活血清熱解毒方通過JAK/STAT 信號傳導通路調(diào)控動脈粥樣硬化的分子機制探討*

Nguyen Xuan Huynh（阮春黃） 梁 碩 孟 毅 劉志勇△

（1.河南中醫(yī)藥大學，河南鄭州 450003；2.河南中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，河南鄭州 450002；3.河南省中醫(yī)院，河南鄭州 450002）

動脈粥樣硬化（AS）是一種血管慢性炎癥性疾病，以大動脈、中動脈內(nèi)膜下脂質(zhì)沉積、纖維組織增生、粥樣斑塊形成、血管壁硬化為主要特征［1］。AS 形成和發(fā)展過程中導致的管腔狹窄、斑塊破裂、血栓形成等是導致冠心病等心血管疾病發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)［2］。近年來，如何有效控制AS 發(fā)生、降低終點事件的發(fā)生率是臨床研究的焦點。以降脂藥為主體的治療方案仍舊是現(xiàn)階段AS 的主要治療方案，雖然有一定的效果，但是存在副作用明顯，且患者梗死后仍有復發(fā)的風險［3］。關(guān)于AS的發(fā)生機理目前尚無明確定論，近年來炎性學說逐漸成為研究的重點，免疫炎癥成為抗AS新的突破口。伴隨著中醫(yī)藥在臨床上的廣泛使用，其在心血管疾病中的良好的治療效果也逐漸獲得認可。中醫(yī)藥在調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)防治AS領(lǐng)域也取得重要進展，諸多研究均證實活血、清熱、益氣等中藥單體或復方在縮小AS 斑塊面積、減輕AS 程度方面療效卓著［4-5］。本院自擬活血清熱解毒方契合“因瘀化毒、因毒致變”的理論，在AS患者中取得良好的效果，但是關(guān)于其具體作用機制仍有待深入探索。酪氨酸蛋白激酶/信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子（JAK/STAT）信號通路是炎癥因子轉(zhuǎn)導的關(guān)鍵途徑，參與細胞生長、遷移、死亡，調(diào)控免疫反應(yīng)，在AS的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［6-7］。本次研究通過分析活血清熱解毒方對AS大鼠JAK/STAT 信號傳導通路調(diào)控作用。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級Wistar 大鼠48 只，雄性，8 周齡，體質(zhì)量180～220 g，購于賽業(yè)（固安）生物科技有限公司，許可證號SCXK（冀）2021-003。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后用于后續(xù)研究。分籠飼養(yǎng)，每籠5 只，12 h 光暗同步，室溫（24±2）℃，相對濕度（55±5）%。本次研究經(jīng)河南中醫(yī)藥大學動物倫理會審批通過，倫理批號：A202208407。

1.2 實驗藥物

活血清熱解毒方：太子參20 g，制首烏10 g，水蛭3 g，天麻6 g，膽南星3 g，全蝎3 g，決明子12 g，蜈蚣3 g，桃仁6 g，紅花6 g。由醫(yī)院中藥房提供，清水煎熬，藥液濃縮為含生藥1.20 g/mL。維生素D3注射液（上海通用藥業(yè)股份有限公司，國藥準字H31021404）；阿托伐他汀鈣（天方藥業(yè)有限公司，國藥準字H20093757）。

1.3 試劑與儀器

TC/TAG（上海羽朵生物科技有限公司，貨號：TC1239、TC1250）；HDL/LDL 試劑盒（長春匯力生物技術(shù)有限公司，K026a、K026b）；白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-10（IL-10）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、MCP-1 ELISA 試劑盒（Clin-MaxTM公司，貨號：IL6-H4218、ILB-H4110、IL0-H5219、TNA-H8211、CC2-H5255）；AK2、STAT3、SOCS3 一抗（Thermo Fisher 公司，貨號：MA516565、PA586075、PA587485）。RT 200C 全自動生化分析儀（美國Rayto 公司）；Elx800 全自動酶標儀（美國BioTeK公司）。

1.4 模型制備

48 只大鼠隨機分成空白對照組（n=8）和模型組（n=40），空白對照組給予普通飼料喂養(yǎng)，模型組通過高脂飲食飼養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射維生素D3（VD3）的方法建立AS 大鼠模型［8］，大鼠在高脂喂養(yǎng)的同時按照700 000 U/kg總劑量注射VD3溶液，分3 d注射。造模時間為3 周，過程中隨機監(jiān)測精神和飲食狀況，造模完成后隨機處死6 只大鼠，取主動脈組織進行病理檢測，以主動脈有動脈粥樣斑塊形成為造模成功。造模過程中有2只大鼠死亡，死亡原因為進食過少。

1.5 給藥方法

造模組剩余32 只大鼠隨機分為模型組、陽性對照組、中藥低劑量組、中藥高劑量組。除空白對照組正常飲食喂養(yǎng)外，其余各組均繼續(xù)給予高脂飲食。陽性對照組給予阿托伐他汀鈣2.6 mg/（kg·d）灌胃，中藥低劑量組給予活血清熱解毒方1.2 g/（kg·d）灌胃（相當于成人用藥量），中藥高劑量組給予活血清熱解毒方4.8 g/（kg·d）灌胃（相當于成人4 倍用藥量），空白對照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，灌胃體積按10 mL/kg小鼠體質(zhì)量計算，干預時間為12周。

1.6 標本采集與檢測

1.6.1 主動脈病理學檢測 末次給藥后腹腔注射戊巴比妥鈉處死，左心室注生理鹽水去除積血后，取下心臟和血管，液氮保存并移送至-80 ℃冰箱保存；4%多聚甲醛固定血管，分離主動脈和心臟，常規(guī)方法脫水、透明、浸蠟、包埋后制作病理切片。常規(guī)行HE 染色，光鏡下觀察主動脈病理情況。

1.6.2 血清生化指標檢測 腹主動脈采血，1 500 r/min離心分離10 min，采用全自動生化分析儀檢測總膽固醇（TC）、甘油三酯（TAG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL），ELISA 法檢測血清IL-6、IL-1β、IL-10、TNF-α、MCP-1。

1.6.3 Western blotting檢測酪氨酸蛋白激酶2（JAK2）、信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、細胞因子信號傳導抑制因子3（SOCS3）蛋白表達 主動脈組織標本，裂解、離心后取上清，BCA 試劑盒測定總蛋白濃度，經(jīng)上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、洗膜、一抗、二抗、顯影。使用ImageJ軟件對目的蛋白條帶和內(nèi)參蛋白進行半定量分析，以β-actin抗體為內(nèi)參計算蛋白相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用SPSS24.0 統(tǒng)計軟件。計量資料符合正態(tài)分布以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 病理學檢查結(jié)果

HE 染色結(jié)果顯示，空白對照組大鼠主動脈具有完整的血管彈力纖維層結(jié)構(gòu)，中膜平滑肌細胞規(guī)則排列，內(nèi)膜邊緣齊整，未見脂質(zhì)沉積；模型組大鼠主動脈內(nèi)膜出可見粥樣斑塊，部分可見破裂，中膜平滑肌細胞排列不規(guī)則，彈力纖維層斷裂，可見鈣化組織、纖維帽，斑塊內(nèi)有大量中央壞死物質(zhì)；陽性對照組、中藥低劑量組、中藥高劑量組相較于模型組病理改變得到有效改善，其中陽性對照組和中藥高劑量組改善更為顯著。見圖1。

圖1 各組大鼠主動脈病理觀察（HE染色，400倍）

2.2 各組大鼠血脂指標的比較

見表1。與空白對照組比較，模型組大鼠血清TC、TAG、LDL水平顯著提高，HDL水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組、中藥低劑量組、中藥高劑量組大鼠血清TC、TAG、LDL 水平顯著降低，HDL 水平顯著升高（P＜0.05）；與陽性對照組比較，中藥高劑量組大鼠血清TAG、LDL水平明顯降低，HDL水平顯著升高（P＜0.05）。

表1 各組大鼠血脂指標的比較（mmol/L，±s）

表1 各組大鼠血脂指標的比較（mmol/L，±s）

注：與空白對照組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，#P ＜0.05；與陽性對照組比較，△P ＜0.05。下同。

組 別空白對照組模型組陽性對照組中藥低劑量組中藥高劑量組n8 8 8 8 8 TC 9.85±0.23 15.68±2.35*10.38±1.89#13.75±2.16#11.35±2.05#TAG 0.61±0.08 1.82±0.21*1.26±0.18#1.13±0.15#0.94±0.13#△HDL 3.95±0.38 1.56±0.24*2.93±0.27#2.82±0.20#3.19±0.17#△LDL 3.40±0.41 5.83±0.56*4.49±0.51#4.28±0.45#3.85±0.36#△

2.3 各組大鼠血清炎癥因子水平的比較

見表2。與空白對照組比較，模型組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP-1 顯著升高，IL-10 顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組、中藥低劑量組、中藥高劑量組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP-1 水平顯著降低，IL-10水平顯著升高（P＜0.05）；與陽性對照組比較，中藥高劑量組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α顯著降低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血清炎癥因子水平比較（±s）

組別空白對照組模型組陽性對照組中藥低劑量組中藥高劑量組n8 8 8 8 8 IL-6（ng/L）0.78±0.09 4.56±0.35*2.29±0.23#2.17±0.34#1.97±0.19#△IL-1β（pg/mL）5.13±0.86 12.75±2.28*8.29±1.16#9.38±1.52#6.75±0.95#△IL-10（ng/mL）35.24±3.30 12.38±1.12*24.85±3.23#22.50±2.74#25.83±2.56#TNF-α（μg/L）15.63±1.85 45.52±4.35*32.30±4.10#34.35±3.56#28.35±3.58#△MCP-1（ng/mL）18.64±2.21 43.56±2.98*24.35±3.05#28.67±2.75#25.38±2.85#

2.4 各組大鼠JAK2/STAT3通路相關(guān)蛋白表達的比較

見表3、圖2。與空白對照組比較，模型組大鼠主動脈JAK2、STAT3、SOCS3蛋白相對表達水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組、中藥低劑量組、中藥高劑量組大鼠主動脈JAK2、STAT3、SOCS3蛋白相對表達水平顯著降低（P＜0.05）；與陽性對照組比較，中藥高劑量組大鼠主動脈JAK2、STAT3、SOCS3蛋白相對表達水平顯著降低（P＜0.05）。

表3 各組大鼠主動脈JAK2/STAT3通路相關(guān)蛋白表達比較（±s）

組 別空白對照組模型組陽性對照組中藥低劑量組中藥高劑量組n8 8 8 8 8 JAK2 0.32±0.05 0.74±0.13*0.62±0.14#0.58±0.15#0.50±0.08#△STAT3 0.35±0.08 0.86±0.17*0.65±0.15#0.64±0.18#0.57±0.10#△SOCS3 0.29±0.04 0.85±0.20*0.71±0.12#0.68±0.15#0.52±0.08#△

圖2 各組大鼠主動脈JAK2、STAT3、SOCS3蛋白條帶

3 討 論

AS 可歸于“胸痹心痛”“眩暈”“脈痹”等疾病范疇［9］。中醫(yī)學認為“瘀血”“痰濁”“熱毒”與AS 的發(fā)生密切相關(guān)，其發(fā)病機制大致可概括為情志、飲食、年老、先天不足、外邪侵襲導致的陰陽失衡、臟腑功能失調(diào)，而致痰、瘀、毒作用于脈道而發(fā)?。?0-11］。近年來，現(xiàn)代醫(yī)家對AS 和易損斑塊的中醫(yī)病機的探討愈發(fā)地深入，概括起來主要有脾虛與痰濁、瘀血說，肝腎虧虛、痰瘀阻絡(luò)說，痰濕瘀說，毒邪致病說等［12］。結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學，筆者認為“毒”“瘀”是AS 發(fā)生的重要病機，AS 發(fā)病過程中炎癥細胞浸潤、炎癥介質(zhì)水平提高等與中醫(yī)學“毒”“瘀”理論具有高度的相似性［13］。徐浩［14］提出“活血解毒-抑制炎癥反應(yīng)-穩(wěn)定斑塊”的假說，認為活血解毒在AS 易損斑塊干預中作用顯著。

本次研究從“毒”“瘀”理論出發(fā)，采用自擬活血清熱解毒方對AS 大鼠模型進行干預，結(jié)果顯示動脈粥樣硬化斑塊和血脂濃度明顯改善，證實活血清熱解毒方降低AS 大鼠模型血清脂質(zhì)水平，阻斷病理進程方面確有效果。方中太子參有益氣健脾、生津潤肺之功效；制首烏補肝腎、益精血；水蛭破血通經(jīng)、逐瘀消癥；天麻息風止痙、祛風通絡(luò)；膽南星清熱化痰、息風定驚；全蝎、蜈蚣息風鎮(zhèn)痙、通絡(luò)止痛、攻毒散結(jié)；決明子清肝明目、潤腸通便；桃仁、紅花活血通經(jīng)、散瘀止痛。全方共奏益氣活血、逐瘀消癥、清熱解毒之功，通過調(diào)節(jié)血脂代謝保護血管內(nèi)皮細胞，增加斑塊穩(wěn)定性。

AS 進程中諸多炎癥因子發(fā)揮重要作用，IL-1β 為靶點的單抗治療被證實能夠降低冠心病患者心血管事件的發(fā)生率［15］。IL-6 廣泛存在于機體各個部位，其形成受到白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-4（IL-4）等諸多因素的調(diào)控，其余相關(guān)受體結(jié)合介導細胞中的信號傳遞，激活AK2/STAT3 信號通路，加強血管平滑肌細胞的增殖能力，加速AS 的發(fā)展［16］。MCP-1 是由巨噬細胞與單核細胞分泌，又被稱為前炎性因子，能夠使多種炎性細胞向病變部位聚集，尤其是單核細胞的聚集效應(yīng)更為明顯，對各種炎癥因子的刺激做出應(yīng)答。MCP-1 還能活化白細胞并介導其產(chǎn)生其他炎癥因子，誘導AS 斑塊內(nèi)皮細胞移行，平滑肌細胞分裂，從而導致血栓斑塊形成。JAK/STAT 通路作為眾多細胞因子轉(zhuǎn)導的共同途徑，在細胞生理病理變化中參與廣泛，與AS 密切相關(guān)。STAT3 被激活后會通過基因的調(diào)節(jié)功能促進平滑肌細胞增殖［17］，導致AS的發(fā)生。SOCS3作為JAK2/STAT3信號通路的特異性阻斷因子之一，其高表達會抑制該通路的正常傳導功能，主要通過抗炎和調(diào)控細胞凋亡來抑制AS 的發(fā)生與發(fā)展［18］。李妹娟等［19］研究發(fā)現(xiàn)抑制JAK2/STAT3 信號通路后AS 大鼠病理改變得以改善。本次研究顯示，模型組JAK2、STAT3、SOCS3、IL-6、IL-1β、MCP-1、TNF-α 較空白對照組均明顯提高，證實上述因子在AS發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用。經(jīng)過活血清熱解毒方干預后，JAK2、STAT3、SOCS3、IL-6、IL-1β、MCP-1、TNF-α 均明顯降低，IL-10 提示活血清熱解毒方在抑制AK2/STAT3 信號通路，調(diào)控炎癥反應(yīng)方面具有良好的效果。清熱解毒中藥大多具有抗炎作用，從而能發(fā)揮穩(wěn)定易損斑塊，防止其破裂的作用。

本次研究結(jié)果顯示，血清熱解毒方能夠降低AS大鼠模型血脂和炎癥因子水平，抑制主動脈斑塊的形成，發(fā)揮抗粥樣硬化的作用，其機制可能與抑制JAK2/STAT3信號通路和SOCS3蛋白表達有關(guān)。本次研究不足之處在于僅對雄性大鼠展開研究，未考慮性別對實驗結(jié)果可能產(chǎn)生的影響，同時血清和蛋白表達檢測的樣本量偏小，且僅對頸主動脈展開研究，在今后的研究中需要進一步完善。