快速溶劑萃取-固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定土壤中19 種抗生素殘留

戴軒宇， 蔡沐涵

（1.江蘇省南通環(huán)境監(jiān)測中心，江蘇 南通 226006；2.江蘇省南通中學(xué)， 江蘇 南通 226006）

0 引言

抗生素作為治療藥物和預(yù)防感染藥物在畜牧、水產(chǎn)業(yè)中被廣泛應(yīng)用， 而動(dòng)物體內(nèi)抗生素通過代謝等形式隨糞便和尿液等排出體外，并最終通過堆肥、糞便還田等形式進(jìn)入土壤等環(huán)境介質(zhì)中[1]。 由于當(dāng)前在畜牧、 水產(chǎn)行業(yè)中普遍存在過量使用抗生素的情況，故抗生素在土壤中累積不斷增強(qiáng)，其通過食物鏈對農(nóng)作物影響也不斷擴(kuò)大。因此，目前土壤中抗生素污染問題已成為國內(nèi)、 外環(huán)境和土壤科學(xué)界共同關(guān)注的熱點(diǎn)問題之一。 基于土壤中抗生素污染種類繁雜且多為痕量水平的特點(diǎn)，建立一種高靈敏度、覆蓋面廣的檢測方法對研究土壤中抗生素污染具有重要意義。且土壤基質(zhì)復(fù)雜，尋求一種高效的凈化和富集方法， 是建立土壤中多種痕量抗生素檢測方法的重點(diǎn)和難點(diǎn)[2]。

常用抗生素的檢測方法主要包括酶聯(lián)免疫法、微生物法、液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[2-10]。 目前主流的檢測方法為液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。該方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高、檢出限低等優(yōu)點(diǎn)， 特別適合復(fù)雜基質(zhì)中的痕量抗生素樣品分析[3]。土壤中抗生素的凈化富集方法主要包括串聯(lián)固相萃取、震蕩超聲-固相萃取、SPE-高效毛細(xì)管電泳、QuEChERS 等[2-6]。 馬麗麗等[2]采用SAXHLB 串聯(lián)固相萃取法測定土壤中3 類18 種抗生素，檢出限為0.07～8.9 μg/kg，加標(biāo)回收率為55.8%～97.4%。胡鈺等[3]采用震蕩超聲-固相萃取法測定土壤中7 類30 種抗生素，檢出限為0.013～1.21μg/kg，加標(biāo)回收率為44.8%～164%。 李興華等[5]采用SPE-高效毛細(xì)管電泳法測定土壤中三大類13 種抗生素，檢出限為1.33～3.33 μg/kg， 加標(biāo)回收率為78.5%～107%。 孟明輝等[6]采用QuEChERS 法測定土壤中兩大類20 種抗生素，檢出限為2.0～5.0 μg/kg，加標(biāo)回收率為61.4%～119%。 上述方法在低檢出限、穩(wěn)定的加標(biāo)回收率、快速高效檢測、多種類抗生素檢測等方面各有優(yōu)勢，但難以全面兼顧。

研究選擇先使用快速溶劑萃取儀進(jìn)行萃取，再使用全自動(dòng)固相萃取儀進(jìn)行凈化富集， 前處理方法快速高效，自動(dòng)化程度高，適用類別廣；通過UPLCMSMS 進(jìn)行檢測，方法特異性強(qiáng)、敏感性高、檢出限低。 建立ASE-ASPE-UPLC-MSMS 檢測方法可用于土壤中痕量水平的磺胺類、氟喹諾酮類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類等共19 種抗生素的同時(shí)測定。

1 試驗(yàn)方法

1.1 主要儀器、試劑與材料

主要儀器： 串聯(lián)四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀 （美國Waters，Xevo TQ-s-micro QEA0318）、全自動(dòng)固相萃取儀（美國GL ASPE900）、 快速溶劑萃取儀（CEM，EDGE，EY2141）、 全自動(dòng)定量濃縮儀（BUCHI，Syncore Plus）、冷凍干燥機(jī)（BUCHI，L-200）、超純水機(jī)（美國Millipore，Milli-Q Inte A10）。

試劑與材料：①液體試劑：甲醇、乙腈（美國Merck，色譜純），甲酸、磷酸（美國Honeywell，色譜純）；②固體試劑：無水硫酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉、磷酸氫二鈉十二水合化合物、 檸檬酸一水合化合物（德國Sigma，色譜純），將27.219 g 磷酸氫二鈉十二水化合物、33.621 g 乙二胺四乙酸二鈉和13.029 g檸檬酸一水化合物溶解于1 000 mL 超純水中，配制得到的Na2EDTA-Mcilvaine 緩沖液（pH 值為4）；③耗材：C18 固相萃取小柱（Waters Sep-pak，500 mg 每6 mL），HLB 固相萃取小柱（Oasis，500 mg 每6 mL），HLB 固相萃取小柱（Oasis，150 mg 每6 mL），聚四氟乙烯濾膜（Waters，13 mm，0.22 μm）。

抗生素標(biāo)準(zhǔn)品：①磺胺類（SAs）：甲醇中磺胺嘧啶（質(zhì)量濃度為1 000 mg/L）、甲醇中磺胺甲嘧啶（質(zhì)量濃度為1 000 mg/L）、甲醇中磺胺二甲嘧啶（質(zhì)量濃度為1 000 mg/L）、甲醇中磺胺對甲氧嘧啶（質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL）、甲醇中磺胺間甲氧嘧啶（質(zhì)量濃度為1 000 mg/L）、甲醇中磺胺氯噠嗪（質(zhì)量濃度為1 000mg/L）、甲醇中甲氧芐啶（質(zhì)量濃度為1000 mg/L）；②氟喹諾酮類（FQs）：甲醇中諾氟沙星（質(zhì)量濃度為1 000 mg/L）、 甲醇中環(huán)丙沙星 （質(zhì)量濃度為1 000 mg/L）、甲醇中恩諾沙星（質(zhì)量濃度為1 000 mg/L）、甲醇中氧氟沙星（質(zhì)量濃度為1 000 mg/L）；③四環(huán)素類（TCs）：甲醇中四環(huán)素（質(zhì)量濃度為100 mg/L）、甲醇中金霉素（質(zhì)量濃度為100 mg/L）、甲醇中土霉素（質(zhì)量濃度為100 mg/L）；④大環(huán)內(nèi)酯類（MLs）：脫水紅霉素A（1 mg）、甲醇中克拉霉素（質(zhì)量濃度為100 μg/mL）、甲醇中羅紅霉素（質(zhì)量濃度為100 mg/L）、甲醇中替米考星（質(zhì)量濃度為1 000 mg/L）、甲醇中泰樂菌素（質(zhì)量濃度為1 000 mg/L）；⑤內(nèi)標(biāo)：甲醇中環(huán)丙沙星-d8（質(zhì)量濃度為100 mg/L）、甲醇中磺胺甲惡唑-d4（質(zhì)量濃度為100 mg/L）、甲醇中磺胺二甲基嘧啶-d4（質(zhì)量濃度為100 mg/L）、甲醇中甲氧芐氨嘧啶-d3（質(zhì)量濃度為100 mg/L）、甲醇中羅紅霉素-d7（質(zhì)量濃度為100 mg/L）。

1.2 配制標(biāo)準(zhǔn)溶液

以甲醇為溶劑，將19 種抗生素標(biāo)準(zhǔn)品配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于-18 ℃溫度條件下儲(chǔ)存。 使用前，以體積分?jǐn)?shù)為10% 甲醇水溶液為溶劑， 將質(zhì)量濃度為100 mg/L 的19 種抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配置成質(zhì)量濃度為1 mg/L 混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液， 將5 種抗生素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品配置成質(zhì)量濃度為1 mg/L 混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，并逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度分別為2，5，10，20，50，100，200 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 采集樣品

依據(jù)土壤環(huán)境監(jiān)測技術(shù)規(guī)范（HJ/T 166—2004）要求，選取長江下游地區(qū)農(nóng)田表層土壤（深度為0～20 cm），采用單對角線五點(diǎn)法采集表層土壤樣品，去除其中樹枝、秸稈、石子、草根等異物后裝入潔凈的棕色玻璃瓶，于0～4 ℃溫度下冷藏保存。

1.4 處理樣品

先將土壤樣品置于-18 ℃溫度下冷凍一周后經(jīng)凍干機(jī)進(jìn)行干燥后研磨， 再準(zhǔn)確稱取研磨后5 g 土壤樣品與10 g 無水硫酸鈉均勻混合后置于60 mL Q-Cup 萃取罐中， 最后加入25 ng 抗生素內(nèi)標(biāo)混合物（環(huán)丙沙星-d8、磺胺甲惡唑-d4、磺胺二甲基嘧啶-d4、甲氧芐氨嘧啶-d3、羅紅霉素-d7）。 選擇萃取溶劑甲醇-Na2EDTA-Mcilvaine(體積分?jǐn)?shù)為1 ∶1)緩沖液，萃取條件：溶劑體積為10 mL，溫度為50 ℃，靜置萃取2 min，潤洗體積為10 mL，萃取2 次，收集全部萃取液至定量濃縮儀濃縮至1 mL，加水稀釋至200 mL 后加入0.2 g Na2EDTA，再加入磷酸調(diào)節(jié)萃取液pH 值至2。

依次使用10 mL 甲醇、10 mL 超純水及10 mL鹽酸水溶液（pH 值為2）活化HLB 小柱，以2 mL/min速度將樣品溶液上樣至HLB 小柱。 上樣完成后，以10 mL 超純水淋洗小柱，棄去淋洗液，通氮?dú)飧稍?0 min；再用10 mL 甲醇溶液分2 次分別以2 和1 mL/min速度洗脫， 洗脫液定量濃縮至近干， 用體積分?jǐn)?shù)為10%甲醇-水溶液定容至1 mL，過0.22 μm 聚四氟乙烯濾膜后待UPLC-MSMS 上機(jī)分析。

1.5 分析條件

色譜柱： 沃特世ACQUITYBEH-C18 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相：A相體積分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸水溶液、B 相體積分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸甲醇溶液； 流速：0.4 mL/min。 梯度洗脫程序：0～2.5 min，10%B～15%B；2.5～5.0 min，15%～50%B；5.0 ～ 6.0 min，50% B ～ 90%B；6.0 ～ 7.5 min，90%B；7.5～8.0 min，90%B～10%B；8.0 ～ 10.0 min，10%B。

離子源：采用電噴霧離子源（ESI）質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）進(jìn)行樣品檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 優(yōu)化分析條件

2.1.1 優(yōu)化質(zhì)譜條件

根據(jù)各抗生素分子結(jié)構(gòu)特征，選用ESI+模式對19 種抗生素進(jìn)行質(zhì)譜分析。 對每種抗生素分別進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化和進(jìn)行Full scan 全掃描、 子離子掃描和母離子掃描，參考化合物的基本信息，確定目標(biāo)化合物的母離子和子離子對， 選擇確定目標(biāo)化合物的定量、定性離子對后，在MRM 模式下，對目標(biāo)化合物進(jìn)行錐孔電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化。 經(jīng)試驗(yàn)優(yōu)化后確定的19 種抗生素的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表1 19 種抗生素的質(zhì)譜參數(shù)

2.1.2 優(yōu)化色譜流動(dòng)相

試驗(yàn)選擇通用的C18 色譜柱。 選擇的流動(dòng)相A相-B 相組合分別為： 甲醇-水、 甲醇-（體積分?jǐn)?shù)為0.1%）甲酸水溶液、（體積分?jǐn)?shù)為0.1%）甲酸甲醇溶液-（體積分?jǐn)?shù)為0.1%）甲酸水溶液等。 按照1.5 對色譜分離效果和響應(yīng)情況進(jìn)行比較分析。選擇甲醇-水流動(dòng)相組合時(shí)，部分目標(biāo)化合物未出峰；選擇（體積分?jǐn)?shù)為0.1%）甲酸甲醇溶液-（體積分?jǐn)?shù)為0.1%）甲酸水溶液流動(dòng)相組合時(shí)， 各目標(biāo)化合物的峰形均明顯優(yōu)于甲醇-（體積分?jǐn)?shù)為0.1%）甲酸水溶液流動(dòng)相組合。 故選?。w積分?jǐn)?shù)為0.1%）甲酸甲醇溶液-（體積分?jǐn)?shù)為0.1%）甲酸水溶液作為流動(dòng)相組合。

2.2 優(yōu)化介質(zhì)濃度

19 種抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖像見圖1。

圖1 19 種抗生素（質(zhì)量濃度為50 μg·L-1）的總離子流

比較不同的有機(jī)相比例（體積分?jǐn)?shù)分別為10%，20%，50%，100%甲醇水）下，質(zhì)量濃度為50 μg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液各目標(biāo)化合物的出峰情況。 當(dāng)有機(jī)相比例逐步降低時(shí)， 各目標(biāo)化合物的峰形及響應(yīng)值均有所改善，各目標(biāo)化合物在進(jìn)樣介質(zhì)為甲醇（體積分?jǐn)?shù)為50%） 水溶液時(shí)， 響應(yīng)值為2.14×106～8.63×107，在進(jìn)樣介質(zhì)為甲醇（體積分?jǐn)?shù)為10%）水溶液時(shí)，響應(yīng)值為4.39×106～1.85×108。 因此選取體積分?jǐn)?shù)為10%甲醇水溶液作為進(jìn)樣介質(zhì)。

2.3 優(yōu)化提取條件

選取飲用水源地周邊某土壤樣品檢測， 該樣品中各目標(biāo)組分均未檢出。樣品經(jīng)凍干研磨，添加抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液使得加標(biāo)水平為20 μg/kg 后用于各項(xiàng)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

采用快速溶劑萃取方式對土壤樣品中的抗生素進(jìn)行提取，在不同溫度（40，50，60，70 ℃）條件下，使用10 mL 不同組成的萃取劑（乙腈-水（體積分?jǐn)?shù)為1 ∶1）、甲醇-水（體積分?jǐn)?shù)為1 ∶1）、乙腈-Na2EDTAMcilvaine （體積分?jǐn)?shù)為1 ∶1） 緩沖液、 甲醇-Na2EDTA-Mcilvaine（體積分?jǐn)?shù)為1 ∶1）緩沖液），對目標(biāo)化合物提取效果進(jìn)行考察， 萃取溫度對抗生素回收率的影響（n=3）和不同萃取劑對抗生素回收率的影響（n=3）分別見圖2、圖3。 由圖2、圖3 可以看出， 甲醇-Na2EDTA-Mcilvaine 緩沖液對磺胺類、四環(huán)素類、 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素均有很好的提取效果，而乙腈-Na2EDTA-Mcilvaine 緩沖液對氟喹諾酮類抗生素提取效果更好， 考慮到甲醇-Na2EDTAMcilvaine 緩沖液對氟喹諾酮類抗生素提取效果的影響不超過15%， 最終選取甲醇-Na2EDTAMcilvaine 緩沖液作為萃取劑。 萃取溫度方面，當(dāng)萃取溫度為50 ℃時(shí)四環(huán)素類化合物均有較好的回收率； 當(dāng)萃取溫度分別為50，60 ℃時(shí)大環(huán)內(nèi)酯類化合物均有較好的回收率， 但當(dāng)萃取溫度升高至70 ℃時(shí)，該類化合物回收率均明顯下降；磺胺類及氟喹諾酮類化合物在所選溫度條件下回收率均無明顯差別；綜合考慮選取50 ℃作為萃取溫度。每次使用10 mL 萃取劑對土壤樣品進(jìn)行提取， 經(jīng)2 次提取后，第3、第4 次的提取液中均未檢測到目標(biāo)化合物。因此，最終確定提取條件為使用甲醇-Na2EDTA-Mcilvaine（體積分?jǐn)?shù)為1 ∶1）緩沖液在萃取溫度為50℃下對土壤樣品萃取2 次，每次使用10mL 萃取劑。

圖2 萃取溫度對抗生素回收率的影響（n=3）

圖3 不同萃取劑對抗生素回收率的影響（n=3）

2.4 優(yōu)化凈化條件

2.4.1 選擇固相萃取柱

比較C18（500 mg 每6 mL），HLB（500 mg 每6 mL）和HLB（150 mg 每6 mL）3 種固相萃取柱對各類抗生素的萃取效果，具體見圖4。

圖4 不同固相萃取柱對抗生素回收率的影響（n=3）

由圖4 可以看出，HLB 柱對極性和非極性化合物均有較好的吸附能力，而C18 柱對非極性化合物有較好的吸附能力，HLB 柱對大部分目標(biāo)化合物的萃取效果優(yōu)于C18 柱，均有更好的回收率。 而HLB（500 mg/6 mL）相較于HLB（150 mg/6 mL）固相萃取柱對目標(biāo)化合物回收率更好。

2.4.2 選擇萃取液pH 值

比較酸性到堿性的5 個(gè)pH 值 （pH 值分別為2，4，6，8，10）條件下對各類抗生素回收率的影響，具體見圖5。

圖5 pH 值對抗生素回收率的影響（n=3）

由圖5 可以看出，萃取液在酸性（pH 值分別為2，4 和6）條件下，磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類抗生素的回收率較接近， 且均明顯優(yōu)于堿性條件下的回收率；萃取液pH 值分別為2 和10 時(shí)，氟喹諾酮類抗生素均有較好的回收率；因此，最終選擇調(diào)節(jié)萃取液pH 值至2 后上樣凈化以獲得較好的回收率。

2.4.3 選擇洗脫液體積

在抗生素檢測中常使用甲醇作為洗脫液。pH 值為2 時(shí)，比較5，8，10，12 mL 甲醇溶液對吸附在固相萃取柱上各類抗生素的洗脫效果，具體見圖6。 由圖6 可以看出， 各類抗生素的回收率隨甲醇體積增加而升高，當(dāng)甲醇體積至10 mL 后，抗生素的回收率不再變化。 最終確定甲醇洗脫液的體積為10 mL。

圖6 洗脫液體積對抗生素回收率的影響

2.5 質(zhì)量保證和質(zhì)量控制評(píng)價(jià)

2.5.1 方法的線性范圍與檢出限

19 種抗生素的方法檢出限、定量限及線性范圍見表2。

表2 19 種抗生素的方法檢出限、定量限及線性范圍

由表2 可以看出， 按照1.4 節(jié)檢測抗生素質(zhì)量濃度為2～200 μg/L 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，19 種抗生素的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.99。 以3倍信噪比（3 S/N）計(jì)算方法檢出限，19 種抗生素的方法檢出限為0.03～0.69 μg/kg。

2.5.2 方法的回收率與基質(zhì)效應(yīng)

選取飲用水源地附近土壤樣品經(jīng)凍干研磨后準(zhǔn)確稱量5 g，添加抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液后使得加標(biāo)水平分別為4，20 μg/kg，每個(gè)濃度水平設(shè)3 組平行，按照1.3 節(jié)對加標(biāo)土樣進(jìn)行前處理，并按照1.4 節(jié)進(jìn)行分析， 當(dāng)加標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4 和20 μg/kg 時(shí)，比較19 種抗生素在純?nèi)軇┖突|(zhì)提取液中的響應(yīng)情況，對方法的基質(zhì)效應(yīng)（ME）進(jìn)行評(píng)估。 19 種抗生素在土壤樣品中的加標(biāo)回收率及基質(zhì)效應(yīng)見表3。 由表3 可以看出，2 種濃度下19 種抗生素的平均加標(biāo)回收率(RSDs)（n=3）為45.2%～149% ，且其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均為2.8%～19.6%，均小于20%，說明該分析方法性能良好。 土霉素和金霉素均表現(xiàn)為強(qiáng)基質(zhì)增強(qiáng)作用（155% ～177%），故有較高的回收率（106%～149%）。 其它17 種抗生素的基質(zhì)效應(yīng)范圍均為86.8% ～99.2%，均表現(xiàn)為弱基質(zhì)作用。

表3 19 種抗生素在土壤樣品中的加標(biāo)回收率及基質(zhì)效應(yīng)

2.6 測定農(nóng)田土壤樣品

采集長江下游沿岸飲用水源地周邊6 個(gè)表層土壤樣品及畜禽養(yǎng)殖糞便還田點(diǎn)位12 個(gè)土壤樣品，在1.3，1.4 節(jié)實(shí)驗(yàn)條件下， 對樣品中19 種抗生素殘留進(jìn)行分析。 土壤樣品中的抗生素含量見圖7。 由圖7可以看出， 飲用水源地周邊土壤6 個(gè)樣品中均未檢出目標(biāo)化合物。畜禽養(yǎng)殖糞便還田地塊12 個(gè)土壤樣品中，共檢出19 種抗生素中的9 種（分別為諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、土霉素、金霉素、克拉霉素、羅紅霉素、泰樂菌素）。其中諾氟沙星和環(huán)丙沙星為土壤樣品中含量最高的2 種抗生素， 其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為16.0～38.4 和12.7～24.2 μg/kg。四環(huán)素類抗生素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在2.03 ～ 15.2 μg/kg 之間， 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在0.115 ～1.57 μg/kg 之間，磺胺類抗生素均未檢出。抗生素檢出類別和濃度水平與之前對長三角地區(qū)土壤抗生素殘留水平的相關(guān)研究結(jié)果[4，11]基本一致。 氟喹諾酮類抗生素在土壤中殘留水平較高，推斷原因?yàn)榇祟惪股卦谕寥乐形叫詮?qiáng)，降解較慢，可長時(shí)間地穩(wěn)定殘留。

圖7 土壤樣品中的抗生素含量

3 結(jié)論

為同時(shí)測定土壤中痕量水平的4 類19 種抗生素，建立一種快速溶劑萃取-全自動(dòng)固相萃取-超高效液相色譜/三重四級(jí)桿質(zhì)譜法對長江下游地區(qū)18個(gè)點(diǎn)位的土壤樣品進(jìn)行檢測， 在畜禽養(yǎng)殖糞便還田地塊土壤樣品中，檢出喹諾酮類、四環(huán)素類及大環(huán)內(nèi)酯類共9 種抗生素， 在飲用水源地周邊土壤樣品中未檢出抗生素。該方法的檢出限、定量限、線性范圍、回收率等均滿足土壤中抗生素的分析要求， 且操作簡單、快速可行、溶劑用量較少，包含了目前廣泛使用的各種抗生素種類[12-15]，適用于土壤中多種痕量抗生素殘留的同時(shí)檢測。