HA-RGD對(duì)細(xì)胞活性因子修復(fù)功效影響的研究

張楠 張婷婷

【摘要】目的 通過(guò)多種檢測(cè)方法分析HA-RGD對(duì)細(xì)胞活性因子修復(fù)功效的影響。方法 利用一定的比例構(gòu)建HA-RGD、細(xì)胞活性因子組合物1和組合物2，在細(xì)胞水平和人體水平分別評(píng)估其對(duì)皮膚的修復(fù)效果。結(jié)果 組合物1和組合物2中受試者人體安全斑貼試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，未出現(xiàn)不良反應(yīng)，安全性良好；基于細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，組合物1和組合物2與空白對(duì)照相比，相對(duì)遷移平均值顯著升高（P<0.01）；且組合物2和陽(yáng)性對(duì)照效果相似；組合物1和組合物2中受試者的TEWL值在產(chǎn)品使用2周和4周時(shí)顯著低于0周時(shí)（P<0.01），且呈極顯著性下降趨勢(shì)（P<0.001）；根據(jù)受試者28 d的檢測(cè)數(shù)值，組合物2中受試者的TEWL值在產(chǎn)品使用2周、4周時(shí)的下降數(shù)值均顯著大于組合物1（P<0.01）。結(jié)論 HA-RGD對(duì)細(xì)胞活性因子的修復(fù)效果有一定的促進(jìn)作用，能進(jìn)一步提升細(xì)胞活性因子的修復(fù)效果，滿(mǎn)足更大的皮膚修復(fù)需求市場(chǎng)。

【關(guān)鍵詞】多氨基酸多糖縮合物；細(xì)胞活性因子；皮膚修復(fù)

中圖分類(lèi)號(hào)：R392 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1004-4949（2023）18-0070-04

Study on the Effect of HA-RGD on the Repair Efficacy of Cell Active Factor

ZHANG Nan， ZHANG Ting-ting

（Xian Bohong Biotechnology Co. Ltd.， Xian 710032， Shaanxi， China）

【Abstract】Objective To analyze the effect of HA-RGD on the repair effect of cell active factors by various detection methods. Methods HA-RGD， cell active factor composition 1 and composition 2 were constructed in a certain proportion， and their repair effects on skin were evaluated at the cellular level and human level， respectively. Results Human safety patch test of subjects in combination 1 and combination 2 were negative， no adverse reactions occurred， and the safety was good. Based on the cell migration experiment， the average relative migration of composition 1 and composition 2 was significantly higher than that of blank control （P<0.01）， and the effect of compound 2 was similar to that of positive control. The TEWL values of subjects in combination 1 and combination 2 were significantly lower at 2 weeks and 4 weeks than at 0 weeks （P<0.01）， and showed a significant downward trend （P<0.001）. According to the 28-day detection value of the subjects， the TEWL value of the subjects in the combination 2 decreased significantly more than that in the combination 1 at 2 weeks and 4 weeks （P<0.01）. Conclusion HA-RGD has a certain promoting effect on the repair effect of cell active factors， which can further improve the repair effect of cell active factors and meet the larger market demand for skin repair.

【Key words】Polyamino sugar condesate； Cell active factors； Skin repair

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）作為一種能夠自我更新且具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞[1，2]，其在培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)分泌大量的細(xì)胞因子，是除外泌體外另一具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)，富含細(xì)胞活性關(guān)鍵的信息傳遞物質(zhì)，這種傳遞物質(zhì)被稱(chēng)為細(xì)胞活性因子[3]。間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)體內(nèi)受到損傷的組織和細(xì)胞的功能恢復(fù)起到重要作用，也被稱(chēng)作“生長(zhǎng)因子”或“修復(fù)因子”[4]，主要在護(hù)膚品中，起細(xì)胞修護(hù)組織再生功能[5]。水解透明質(zhì)酸鈉-肽（HA-RGD）為多氨基酸多糖縮合物與水解透明質(zhì)酸組成，其中RGD是一種含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的三肽序列，能與11種整合素特異性結(jié)合，能有效促進(jìn)細(xì)胞對(duì)生物材料的黏附[6]。整合素是細(xì)胞黏附分子家族的重要成員，能介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外間質(zhì)的黏附及信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附、遷移、增殖和凋亡等。整合素又分為4個(gè)亞族，其中一族就是RGD受體，在RGD受體中整合素αV和β3是研究最早、最深入的亞型之一。研究表明[7]，在部分炎癥過(guò)程中，整合素αV和β3可能在成纖維細(xì)胞激活和傷口愈合等病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞活性因子作為一款具有修復(fù)功效的原料，利用超濾濃縮技術(shù)將干細(xì)胞上清液中的細(xì)胞活性因子分離出來(lái)[8]。為了進(jìn)一步提升其修復(fù)效果，滿(mǎn)足更大的皮膚修復(fù)需求市場(chǎng)，本研究利用HA-RGD對(duì)于生物材料的黏附性以及其能與整合素特異性結(jié)合的特點(diǎn)，通過(guò)設(shè)計(jì)細(xì)胞水平和人體水平的實(shí)驗(yàn)方案并根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，研究HA-RGD對(duì)于細(xì)胞活性因子修復(fù)功效的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 水解透明質(zhì)酸鈉-肽（HA-RGD>99%）：所需原料由陜西未來(lái)生物基質(zhì)工程有限公司固定原料商提供，規(guī)格：1 g/支；細(xì)胞活性因子（>0.6 mg/ml）由陜西未來(lái)肉膳健康科技有限公司固定原料商提供，規(guī)格：500 ml/瓶。本次測(cè)試所用細(xì)胞為成纖維細(xì)胞（廣東博溪生物科技有限公司），低糖DMEM培養(yǎng)液（博溪生物）、新生牛血清（NBS，蘭州榮曄）、細(xì)胞培養(yǎng)板（BIOFIL，24孔）。測(cè)試志愿者由西安博鴻生物技術(shù)有限公司召集。SKINLAB COMBO（Cortex Technology，Dermalab）、低致敏膠帶、無(wú)屑吸水干紙巾、無(wú)塵紙。CO2培養(yǎng)箱（Thermo，150 i）、超凈工作臺(tái)（蘇州安泰，SW-CJ-1F）、酶標(biāo)儀（BioTek，Epoch）、倒置顯微鏡（Olympus，CKX41）。

1.2 方法

1.2.1用于實(shí)驗(yàn)的組合物的制備 按比例稱(chēng)取細(xì)胞活性因子（37.5%）和其他原料進(jìn)行配制，然后過(guò)濾除菌、灌裝、凍干后得到組合物1，備用；同理，按比例稱(chēng)取原料HA-RGD（0.05%）、細(xì)胞活性因子（37.5%）和其他原料進(jìn)行配制，然后過(guò)濾除菌、灌裝、凍干后得到組合物2，備用。

1.2.2安全性驗(yàn)證 人體斑貼試驗(yàn)：依照志愿者入選標(biāo)準(zhǔn)招募膚質(zhì)符合要求的志愿者30名，年齡20～50歲。采用封閉式試驗(yàn)方法，將受試物置于合適的斑貼試器內(nèi)，將其用低致敏膠帶貼敷于受試者的手臂曲側(cè)，用手掌輕壓使之均勻的貼敷于皮膚上，持續(xù)24 h，空白對(duì)照組為受試者不使用產(chǎn)品。分別在24 h后去除受試器，0.5 h、24 h觀察皮膚反應(yīng)，記錄反應(yīng)結(jié)果。

1.2.3具有皮膚修復(fù)功能組合物的研究 ①細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞遷移是指細(xì)胞在接收到遷移信號(hào)或感受到某些物質(zhì)的刺激后而產(chǎn)生的移動(dòng)[9]；細(xì)胞遷移能力增加，表明具有促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)作用；皮膚受到損傷后，皮膚內(nèi)的各種細(xì)胞主要通過(guò)細(xì)胞遷移到達(dá)損傷部位來(lái)進(jìn)行修復(fù)活動(dòng)，角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移能力對(duì)表皮損傷修復(fù)具有重要作用；將 2×10⁵個(gè)細(xì)胞/孔接種于24孔板，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育達(dá)到完全融合；用無(wú)血清培養(yǎng)基清洗細(xì)胞，并用10 μg/ml絲裂霉素在培養(yǎng)箱孵育1 h，后用消毒后的10 μl槍頭在24孔中心的單層細(xì)胞表面劃出一條無(wú)細(xì)胞的傷痕，用基礎(chǔ)培養(yǎng)液漂洗數(shù)次清洗劃痕上的細(xì)胞；加入含2%血清的培養(yǎng)液以及用含2%血清培養(yǎng)基配置的樣品溶液繼續(xù)培養(yǎng)，觀察16 h后遷移到劃痕區(qū)細(xì)胞的情況，計(jì)算遷移相對(duì)平均值，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2；②經(jīng)表皮失水率檢測(cè)：目前大多研究機(jī)構(gòu)通過(guò)測(cè)定經(jīng)表皮失水率來(lái)評(píng)價(jià)皮膚屏障功能，其含義是皮膚在汗腺不活動(dòng)的狀態(tài)下總的失水量，能夠反應(yīng)角質(zhì)層對(duì)于水的屏障功能，是評(píng)價(jià)角質(zhì)層狀態(tài)的重要因子；TEWL通過(guò)評(píng)價(jià)角質(zhì)層屏障功能達(dá)到預(yù)測(cè)護(hù)膚品通過(guò)保濕作用對(duì)表皮屏障功能的維護(hù)、修復(fù)和加強(qiáng)作用，因此本實(shí)驗(yàn)方案用TEWL值表征組合物對(duì)于皮膚的修復(fù)效果；在測(cè)試條件下，得到的TEWL值越高，代表單位時(shí)間、單位橫截面積的經(jīng)表皮水分流失量越多，皮膚屏障功能越差；TEWL值越低，代表單位時(shí)間、單位橫截面積的經(jīng)表皮水分流失量越少，皮膚屏障功能得到改善，具有修復(fù)效果。

依據(jù)志愿者入選標(biāo)準(zhǔn)招募符合條件的志愿者入組，年齡28～55歲，分組試驗(yàn)。在測(cè)試環(huán)境中平衡等待30 min，保持放松。后使用低致敏膠帶對(duì)志愿者測(cè)試區(qū)域進(jìn)行粘貼，按壓2 s后緩慢剝離，連續(xù)撕脫至出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的紅斑，然后檢測(cè)測(cè)試區(qū)域的經(jīng)表皮水分流失率記為基礎(chǔ)值；發(fā)放樣品，根據(jù)樣品使用說(shuō)明書(shū)正確使用產(chǎn)品，測(cè)試區(qū)域分為樣品涂抹區(qū)域和對(duì)照區(qū)域；并在設(shè)定的測(cè)量時(shí)間點(diǎn)2周和4周測(cè)量各測(cè)試區(qū)域的經(jīng)表皮水分流失率記為測(cè)量值，檢測(cè)方法見(jiàn)表3。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 28.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（x-±s）表示，若測(cè)試數(shù)據(jù)為正態(tài)分布，則采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)；若測(cè)試數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布，則采用秩和檢驗(yàn)；P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01表示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著，P<0.001表示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義極顯著。

2 結(jié)果

2.1 組合物的安全性 根據(jù)人體斑貼試驗(yàn)結(jié)果，參加試驗(yàn)的30名志愿者中，在斑貼試驗(yàn)進(jìn)行0.5 h以及24 h后撕掉斑貼的皮膚反應(yīng)均為陰性反應(yīng)，組合物1和組合物2均未出現(xiàn)不良反應(yīng)，安全性良好，不良反應(yīng)發(fā)生率為0，見(jiàn)表4。

2.2 具有皮膚修復(fù)功效組合物的功效驗(yàn)證結(jié)果

2.2.1細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 陽(yáng)性對(duì)照的相對(duì)遷移平均值顯著高于空白對(duì)照，說(shuō)明本次測(cè)試陽(yáng)性對(duì)照有效；組合物1和組合物2與空白對(duì)照相比，相對(duì)遷移平均值顯著升高（P<0.01），且組合物2和陽(yáng)性對(duì)照效果相似，見(jiàn)圖1。

2.2.2經(jīng)表皮失水率測(cè)試實(shí)驗(yàn) 組合物1和組合物2中受試者的TEWL值在產(chǎn)品使用2周和4周時(shí)顯著低于0周時(shí)（P<0.01），且呈極顯著性下降趨勢(shì)（P<0.001）；根據(jù)受試者28 d的檢測(cè)數(shù)值，組合物2中受試者的TEWL值在產(chǎn)品使用2周、4周時(shí)的下降數(shù)值均顯著大于組合物1（P<0.01），見(jiàn)圖2。

3 討論

細(xì)胞活性因子是對(duì)細(xì)胞分泌的能調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的多肽的統(tǒng)稱(chēng)，有促進(jìn)肌膚細(xì)胞組織的分化、促進(jìn)受損肌膚組織的結(jié)構(gòu)重建和促進(jìn)受損肌膚深層細(xì)胞組織愈合等修復(fù)作用[11]。但是由于原料本身的提取純度、儲(chǔ)存條件和配方應(yīng)用使得修復(fù)功效受到一定的限制，經(jīng)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，可利用RGD對(duì)于生物材料的粘附性和能與多種整合素其中包括參與炎癥修復(fù)過(guò)程的αV和β3兩種整合素的特異性結(jié)合，將細(xì)胞活性因子靶向性的帶到需要修復(fù)的皮膚組織，提升細(xì)胞活性因子的修復(fù)功能。

由此通過(guò)設(shè)計(jì)多種實(shí)驗(yàn)檢測(cè)手段對(duì)HA-RGD對(duì)于細(xì)胞活性因子修復(fù)功效的影響進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，組合物1和組合物2均未出現(xiàn)不良反應(yīng)，說(shuō)明組合物1和組合物2安全無(wú)刺激，安全性良好。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)顯示，本次測(cè)試陽(yáng)性對(duì)照有效，兩組組合物對(duì)于細(xì)胞的相對(duì)遷移平均值均有提升，說(shuō)明兩組組合物均可提高細(xì)胞遷移速度，對(duì)細(xì)胞有一定的促進(jìn)修復(fù)效果。且比較發(fā)現(xiàn)，組合物2較組合物1有更高的提升數(shù)值，說(shuō)明組合物2有更加良好的促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)效果。在經(jīng)表皮失水率測(cè)試實(shí)驗(yàn)中，TEWL值降低，說(shuō)明單位時(shí)間單位橫截面積中經(jīng)表皮流失的水分減少，皮膚屏障功能得以修復(fù)。通過(guò)28 d的驗(yàn)證周期，人體修復(fù)功效驗(yàn)證數(shù)據(jù)表明，兩組組合物在2周、4周的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)均能在人體水平上降低經(jīng)表皮失水率，讓敏感肌膚的皮膚屏障更加完整，起到一定的修復(fù)功效。且通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，組合物2較組合物1能更加明顯地降低經(jīng)表皮失水率，說(shuō)明組合物2在對(duì)敏感肌膚屏障修復(fù)方面有更加突出的修復(fù)效果。本研究旨在探究HA-RGD對(duì)細(xì)胞活性因子修復(fù)功效的影響，發(fā)現(xiàn)兩組組合物均在細(xì)胞水平上可促進(jìn)細(xì)胞遷移能力，從而增強(qiáng)修復(fù)功效，能通過(guò)降低經(jīng)表皮失水率來(lái)增強(qiáng)皮膚的屏障功能。且組合物2因HA-RGD的添加比組合物1有更加明顯的細(xì)胞修復(fù)效果，得以說(shuō)明HA-RGD對(duì)細(xì)胞活性因子的修復(fù)效果有一定的提升作用。

綜上所述，HA-RGD對(duì)細(xì)胞活性因子的修復(fù)效果有一定的提升作用，可利用HA-RGD中RGD能與多種整合素其中也包括參與炎癥修復(fù)過(guò)程的αV和β3兩種整合素的特異性結(jié)合，將生物活性材料細(xì)胞活性因子黏附在需要修復(fù)的細(xì)胞上，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)智能靶向、精準(zhǔn)修復(fù)功能，進(jìn)一步提升細(xì)胞活性因子的修復(fù)效果。

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編輯 扶田