CGF在炎癥微環(huán)境下對人牙周膜細胞成骨抑制作用的影響

廖陽陽 李思貝 張彩美 謝成婕

【摘 要】目的 研究濃縮生長因子（CGF）在炎癥微環(huán)境下對人牙周膜細胞（hPDLCs）成骨抑制作用的影響。方法 分離、培養(yǎng)并鑒定hPDLCs，并采用脂多糖（LPS）制造細胞炎癥微環(huán)境，分別將全血（對照組）、Con組、LPS組和CGF組與hPDLCs共培養(yǎng)，使用1%、5%、10%的LPS、CGF分別對hPDLCs處理24、48、72 h，進行成骨誘導，觀察不同TGFβ1和IGF-1濃度下各組CGF中含有存在成骨相關(guān)生長因子水平、炎癥微環(huán)境下hPDLCs的各組ALP活性、qPCR檢測各組成骨相關(guān)生長因表達量。結(jié)果 CGF+DMEM培養(yǎng)基中TGFβ1、IGF-1濃度均顯著高于DMEM培養(yǎng)基、CGF析出液（P<0.01）；hPDLCs細胞較為均一，無明顯雜質(zhì)細胞，形態(tài)穩(wěn)定，生長旺盛，進一步對hPDLCs進行LPS及CGF干預后，與Con組比較，ALP在LPS組明顯下降，而經(jīng)過CGF干預后ALP的濃度有所回升，甚至比Con組更高；CGF組干預后ALP活性顯著高于對照組、LPS組，且LPS組低于對照組、炎癥組（P<0.01）；炎癥微環(huán)境下，CGF組hPDLCs成骨標志物ALP、COL1及OCN的表達量顯著高于Con組、LPS組（P<0.01）。結(jié)論 CGF在炎癥微環(huán)境下對改善人牙周膜細胞成骨抑制作用具有積極的影響，可提高成骨相關(guān)因子（ALP、COL1、OCN）水平，促進成骨分化的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達量，從而有效修復人牙周膜細胞在炎癥微環(huán)境下的成骨抑制作用。

【關(guān)鍵詞】CGF；炎癥微環(huán)境；人牙周膜細胞；成骨抑制

中圖分類號：R781 文獻標識碼：A 文章編號：1004-4949（2023）18-0065-05

基金項目：廣東省醫(yī)學科學技術(shù)研究基金-面上項目（編號：B2022024）

Effect of CGF on Osteogenic Inhibition of Human Periodontal Ligament Cells in Inflammatory Microenvironment

LIAO Yang-yang1， LI Si-bei2， ZHANG Cai-mei3， XIE Cheng-jie1

（1.Department of Periodontal Disease， Haizhu Square Campus， Stomatological Hospital， Southern Medical University， Guangzhou 510280， Guangdong， China； 2.The Third Department of Surgery， Guangzhou Chest Hospital，Guangzhou 510095， Guangdong， China； 3.Department of Dentistry and Endodontics， Haizhu Square Campus， Stomatological Hospital， Southern Medical University， Guangzhou 510280， Guangdong， China）

【Abstract】Objective To investigate the effect of concentrated growth factor （CGF） on the osteogenic inhibition of human periodontal ligament cells （hPDLCs） in an inflammatory microenvironment. Methods hPDLCs were isolated， cultured and identified， and lipopolysaccharide （LPS） was used to create an inflammatory microenvironment. Whole blood （control group）， Con group， LPS group and CGF group were co-cultured with hPDLCs， and hPDLCs were treated with 1%， 5%， and 10% LPS and CGF for 24， 48， and 72 h， respectively. Osteogenic induction was performed to observe the levels of osteogenic-related growth factors in CGF of each group at different concentrations of TGFβ1 and IGF-1， the ALP activity of hPDLCs in each group under the inflammatory microenvironment， and the expression of bone-related growth factors in each group by qPCR. Results The concentrations of TGFβ1 and IGF-1 in CGF+DMEM medium were significantly higher than those in DMEM medium and CGF precipitation solution （P<0.01）. The hPDLCs cells were relatively uniform， with no obvious impurity cells， stable morphology and vigorous growth. After further LPS and CGF intervention on hPDLCs， compared with the Con group， ALP decreased significantly in the LPS group， while the concentration of ALP increased after CGF intervention， even higher than the Con group； the ALP activity of the CGF group was significantly higher than that of the control group and the LPS group， and that in the LPS group was lower than that in the control group and the inflammation group （P<0.01）. Under the inflammatory microenvironment， the expression levels of osteogenic markers ALP， COL1 and OCN in hPDLCs of CGF group were significantly higher than those of Con group and LPS group （P<0.01）. Conclusion CGF has a positive effect on improving the osteogenic inhibition of human periodontal ligament cells in the inflammatory microenvironment. Meanwhile， it can increase the levels of osteogenic related factors （ALP， COL1， OCN） and promote the expression of transcription factors related to osteogenic differentiation， so as to effectively repair the osteogenic inhibition of human periodontal ligament cells in the inflammatory microenvironment.

【Key words】CGF； Inflammatory micro-environment； Human periodontal ligament cells； Osteogenesis inhibition

牙周炎（periodontitis）是影響牙齒支持組織的慢性感染性疾病，可引起牙周附著喪失、牙齦退縮，嚴重者可導致牙齒松動、脫落[1]。重度牙周炎患者往往伴有牙周骨內(nèi)缺損病變，是牙周疾病治療的重點和難點。牙周治療的最終目標是修復和重建已破壞的牙周組織，實現(xiàn)牙周組織再生。不同的骨移植材料被應(yīng)用于臨床研究中，包括牙周引導組織再生術(shù)、牙周骨移植術(shù)等。不同療法的治療效果存在一定差異，且目前多種治療方法均無法使缺損的牙周支持組織得到真正意義上的再生，治療目標在于恢復牙周組織生理結(jié)構(gòu)和功能[2]。研究顯示[3，4]，人牙周膜細胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs）作為牙周組織的主要功能成分，在一定條件下具有向成牙骨質(zhì)細胞、成骨細胞等方向分化的潛能，其潛在的成骨分化能力，為臨床治療牙周骨缺損提供了新的方向。但是牙周炎的炎癥環(huán)境對hPDLCs成骨分化具有一定影響，可能會抑制牙周膜細胞成骨作用。而濃縮生長因子（concentrated growth factors，CGF）作為新一代血小板制品，其主要成分包括各種生長因子，可調(diào)控細胞的聚集、增殖和分化過程，促進牙周組織再生和修復的進程[5]。基于此，在牙周炎炎性環(huán)境中，CGF可能一定程度促進hPDLCs增殖和成骨分化，但是具體的作用機制尚未完全明確。本研究通過建立實驗模型進一步探究CGF在炎癥微環(huán)境下對人牙周膜細胞成骨抑制作用的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料和設(shè)備 DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司，美國），TGFβ1-ELISA Kit（Boster，中國武漢），一次性真空采血管、細胞培養(yǎng)皿（Corning公司，美國），CGF離心機（Medifuge公司，意大利），大腸桿菌脂多糖LPS（SIGMA公司，美國），BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，中國上海），堿性磷酸酶檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，中國上海），總RNA提取試劑盒（Takara，日本），反轉(zhuǎn)錄試劑盒 （Thermo公司，美國），qPCR反應(yīng)體系：Maxima TM SYBR Green/ROX qPCR Master Mix （2X）（Thermo Fisher Scientific，美國）。

1.2 hPDLCs的傳代與培養(yǎng) 收集18～25歲志愿者拔除的健康正畸前磨牙，反復沖洗后刮取牙根中1/3部位的牙周膜組織，采用組織塊法進行原代培養(yǎng)，直至細胞從組織塊周圍爬出并長滿約培養(yǎng)皿底80%左右區(qū)域。利用0.25%胰酶消化，傳代，將此代細胞記為第1代細胞（P1）[6]。P1代細胞長滿皿底約90%左右，再次使用0.25%胰酶消化、傳代，方法同前，使用2-4代細胞進行實驗。本實驗由南方醫(yī)科大學口腔醫(yī)院倫理委員會批準（批準號：2021-23），所有志愿者均已簽署知情同意書。

1.3 血小板濃縮制品的制備與血小板計數(shù)

1.3.1 CGF制備 各抽取10名18～25歲健康志愿者肘靜脈全血5 ml（不加入抗凝劑）。按照Medifuge公司離心機CGF制備程序離心，分為3層：上層為貧血小板血漿層，下層為紅細胞層，中間即為CGF凝膠層（擠壓CGF凝膠得到CGF析出液，CGF liquid）。取CGF層置于含有5 ml DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，靜置5 min，然后放置在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中，7 d后取出CGF浸出液，離心，過濾，-80 ℃保存，為CGF+DMEM培養(yǎng)基，用于細胞實驗。

1.3.2脂多糖（LPS）炎癥微環(huán)境制備 將第2-4代hPDLCs以每孔1×105個細胞的密度鋪于6孔板。在細胞生長至50%融合時進行分組：①Con組：hPDLCs+DMEM；②LPS組：hPDLCs+ 10 μg/ml LPS+DMEM；③CGF組：hPDLCs+ 10 μg/ml LPS+10%CGF+DMEM。

1.4 檢測PRP、CGF對hPDLCs增殖能力的影響

1.4.1ELISA 采用酶標儀分別對TGFβ1及IGF-1濃度進行檢測。按照酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒說明，分別設(shè)空白孔、標準孔、待測樣品孔，其中空白孔加標準品和樣品稀釋液100 μl，余孔分別加標準品或待測樣品100 μl。為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗均使用新的標準品溶液。按照酶標測試程序反應(yīng)后，最終用酶標儀在450 nm 波長處測量各孔待測液的OD值[7]。

1.4.2堿性磷酸酶（ALP）染色 選取生長良好的第2-4代hPDLCs以相同數(shù)量、相同條件接種于6孔板，待細胞生長約50%時換為成骨礦化誘導液，按照分組分別培養(yǎng)7 d后，4%多聚甲醛固定3 min，PBS洗滌2～3次，每孔加入1 ml BCIP/NBT工作液，室溫避光放置15 min，PBS洗滌2～3次，觀察ALP染色情況。

1.4.3 ALP活性檢測 選取生長良好的第2-4代hPDLCs以相同數(shù)量、相同條件接種于6孔板，待細胞生長約50%時換為成骨礦化誘導液，按照分組分別培養(yǎng)7 d后，PBS清洗3次，配置ALP活性測定工作液，添加工作液至96孔板，37 ℃環(huán)境中孵育30 min，加入顯色液。酶聯(lián)免疫檢測儀在405 nm波長條件下檢測，記錄數(shù)據(jù)。

1.4.4 qPCR檢測成骨相關(guān)基因mRNA表達 選取生長良好的第2-4代hPDLCs細胞，分別標記為上述分組。采用Trizol總RNA法提取各組細胞RNA，參照試劑盒說明書合成cDNA模板，用獲得的cDNA進行qPCR[8]。檢測成骨相關(guān)基因：ALP，Ⅰ型膠原蛋白（Collagen-Ⅰ，COL1）和骨鈣素（OCN）。以GAPDH作為組內(nèi)對照，對各組成骨基因表達量進行相對定量分析，見表1。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以[n（%）]表示，行χ2檢驗；計量資料以（x-±s）表示，行t檢驗；P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01表示統(tǒng)計學意義顯著。

2 結(jié)果

2.1 CGF中含有存在成骨相關(guān)生長因子 CGF+DMEM培養(yǎng)基中TGFβ1、IGF-1濃度均顯著高于DMEM培養(yǎng)基、CGF析出液（P<0.01），見圖1。

2.2 CGF對炎癥微環(huán)境下hPDLCs成骨抑制的修復 hPDLCs 細胞較為均一，無明顯雜質(zhì)細胞，形態(tài)穩(wěn)定，生長旺盛（見圖2A、圖2B）。進一步對hPDLCs進行LPS及CGF干預后，與Con組比較，ALP在LPS組明顯下降，而經(jīng)過C G F干預后A L P的濃度有所回升，甚至比Con組更高（見圖2C～圖2H）。CGF組干預后A L P活性顯著高于對照組、L P S組，且LPS組低于對照組、炎癥組（P<0.01），見圖2I。

2.3 炎癥微環(huán)境下CGF對成骨的抑制 炎癥微環(huán)境下，CGF組hPDLCs成骨標志物ALP、COL1及OCN的表達量顯著高于Con組、LPS組（P<0.01），見圖3。

3 討論

牙周炎患者的牙周局部微環(huán)境是高濃度炎癥微環(huán)境，會抑制牙周膜細胞的成骨分化，導致牙槽骨缺失，最終導致牙齒脫落[9]。CGF作為血小板濃縮制品，在血小板被激活后，可釋放多種生物活性物質(zhì)，包括多種生長因子，如血小板源性生長因子（PDGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等，可促進成纖維細胞和成骨細胞的增殖和分化、血管生成，從而加速傷口愈合[10]。PRP具有促進骨重建、減輕術(shù)后反應(yīng)、抗感染及炎癥調(diào)節(jié)等作用[11]。CGF作為第3代血小板濃縮制品，也具有促進細胞增殖、成骨分化和促進血管生成等作用[12]。從理論基礎(chǔ)上分析，CGF在炎癥微環(huán)境下對人牙周膜細胞成骨抑制作用具有一定的修復作用，但是具體的作用還需要進一步探究。

本研究結(jié)果顯示，采用使用10μg/ml LPS模擬牙周炎患者的高濃度炎癥微環(huán)境，發(fā)現(xiàn)其對牙周膜細胞（PDLCs）的成骨能力有顯著抑制作用。原因在于牙周炎的炎癥環(huán)境中含有TNF-ɑ、IL-1、IL-6等炎癥因子，炎癥微環(huán)境會抑制PDLCs的成骨分化能力，并受到多種通路調(diào)控。同時，CGF+DMEM培養(yǎng)基中TGFβ1、IGF-1濃度均顯著高于DMEM培養(yǎng)基、CGF析出液（P<0.01），提示CGF干預可促進TGFβ1、IGF-1濃度升高。由于CGF含有TGFβ、IGF-1等成分，是促進成骨所需物質(zhì)，并且TGFβ/Smad通路是經(jīng)典的成骨通路。TGFβ1是TGFβ超家族成員之一，TGFβ超家族包括TGFβ蛋白、活化素、蛋白及其他相關(guān)蛋白，TGFβ蛋白結(jié)合受體（TGFβRⅠ和TGFβRⅡ）后通過smad蛋白轉(zhuǎn)導信號至目標基因，促進細胞成骨分化。而TGFβ1作為TGFβ/ smad信號通路的啟動者，同時可誘導骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化。而在PDLCs中TGFβ1同樣有成骨誘導能力。因此，TGFβ1在CGF對PDLCs誘導成骨中起著重要作用。CGF組干預后ALP活性顯著高于對照組、LPS組，且LPS組低于對照組、炎癥組（P<0.01），表明在炎癥環(huán)境下，PDLCs內(nèi)成骨相關(guān)基因的表達降低，從而導致其成骨能力減弱，CGF內(nèi)所含的促成骨相關(guān)生長因子將發(fā)揮重要作用。因此，通過加入CGF，PDLCs炎癥狀態(tài)下的骨生成抑制作用被修復，甚至較對照組有所增加，說明CGF具備挽救PDLCs因炎癥環(huán)境所致的成骨抑制。該結(jié)論與張志媛等[13]研究結(jié)果基本一致。此外，炎癥微環(huán)境下，CGF組hPDLCs成骨標志物ALP，COL1及OCN的表達量顯著高于Con組、LPS組（P<0.01），提示炎癥微環(huán)境下，CGF的加入可使hPDLCs的成骨標志物ALP，COL1及OCN表達水平提高，從而促進骨髓間充質(zhì)干細胞增殖和成骨分化。因此，CGF可影響成骨相關(guān)基因表達，與細胞成骨分化關(guān)系密切。可見，CGF具有的成骨修復能力是其挽救PDLCs炎癥環(huán)境下成骨的重要基礎(chǔ)。

綜上所述，炎癥微環(huán)境下CGF可以促進hPDLCs增殖，增強ALP，COL1及OCN的表達，達到修復hPDLCs成骨抑制的作用。CGF有望在牙周組織重建中發(fā)揮重要作用，但其作用機制還需要進一步的臨床研究探究。CGF炎癥狀態(tài)下的成骨機制將是下一步研究的重點。

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編輯 扶田