不同茶樹品種中CsNUDX1基因催化功能、啟動子結構及功能分析

楊霽虹，周漢琛，徐玉婕

不同茶樹品種中基因催化功能、啟動子結構及功能分析

楊霽虹，周漢琛*，徐玉婕

安徽省農業(yè)科學院茶葉研究所，安徽 黃山 245000

香葉醇是茶樹中重要的萜烯類化合物，在不同茶樹品種中的積累存在較大差異。茶樹核苷二磷酸水解酶（Nucleoside diphosphate hydrolase，Nudix）基因可促進香葉醇及其糖苷在茶樹中的積累。為探究該基因在不同茶樹品種中的催化功能及調控差異，分析了7個茶樹品種中香葉醇的積累差異及時空表達變化，同時分析了該基因的催化功能及其啟動子結構和功能差異。結果顯示，表達量與香葉醇含量變化呈顯著正相關（0.805）；香葉醇在中國變種茶樹嫩梢中的含量顯著高于阿薩姆變種茶樹。農桿菌介導的本氏煙草遺傳轉化體系表明，不同茶樹品種的均能促進香葉醇的生物合成。啟動子活性分析顯示，云抗10號茶樹品種中的啟動子活性較弱；結構分析表明，云抗10號茶樹品種啟動子在轉錄起始位點–33處有185堿基的序列插入，使得增強元件CAAT-box位于–133處（其他品種CAAT-box均位于–47處）。研究結果表明不同茶樹品種中的均能夠促進香葉醇的生物合成，但啟動子區(qū)域遺傳多樣性使得其表達水平有差異。

茶樹；香葉醇；基因；功能分析；啟動子分析

研究顯示野生型阿薩姆茶樹（Ancestralvar.）、栽培型阿薩姆茶樹（Cultivatedvar.，CSA）和中國變種茶樹（var.，CSS）在遺傳進化樹上分別屬于不同分枝，且目前我國茶樹栽培品種遺傳背景差異較大，其內源代謝途徑中關鍵酶基因表達及代謝產物積累存在差異[1-3]。Zhang等[4]研究顯示，云南、貴州、廣東栽培茶樹品種多為阿薩姆變種；安徽、浙江及福建北部栽培茶樹品種間親緣關系較近，遺傳背景差異較小，區(qū)別于福建南部和臺灣栽培品種，也區(qū)別于江西、湖北、陜西等地區(qū)栽培品種，表明了茶樹品種豐富的遺傳多樣性。Takeo[5]分析了33個茶樹品種（品系）中香葉醇及芳樟醇的含量，并計算了萜烯指數，發(fā)現變種茶樹中的萜烯指數最高可達到1；中國種與阿薩姆種雜交品種中萜烯指數分布范圍為0.21～0.76；日本地區(qū)栽種的變種茶樹中萜烯指數為0.12～0.69，表明不同茶樹品種中芳樟醇和香葉醇含量存在顯著差異。

香葉醇作為茶葉中重要的單萜烯醇，是綠茶和紅茶的重要呈香物質，其閾值低（6～75?μg·L-1）[6]，且具有濃郁的玫瑰花香和甜香特征。茶樹中的香葉醇主要以糖苷形式存在，在加工過程中，由內源糖苷水解酶催化并釋放出游離態(tài)香葉醇[7-8]。羅勒（）[9]、細毛樟（）[10]、紫蘇（）[11]、長春花（）[12]等植物中的香葉醇可由香葉醇合成酶（Geraniol synthase，GES）直接催化底物牻牛兒基焦磷酸（Geranyl diphosphate，GPP）生成[13]。Magnard等[14]研究發(fā)現，玫瑰中的核苷二磷酸水解酶（Nucleoside diphosphate hydrolase，Nudix）基因可以脫去GPP的單磷酸基團形成牻牛兒基單磷酸（Geranyl monophosphate，GP），再通過另一種磷酸水解酶催化合成香葉醇，這是玫瑰中合成香葉醇的主要途徑。在茶樹中，Nudix基因家族中定位于細胞質的可以顯著促進香葉醇及其糖苷在轉基因植物中的積累[15-16]。研究顯示，茶樹萜類合成酶轉基因煙草葉片中可檢測到香葉醇的微弱積累，但體外酶活反應中該基因重組蛋白無法催化底物GPP生成香葉醇[17]。

香葉醇作為茶樹中重要的單萜類物質，對成品茶香氣品質形成具有重要作用。基于茶樹資源的遺傳多樣性，本研究擬通過分析不同茶樹品種中香葉醇的積累變化及功能差異，以期探究遺傳背景差異下的香葉醇生物合成機制，為后續(xù)研究其代謝途徑提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿薩姆茶樹品種佛香3號（FX3）、云抗10號（YK10）、雪芽100（XY100）、紫娟（ZJ），中國種茶樹品種舒茶早（SCZ）、中茶108（ZC108）、浙農117（ZN117）均種植于安徽省農業(yè)科學院茶葉研究所試驗基地，于10月中旬按一芽一葉標準采摘，取樣后立即置于液氮中速凍，并于?80?℃冰箱保存?zhèn)溆?。本氏煙草（）生長于溫室（白天25?℃，夜晚23?℃）中，光照時間為16?h。

AR2000廣譜糖苷酶購自上海普邁生物科技有限公司；大腸桿菌DH5購自上海吐露港生物科技有限公司；根癌農桿菌GV3101購自上海唯地生物技術有限公司；RNA提取試劑盒（DP441）購自天根生化科技有限公司；cDNA反轉錄試劑盒（RR036A）、I限制性內切酶（1093A）、I限制性內切酶（1078A）、QuickCut?d Ⅲ限制性內切酶（1615）、QuickCut?H Ⅰ限制性內切酶（1605）均購自TaKaRa公司；KOD One PCR Master Mix（KMM-101）聚合酶購自TOYOBO公司；平末端克隆試劑盒5?min TOPO-Blunt Cloning Kit（C602-01）、快速克隆試劑盒（ClonExpress?Ⅱ One Step Cloning Kit）和熒光定量分析試劑（Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；質粒提取試劑盒（?Plasmid MiniPrep Kit）和膠回收試劑盒（?PCR Purification Kit）購自北京全式金生物技術股份有限公司。

1.2 儀器與設備

ME104電子天平，梅特勒-托利多（上海）有限公司；RCT basic磁力加熱攪拌器，德國艾卡公司；GCMS-QP2020 NX氣相色譜質譜聯用儀，日本Shimadzu公司；50/30?μm DVB/CAR/PDMS萃取頭及手動固相微萃?。⊿PME）進樣器，美國Supelco公司；LightCycler 96實時熒光定量PCR儀，瑞士Roche公司；SimpliAmp PCR儀，賽默飛世爾科技有限公司；DYY-6D電泳儀，北京六一生物科技有限公司；GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；MQT-60R振蕩培養(yǎng)箱，上海旻泉儀器有限公司；Centrifuge 5804R高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 揮發(fā)性化合物吸附方法

參考文獻[15]中方法，不同茶樹品種的嫩梢和瞬時侵染的本氏煙草葉片用液氮研磨粉碎后，準確稱取0.1?g樣品，加入2?mL蒸餾水、200?μL 200?mg·mL-1AR2000廣譜糖苷酶和1?μL 10?μg·mL-1癸酸乙酯，于37?℃水浴下反應20?min，然后利用SPME萃取頭（50/30?μmol·L-1DVB/CAR/PDMS Stableflex，USA）于65?℃水浴下吸附30?min，用于GC-MS分析。

1.3.2 GC-MS分析

色譜柱為DB-5MS（30?m×0.25?mm×0.25?μm，Agilent，USA）。具體參數如下：總流量為17?mL·min-1，柱流量為1?mL·min-1，線速率為36.1?cm·s-1，分流比為10∶1，吹掃流量為6?mL·min-1。吸附完成的SPME萃取頭立即于250?℃進樣口中解吸附5?min。柱溫箱升溫程序：40?℃保留5?min，以3?℃·min-1速率上升到85?℃并保留2?min，以3?℃·min-1速率上升到110?℃并保留1?min，以5?℃·min-1速率上升到200?℃并保留1?min，最后以15?℃·min-1速率上升到260?℃并保留3?min。

以癸酸乙酯為內標，以癸酸乙酯峰面積與化合物峰面積之比計算香葉醇含量。試驗重復3次。

1.3.3 基因表達分析

1.3.4 基因、啟動子克隆及載體構建

將茶樹基因組數據中轉錄起始位點上游1?500?bp核苷酸序列設為該基因啟動子區(qū)域，利用南京諾唯贊官網提供的引物設計網站（https://crm.vazyme.com/ce-tool/ simple.html）設計克隆引物（表1）。

以不同茶樹品種的cDNA為模板，利用表1中引物（--F和--R）進行全長克隆，1%瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶，回收后的目的片段利用ClonExpress?ⅡOne Step Cloning Kit試劑盒連接到經Ⅰ、Ⅰ雙酶切后的植物表達載體pZP121上，用于過量表達分析（pZP121-）。以不同茶樹品種的基因組DNA為模板，利用表1中引物（F和--R）進行啟動子克隆，1%瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶，回收后的目的片段利用ClonExpress?ⅡOne Step Cloning Kit試劑盒連接到經d Ⅲ、H Ⅰ雙酶切后的植物表達載體pBI121上，用于-葡萄糖醛酸酶（-glucuronidase，GUS）染色分析（pBI121-）。連接載體后轉化大腸桿菌DH5，過夜培養(yǎng)后挑選陽性克隆送至擎科生物科技股份有限公司進行測序。

表1 引物序列

注：加粗字母表示酶切位點；下劃線序列表示基因特異性引物

Note: The bold letters indicte the restriction site. The underlined sequences indicate gene-specific primers

1.3.5基因啟動子結構分析

利用CLUSTALW（www.genome.jp/ tools- bin/clustalw）和GENEDOC軟件比對序列差異，并利用PlantCARE網站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）在線分析啟動子序列的順式作用元件。

1.3.6 煙草瞬時表達

將測序成功的重組質粒pZP121-和pBI121-用凍融法轉化至根癌農桿菌GV3101，PCR鑒定陽性克隆后，避光振蕩培養(yǎng)（28?℃，200?r·min-1，16～24?h）并侵染本氏煙草葉片。具體操作方法如下：GV3101菌液培養(yǎng)至適宜濃度（OD600值約為0.8），3?500?r·min-1離心5?min收集菌體，用緩沖液（5?mg·mL-1-葡萄糖，50?mmol·L-1MES，2?mmol·L-1Na3PO4·12H2O，20?mg·L-1乙酰丁香酮）洗滌2次，然后用緩沖液重懸至OD600為0.6左右；采用一次性無菌注射器將菌液從下表皮緩慢注射入本氏煙草葉片中，設置3個生物學重復[20]。

分別以注射緩沖液和野生型本氏煙草葉片為對照，收取侵染3～4?d的本氏煙草葉片，于–80?℃冰箱保存。按照1.3.1章節(jié)和1.3.2章節(jié)方法測其香葉醇的含量。

1.3.7 GUS組織染色分析

GUS染色液由50?mmol·L-1PBS（pH 7.2），0.1% Triton X-100，2?mmol·L-1K4[Fe(CN)6]·3H2O，2?mmol·L-1K3[Fe(CN)6]，10?mmol·L-1EDTA，2?mmol·L-15-溴-4-氯-3-吲哚--葡糖苷酸環(huán)己胺鹽（X-Gluc）組成，將處理后的葉片（侵染3～4?d）立即浸沒在染色液中，于37?℃培養(yǎng)箱中避光孵育12?h，然后利用75%乙醇脫色，用于后續(xù)觀察。

1.4 數據分析

利用SPSS 20.0軟件對不同樣品中香葉醇含量及基因表達量進行方差分析，采用Duncan法分析不同樣品間的顯著性（<0.05）。

2 結果與分析

2.1 不同月份茶樹中香葉醇合成酶基因表達分析

基于可促進茶樹中香葉基櫻草糖苷的積累[15]，萜類合成酶轉基因本氏煙草葉片中也可檢測到香葉醇的積累[17]，本研究分析了舒茶早茶樹品種不同月份嫩梢中香葉醇的代謝譜與和基因的表達譜。

結果表明，茶樹嫩梢中的香葉醇含量在3、4、5月較高，在1、2、7月較低（圖1）。qRT-PCR分析表明，和在不同月份茶樹嫩梢中的表達模式較為接近，均在3月表達量最高。通過Pearson運算方法分析了不同月份嫩梢中香葉醇含量與、相對表達量間的相關性，結果顯示，相對表達量與香葉醇含量的相關系數（）為0.805；相對表達量與香葉醇含量也存在顯著正相關性（=0.818），表明和與茶樹中香葉醇的生物合成密切相關，但由于體外酶活反應中無法催化底物GPP生成香葉醇，本研究不進行討論。

2.2 香葉醇含量及CsNUDX1-cyto、CsTPS10表達分析

本研究利用HS-SPME-GCMS分析了3個CSS（舒茶早、中茶108、浙農117）和4個CSA茶樹品種（佛香3號、云抗10號、雪芽100、紫娟）鮮葉中的香葉醇含量。由圖2可知，不同茶樹品種鮮葉中的香葉醇含量存在顯著差異，舒茶早鮮葉中的香葉醇含量最高（7.65?μg·g-1），其次為中茶108。CSS茶樹品種鮮葉中的香葉醇含量均顯著高于CSA茶樹品種鮮葉，如舒茶早中的香葉醇含量約為雪芽100（0.08?μg·g-1）的95.6倍。

芳樟醇是茶樹中另一個重要的單萜化合物，與香葉醇的合成前體物質相同，均為GPP[8]。本研究同時分析了7個茶樹品種鮮葉中芳樟醇及其氧化物的含量，結果表明，兩類茶樹變種鮮葉中的芳樟醇含量無顯著性差異，但芳樟醇呋喃型氧化物（芳樟醇氧化物Ⅰ和芳樟醇氧化物Ⅱ）在CSS茶樹中的含量顯著高于CSA茶樹品種。

qRT-PCR分析表明，在中茶108嫩梢中的表達量最高，在浙農117嫩梢中的表達量最低；在雪芽100中的表達量最高，在佛香3號、云抗10號、紫娟及浙農117中的表達量無顯著差異。不同月份茶樹中香葉醇含量與和表達量呈顯著正相關，而不同茶樹品種中香葉醇積累與這兩個基因表達量的相關性不明顯，推測茶樹遺傳背景多樣性使得香葉醇生物合成存在差異調控。

圖1 香葉醇含量與CsTPS10、CsNUDX1-cyto表達量的相關性分析

注：不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）

2.3 CsNUDX1-cyto的功能分析

為探究不同茶樹品種中CsNUDX1-cyto催化能力是否存在差異，本研究克隆了7個茶樹品種中的，并利用農桿菌介導的遺傳轉化體系將其瞬時過量表達于本氏煙草葉片中，以檢測香葉醇積累差異。以注射緩沖液的本氏煙草葉片（CK）為陰性對照，已鑒定功能的舒茶早為陽性對照，采用HS-SPME-GCMS方法檢測了7個處理組葉片中香葉醇的豐度變化。結果表明，與陰性對照及野生型本氏煙草葉片相比，瞬時過量表達7個茶樹品種基因均能夠顯著促進香葉醇的積累；雪芽100的過表達葉片中香葉醇積累量高于陽性對照（圖3）。

2.4 CsNUDX1-cyto啟動子活性分析

qRT-PCR結果表明（圖4），在不同茶樹品種中的表達水平存在顯著差異，但均能促進香葉醇的積累?；诖?，本研究構建了7個品種的proCsNUDX11500-cyto:GUS融合載體轉化根癌農桿菌GV3101，使其在煙草葉片中瞬時表達，然后采用X-Gluc染色法分析各啟動子的活性。為消除葉片生長發(fā)育狀態(tài)對X-Gluc染色的影響，本研究以ZC108-proCsNUDX11500-cyto:GUS為對照，在同一片葉子兩側分別注射不同表達載體。結果顯示，7個茶樹品種基因啟動子均能正常驅動基因表達。與對照ZC108-proCsNUDX11500-cyto:GUS相比，雪芽100、紫娟、佛香3號、浙農117、舒茶早5個品種的proCsNUDX11500-cyto活性差異較小（GUS染色程度相近），而云抗10號茶樹品種的proCsNUDX11500-cyto活性較弱。

注：WT表示野生型本氏煙草葉片，CK表示對照，FX3、YK10、XY100、ZJ、SCZ、ZC108、ZN117分別表示佛香3號、云抗10號、雪芽100、紫娟、舒茶早、中茶108、浙農117過表達樣品

注：以中茶108茶樹品種CsNUDX1-cyto啟動子為陽性對照，同一片葉子兩側分別注射不同表達載體

2.5 CsNUDX1-cyto啟動子結構分析

不同茶樹品種基因啟動子序列比對結果如圖5所示。云抗10號啟動子在轉錄起始位點–33處有185堿基的序列插入，其插入序列中雖存在TATA-box等重要啟動元件，但重要增強子元件CAAT-box距離轉錄起始位點較遠（位于–113處），其他品種CAAT-box位于–47處。CAAT-box可控制轉錄起始頻率，研究發(fā)現，TATA-box上游存在CAAT-box時，基因的表達會增強[21]。推測云抗10號的啟動子活性弱可能與–33處堿基的序列插入有關。

通過Plant CARE對啟動子序列進行順式作用元件分析，除了包含負責基因轉錄起始準確性及高效性的TATA-BOX和CAAT-BOX，還包含多個非生物逆境調控元件，如光響應元件G-box、Box4、GT1-motif和Box Ⅱ，防御應激響應元件STRE，脫落酸響應元件ABRE、ABRE4，生長素響應元件TGA-element，赤霉素響應元件P-box，乙烯響應元件ERE，茉莉酸甲酯響應元件AAGAA-motif、CTAG-motif、MYC和MYB等。

3 討論

本研究結果顯示，不同月份樣品中的和表達量變化與香葉醇積累均呈顯著正相關，表明這兩個基因與香葉醇生物合成密切相關。不同月份樣品中的表達量與香葉醇積累的相關性更顯著，但該基因重組蛋白無法催化底物GPP或法尼基焦磷酸（Farnesyl pyrophosphate，FPP）生成任何萜類物質[17]。研究顯示，只有通過外源添加底物GPP，過量表達的煙草葉片中才可通過SPME-GC-MS檢測到香葉醇的釋放。而無論是在重組蛋白活性檢測（催化GPP生成GP）還是轉基因植株分析中（促進香葉醇及其糖苷的積累）均具有生物學活性[15]。結合本研究結果，表明轉錄表達受季節(jié)、茶樹發(fā)育狀態(tài)影響較大，與萜類物質的釋放具有相似規(guī)律，但該基因生物學活性較弱，推測其在茶樹中不是主導香葉醇生物合成的萜類合成酶基因。和表達量在供試的7個茶樹品種中有明顯差異，其中在中茶108嫩梢中的表達量最高，在浙農117嫩梢中的表達量最低；在雪芽100茶樹嫩梢中的表達量最高。HS-SPME-GCMS結果顯示，中國變種茶樹與阿薩姆變種茶樹中的香葉醇積累有顯著性差異。與月份相關性分析不同的是，不同茶樹品種中和的表達量與香葉醇生物合成量相關性較弱，推測茶樹具有遺傳多樣性，不同茶樹品種遺傳基礎存在差異，且存在調控香葉醇生物合成的機制是多樣的，如蛋白水平在不同茶樹品種中是否存在差異？在后續(xù)研究中可進一步解析。此外，本研究表明，不同茶樹品種中的均具有催化底物GPP生成香葉醇的生物學功能。

圖5 不同茶樹品種CsNUDX1-cyto基因啟動子序列比對及結構分析

啟動子序列可通過與轉錄因子結合而控制基因轉錄與表達[22]。qRT-PCR定量分析顯示，品種間表達水平與香葉醇含量變化相關性較弱。啟動子活性分析顯示，除云抗10號品種中啟動子活性較弱外，其他品種間啟動子活性差異較小，導致不同茶樹品種中香葉醇積累差異的因素較多，如可能存在尚未發(fā)現的能夠合成香葉醇的萜類合成酶（Terpene synthase，TPS）以及轉錄因子調控的差異等。Zhou等[23]研究顯示，芳樟醇為茶樹中重要的單萜類物質，其生物合成前體為GPP，與香葉醇生物合成前體相同，具有相同底物的催化酶存在競爭關系。本研究中芳樟醇含量在兩類變種茶樹中的差異不明顯，而呋喃型芳樟醇氧化物在兩類變種茶樹中存在顯著性差異。Zeng等[24]研究表明，芳樟醇氧化物的積累與茶樹葉片面積呈顯著負相關，推測是由于阿薩姆變種茶樹葉片面積普遍較大，光照抑制了芳樟醇氧化物的合成。

綜上所述，和表達水平與香葉醇積累存在相關性；不同茶樹品種中香葉醇含量有顯著性差異；不同茶樹品種中的催化底物能力有差異，但均能促進香葉醇的生物合成。

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Catalytic Function, Promoter Structure and Functional Analysis ofin Different Tea Cultivars

YANG Jihong, ZHOU Hanchen*, XU Yujie

Tea Research Institute, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Huangshan 245000, China

Geraniol is an important monoterpenoid in tea plants, and its accumulation varies greatly among different tea cultivars. The recent study shows thatis responsible for the production of geraniol and its glycosides in tea plants. In order to explore the differences in the catalytic function and regulation ofin different tea cultivars, this study analyzed the differences in the accumulation of geraniol and expression patterns of, and analyzed the differences in the catalytic function, promoter structure and function ofin seven tea cultivars. The result shows thatexpression was positively correlated with geraniol content (=0.805). The content of geranyl in fresh leaves ofvar.(CSS) was significantly higher than that in.var.(CSA) cultivars.-mediated genetic transformation system shows thatof different tea cultivars could promote the biosynthesis of geraniol. Analysis of promoter activity shows thatpromoter had the weakest activity in ‘Yunkang 10’, and the structural analysis shows that the promoter ofin ‘Yunkang 10’ had an 185 base sequence insertion at the transcription start site –33, making the enhancing element CAAT-box located at –133 (CAAT-boxes in other cultivars were located at –47). The results of this study indicate thatin different tea cultivars could promote geraniol biosynthesis, but the genetic diversity of the promoter region results in differences in its expression level.

tea plant, geraniol,gene, function analysis, promoter analysis

S571.1；Q52

A

1000-369X(2023)05-621-10

2023-08-03

2023-09-07

國家自然科學基金（32002096）、安徽省農業(yè)科學院青年英才計劃項目（QNYC-202119）

楊霽虹，女，研究實習員，主要從事茶樹生物化學及分子生物學方面研究。*通信作者：tuesday1011@163.com