物學研究植物抗性功能的重要手段，達到商業(yè)化水平并廣泛應用于我國相關農(nóng)林業(yè)的研究中，但采用EMS誘導技術與轉錄組測序技術相結合運用到獼猴桃中還鮮有報道。

紅陽獼猴桃營養(yǎng)豐富，經(jīng)濟價值高，但抗寒性差限制了其發(fā)展空間，因此通過EMS誘變及篩選，選育出紅陽獼猴桃耐寒種質資源，有利于紅陽獼猴桃種植產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。中華獼猴桃基因組序列的公布使得深入研究紅陽獼猴桃耐寒生物學成為可能?；谝阎蚪M序列基礎上的轉錄組測序，在基因的挖掘及表達調(diào)控方面具有強大的功能，也是研究獼猴桃生長發(fā)育及優(yōu)良性狀形成過程中相關基因科學高效的方法。為解決當前紅陽獼猴桃抗寒性差，及相關抗寒相關機理不清的問題，本研究擬在組織培養(yǎng)過程中的低溫環(huán)境下篩選出紅陽耐寒突變體并進行轉錄組水平分析，為選育紅心獼猴桃優(yōu)良種質資源及研究耐寒機理提供了科學依據(jù)。

1?材料與方法

1.1 實驗材料

本研究采用西南林業(yè)大學溫室大棚種植的紅陽獼猴桃植株健康葉片為實驗材料。

1.2 實驗方法

1.2.1 組織培養(yǎng)體系建立?按照師萬源等（2021）的方法取紅陽獼猴桃幼嫩葉片作為外植體，經(jīng)流水沖洗30 min，于超凈工作臺內(nèi)用75% C2H5OH 消毒20 s，再用0.1% HgCl2溶液消毒5 min。葉片切成約1 cm × 1 cm的大小放到4.4 g·L-1 MS + 4.5 g·L-1瓊脂 + 15 g·L-1蔗糖 + 2.0 mg·L-1 TDZ + 0.5 g·L-1 IBA培養(yǎng)基中培養(yǎng)誘導愈傷組織，每瓶放置3～4片切好的葉片。待愈傷組織誘導分化不定芽時培養(yǎng)基更換為4.4 g·L-1 MS + 4.5 g·L-1 瓊脂 + 15 g·L-1蔗糖 + 0.3 mg·L-1 NAA + 3.0 mg·L-1 6-BA。

1.2.2 EMS誘導與篩選體系建立?突變體誘導時將EMS溶液經(jīng)0.22 μm的過濾器抽濾滅菌，過濾滅菌后將EMS加入高溫滅菌后的培養(yǎng)基（4.4 g·L-1 MS+4.5 g·L-1 瓊脂+1.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1 NAA+15 g·L-1 蔗糖）中，EMS培養(yǎng)基配制成0.01～0.10 g·L-1誘變濃度，并以不含EMS的培養(yǎng)基為對照組。每個處理分別接種45瓶，接種后將全部培養(yǎng)瓶放置于光照強度2 000 lx、培養(yǎng)溫度（26 ± 1） ℃、日照15 h的培養(yǎng)室內(nèi)，觀察并記錄統(tǒng)計外植體存活率，以及篩選出50%半致死劑量（LD50）。將EMS誘變的紅陽獼猴桃植株與未經(jīng)誘變植株放在4 ℃冰箱中處理12 h，取出后開始觀察其生長狀況及進行形態(tài)鑒定，初步篩選出耐寒突變植株。

1.3 轉錄組測序

設置對照組A1、A2、A3 3瓶正常紅陽獼猴桃植株組培苗和實驗組B1、B2、B3 3瓶紅陽獼猴桃耐寒突變植株組培苗經(jīng)過4 ℃下12 h寒脅迫處理，對其進行取樣并用錫箔紙包裝并標號，將6個樣品寄達陜西博瑞德公司進行轉錄組測序分析。

1.3.1 測序數(shù)據(jù)處理?根據(jù)實驗材料的基因信息和參考基因組，按照過濾標準過濾原始轉錄組數(shù)據(jù)中的低質量序列（質量≤20的堿基數(shù)占整個Reads的50%以上的低質量Reads）、雜質和接頭。

1.3.2 參考基因組序列對比?將RNA-?Seq測序所得Clean reads與其參考基因組序列進行序列對比，得到Reads定位信息。通過對比可以得到測序數(shù)據(jù)利用率及測序樣品與參考基因組親緣關系的遠近。

1.3.3 基因表達量分析及差異表達基因檢測?通過bowtie2工具將獲得的Clean reads與參考轉錄組序列進行對比，并統(tǒng)計基因對比率。使用RSME分析統(tǒng)計對比結果，獲得每個樣注釋到參考轉錄組序列的Reads數(shù)目，并計算其FPKM值，計算Fragment統(tǒng)計轉錄并通過FDR檢驗差異表達基因P value數(shù)值，并檢驗校正P value閾值。差異檢驗的FDR值越小，其差異倍數(shù)越大，所表達差異越顯著。

1.3.4 差異表達基因的GO功能富集分析?GO （Gene Ontology）富集分析按照國際標準分類分為3大類，即生物學過程、細胞組成和分子功能。把差異表達基因注釋到GO數(shù)據(jù)庫中，將FDR值≤0.05的差異表達基因作為顯著富集的基因本位條目。

1.3.5 差異表達基因KEGG富集分析?KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）是關于Pathway的公共基因庫，其全稱為京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫，KEGG主要包括KEGG Pathway、KEGG基因、KEGG基因組、KEGG反應過程等分類。Pathway富集分析是以KEGG途徑為單位，將差異表達基因進行注釋分類，并運用超幾何檢驗，使用R語言進行富集分析及P value矯正。

1.4 數(shù)據(jù)處理

生理指標數(shù)據(jù)采用Excel 2003軟件進行數(shù)據(jù)比較分析，差異表達基因表達量使用SPSS 22.0 軟件進行顯著性檢驗（P＜0.05）。

2?結果與分析

2.1 EMS誘導體系

2.1.1 不同EMS 處理對紅陽獼猴桃愈傷組織死亡率的影晌?紅陽獼猴桃葉片經(jīng)愈傷組織誘導后，對其進行不同濃度10個梯度EMS培養(yǎng)，并設置未添加EMS培養(yǎng)基作為對照組。由表1可知，EMS對紅陽獼猴桃生長的抑制作用隨EMS濃度增加而增強。當 EMS濃度為 0.06 g·L-1時，死亡率為51.1%，與50%半致死率最為接近，作為LD50進行下一步誘變試驗。

2.1.2 突變結果分析?紅陽獼猴桃葉部的突變：將EMS共培養(yǎng)后存活的紅陽獼猴桃愈傷組織培養(yǎng)30 d，選取不同類型的突變性狀進行統(tǒng)計。在葉片中觀察到，與CK（圖1：A）相比，突變類型有葉形、葉柄、葉色、葉緣和被毛共5種突變，具體見圖1。

紅陽獼猴桃株形突變：經(jīng)EMS處理后的紅陽獼猴桃的生長能力與對照組相比較弱，表現(xiàn)在株高較矮、葉片發(fā)黃等方面。由圖2可知，EMS紅陽獼猴桃株型突變主要有株高變矮突變、株型稀疏突變、株型緊湊突變和株型松散突變。株高變矮突變植物生長過程較緩慢，葉片顏色較正常植株葉片顏色綠（圖2：J）；株型稀疏突變和松散突變植株株型較為松散，葉片數(shù)量有所減少（圖2：K，M）；株型緊湊突變植株葉片呈包裹狀，無法伸展開來，葉片數(shù)量較多（圖2：L）。

2.1.3 紅陽獼猴桃耐寒突變體篩選及鑒定?將3瓶EMS誘變的紅陽獼猴桃植株與3瓶未經(jīng)誘變植株放在4 ℃冰箱中處理12 h后取出。培養(yǎng)7 d時，發(fā)現(xiàn)紅陽獼猴桃突變體葉片與對照組葉片相比，紅陽獼猴桃突變體葉片仍能保持綠色，對照組葉片邊緣部分出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，具體見圖3：N。

經(jīng)15 d后，3瓶EMS誘變的紅陽獼猴桃植株（表2序號1、2、3）葉片有部分復綠，有新芽長出，而未經(jīng)誘變處理植株（表2序號4、5、6）枯萎死亡，無新芽長出，具體見圖3：O和表2，由此可推測經(jīng)EMS誘變的部分紅陽獼猴桃植株獲得了一定的耐寒性。

2.2 轉錄組測序

2.2.1 測序數(shù)據(jù)處理?為了保證能夠有效保證數(shù)據(jù)分析的信息準確性和數(shù)據(jù)質量及其數(shù)據(jù)可靠性，需要對原始數(shù)據(jù)進行過濾。由表3可知，共獲得43.27 G的Clean bases，其中6個樣品的Q20和Q30 的堿基在Clean data中所占的百分比均超過94%，Clean reads中G與C各項堿基之間的百分比均在46%～47%之間；6個樣品均未檢測到未知堿基。綜合分析證明測序質量良好，符合建庫要求，可進行下一步分析。

2.2.2 差異表達基因的篩選?同一生物在不同環(huán)境條件下其基因表達存在顯著差異。由圖4可知，結果共篩選出294條差異表達基因，其中上調(diào)差異表達基因為254條，占比為86.4%，下調(diào)差異表達基因為40條，僅占比13.65%。由此可見，低溫脅迫12 h內(nèi)有大量的冷脅迫響應基因被成功激活，而一部分基因則受到抑制。

2.2.3 GO功能分析?對紅陽獼猴桃處理組與對照組進行GO功能性的分類以及豐富性的分析。GO功能分析主要劃分為生物學過程、分子功能和細胞組成3個方面。GO功能富集以顯著性值<0.05作為顯著性富集的閾值，結果見圖5。從GO富集的數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計結果可知，生物學過程部分富集127個功能分類，分子功能部分為104個功能分類，細胞組成部分共富集19個功能分類，3個方面的差異表達基因分別為104條、135條、25條，共264條。其中生物學過程部分富集功能分類最多，位于前五的富集差異表達基因序列條目為多細胞類生物發(fā)育、發(fā)展過程、解剖學結構的發(fā)展、胞吐作用、細胞分泌作用；其次是分子功能部分，位于前五的富集差異表達基因序列條目為活性血紅素酶的結合機理作用示例、四吡咯酶的結合機理作用、 轉移氧化酶活性作用、 氧化酶的還原酶活性、鐵離子的氧化結合機理作用；富集條目最少的是細胞組成部分。這些富集差異表達基因的條目均可能與紅陽獼猴桃突變體耐寒性相關。

2.2.4 差異表達基因Pathway功能分析?進行KEGG生物通路分類及富集分析可以確定差異表達基因主要參與的信號傳導及生化代謝途徑。本研究以P<0.05作為顯著性富集的閾值，利用KEGG數(shù)據(jù)庫對紅陽獼猴桃兩個處理組合中的差異表達基因進行生物通路分析，結果見圖6。21個差異表達基因在KEGG通路中得到注釋，共富集到15條通路中，且都為上調(diào)差異表達基因。其中呈極顯著富集（P＜0.01）的通路是內(nèi)質網(wǎng)中的蛋白質加工，共富集9條差異表達基因，呈顯著富集（P＜0.05）的通路是硫代謝和激素信號轉導，分別富集2個和3個差異表達基因；其次為MAPK信號傳導途徑—植物，共富集2個差異表達基因；只富集1個差異表達基因的通路為色氨酸代謝、2-氧代羧酸代謝、甘油酯代謝、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝、RNA降解、mRNA監(jiān)測途徑、胞吞作用、RNA轉運、剪接體、碳代謝和氨基酸的生物合成。由于內(nèi)質網(wǎng)中的蛋白質加工通路呈極顯著富集，推測其富集的差異表達基因與耐寒性相關性較高。

2.2.5 內(nèi)質網(wǎng)中的蛋白質加工通路分析?在紅陽獼猴桃突變體與對照組應答冷脅迫中，內(nèi)質網(wǎng)蛋白質加工通路中差異表達基因富集最多，這9個基因全部富集在內(nèi)質網(wǎng)相關降解（endoplasmic reticulum associated degradation， ERAD）過程中且均為上調(diào)表達。通路富集差異表達基因表達量見表4，其中與植物溫度脅迫相關的熱激轉錄因子（small Heat Shock Factor，sHSF）富集了7個差異表達基因，其表達量最高增加了25.65倍，顯著高于未誘導耐寒突變體的對照組（P<0.05）；與蛋白質聚合有關的熱激蛋白70B（Heat shock protein 70，Hsp70）富集了1個差異表達基因，其表達量高于未誘導處理的3.8倍，差異達顯著水平（P<0.05）；Hsp70互作蛋白（NEF）富集了1個差異表達基因，其表達量高于未誘導處理的1.86倍，差異達顯著水平（P<0.05）。

3?討論

由于溫室氣體排放等原因，近年地球氣候變化加劇，植物受到高溫、低溫脅迫的情形更加普遍。低溫脅迫通常會致使植物細胞酶活性的降低、膜系統(tǒng)的破壞和細胞的失水等，進而導致其細胞代謝紊亂，甚至是細胞死亡，對作物的產(chǎn)量乃至其生存造成重大影響。因此，選育抗寒或耐寒品種及進行耐寒機理研究成了當今研究的熱點（孫慧，2019；胡松梅等，2019；周鶴瑩，2020）。近年來在選育優(yōu)良品種的過程中，使用植物組織培養(yǎng)與誘變技術相結合的離體誘變技術開始逐漸受到人們的關注（王小華等，2010；陳祥韋，2017；胡松梅等，2019）。本研究利用EMS誘變劑處理紅陽獼猴桃愈傷組織，發(fā)現(xiàn)EMS誘變劑處理可加大植物變異范圍，豐富種質資源，通過篩選也獲得了耐寒突變體，這與前人的研究結果一致（陳祥韋，2017；孫慧，2019）。

此外，本研究對紅陽獼猴桃愈傷組織進行不同濃度梯度的EMS誘變時，觀察到部分突變體的生長能力比對照組弱，主要表現(xiàn)在株高較矮、葉片發(fā)黃等方面。這可能是由于EMS是非定向誘變劑所致。突變可分為有害突變、有利突變和中性突變，本研究中觀察到部分突變體的生長能力變?nèi)酰瑧怯泻ν蛔?。本研究將EMS誘變的紅陽獼猴桃植株與未經(jīng)誘變植株進行寒脅迫處理，結果表明EMS誘變的部分紅陽獼猴桃植株葉片有新芽長出，而對照植株全部枯萎死亡，說明部分經(jīng)EMS誘變的紅陽獼猴桃突變植株具有一定的抗寒性，這應是有利突變。這也進一步證實了EMS誘導的突變是不定向的，有可能導致有害突變，也可以導致有利突變，要得到有用的突變，關鍵在于篩選。

當植物在遭受寒冷脅迫時，低溫會促進細胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，同時生物大分子也會受到破壞（張健等，2020）。如在內(nèi)質網(wǎng)中，蛋白質可以通過內(nèi)腔伴侶發(fā)生折疊，正確折疊后，蛋白質經(jīng)過包裝后進入運輸小泡，然后運輸?shù)礁郀柣w中，而在脅迫下發(fā)生錯誤折疊后，蛋白質和分子伴侶作用使之在內(nèi)質網(wǎng)腔內(nèi)保留下來（Meusser et al.， 2005；李瑞，2015）。隨后內(nèi)質網(wǎng)膜上的“分子伴侶”重鏈結合蛋白（Bip）和錯誤折疊后的蛋白質相結合，并在ERAD過程中的蛋白酶體發(fā)生降解（Mccracken & Brodsky， 2010）。在本研究的內(nèi)質網(wǎng)加工通路中，獼猴桃植株在受到冷脅迫后，差異基因在ERAD過程呈上調(diào)狀態(tài)，則可能說明該植物分解末端錯誤折疊的蛋白質功能增強，壓力擾亂蛋白質折疊，從而導致錯誤折疊或聚集蛋白質的超積累，這種被破壞的蛋白質沉積導致?lián)p害細胞組成的蛋白毒性應激，因此生物體必須重新折疊或移除錯誤折疊的蛋白質才能維持健康生長（Izumi， 2019）。已知，sHSF最初在高溫響應中被發(fā)現(xiàn)，參與應激反應和“記憶”，而現(xiàn)在普遍認為它們也參與低溫響應（Stief et al.， 2014）。根據(jù)張寧等（2019）通過對比過表達小熱激蛋白的番茄（Lycopersicon esculentum）植株和正常植株，發(fā)現(xiàn)小熱激蛋白能夠積極調(diào)動起來以對抗逆境脅迫，達到提高番茄耐寒性的目的。史潔瑋等（2020）發(fā)現(xiàn)低溫脅迫下，誘導番茄小熱激蛋白基因CI-HSP17.7含量上升，并通過糖含量的變化使番茄果實的耐寒性增強。Waters等（1996）證實了寒脅迫能誘導植物Hsp70的mRNA與蛋白質的合成。宮偉娜等（2009）發(fā)現(xiàn)紫莖澤蘭（Ageratina adenophora）在冷脅迫下，不同分子量熱激蛋白基因通過保護功能蛋白的活性進而增強紫莖澤蘭的低溫適應能力。同時，在水稻（Oryza sativa）的相關研究中發(fā)現(xiàn)，冷脅迫前后熱激水稻幼苗的胚根可以明顯提升幼苗胚根的耐寒性（Saltveit， 2001）。而NEF是一種Hsp70結合蛋白，通過介入體內(nèi)分子伴侶體系使之具有穩(wěn)定細胞質Hsp70的功能，其缺失可導致Hsp70的降解（劉霞霞等，2017）。進一步推測出，受到冷脅迫后的紅陽獼猴桃耐寒突變體植株蛋白酶體降解能力加強，這可能是由于蛋白質與在脅迫下形成的熱激蛋白大分子寡聚物sHSF相互作用，從而使蛋白質的進一步聚合得到抑制，并與Hsp70、NEF等其他分子伴侶在一定條件下幫助蛋白重新折疊，進而維持蛋白質的正常結構和功能，從而達到增強其抗寒性的目的。結合EMS誘導紅陽獼猴桃耐寒突變體及轉錄組分析，以上研究結果為紅陽獼猴桃耐寒種質資源選育及耐寒分子機制研究提供了一定的實驗材料及理論參考依據(jù)。

4?結論

本研究利用EMS誘導出葉型和株型共12種突變體，最終通過寒脅迫處理篩選出耐寒突變體。進一步將初步篩選出的耐寒突變體與正常紅陽獼猴桃植株進行轉錄組技術分析，結果表明，進行寒脅迫處理的紅陽獼猴桃耐寒突變體與對照組紅陽獼猴桃正常植株相比，共有差異表達基因294條，其中上調(diào)表達254條，下調(diào)表達40條。差異表達基因注釋到250個GO功能分類和15條KEGG通路中，分析結果顯示，內(nèi)質網(wǎng)中蛋白質加工通道呈極顯著富集了9條差異表達基因，且均為上調(diào)表達，發(fā)現(xiàn)了3類耐寒相關基因，通過分析推測出紅陽獼猴桃通過提升sHSF、Hsp70、NEF的表達量來提升其耐寒性。

參考文獻：

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（責任編輯?周翠鳴）