中華蜜蜂腸粘蛋白AcMucin5AC-1的鑒定和定位分析

李小青, 郭 悅, 張 潔, 周澤揚, 黨曉群

(重慶師范大學, 農業(yè)農村部長江上游傳粉昆蟲資源保護與利用重點實驗室(部省共建),重慶市媒介昆蟲重點實驗室, 重慶 401331)

蜜蜂是自然界重要的授粉昆蟲之一,在維持生態(tài)系統(tǒng)平衡和作物授粉方面具有重要的經濟價值和社會效應(吳杰等, 2014)。昆蟲粘蛋白不僅構成了腸道粘液層也是圍食膜的重要組成成分。昆蟲粘蛋白按照其分泌方式及分布部位的不同,可分為與圍食膜相關的分泌型粘蛋白以及與微絨毛膜相關的膜結合粘蛋白(Diasetal., 2018)。盡管不同物種粘蛋白分子量和蛋白質序列差異很大,但典型結構均為包含半胱氨酸的2型幾丁質結合結構域(cysteine-containing type-2 chitin binding domain, ChtBD2)和粘蛋白結構域(mucin domain, MD),MD中富含脯氨酸(Pro)和含有糖基化位點的絲氨酸(Ser)和蘇氨酸(Thr)的組成的聯重復序列,MD高度糖基化使圍食膜獲得很強的潤滑性以及對水解酶的穩(wěn)定性(Kramerovetal., 1996)。目前在昆蟲中發(fā)現了大量粘蛋白和粘蛋白樣蛋白,家蠶Bombyxmori(夏丹丹等, 2015)、黑腹果蠅Drosophilamelanogaster(Syedetal., 2008)和白紋伊蚊Aedesalbopictus(Dengetal., 2020)等昆蟲的粘蛋白主要分布在唾液腺、中腸、馬氏管和圍食膜,在參與調節(jié)宿主的生長發(fā)育和病原防控中發(fā)揮著重要的生理作用。果蠅粘蛋白基因Muc68E參與了代謝調節(jié),影響食物吸收效率以及成年果蠅的體型,并對饑餓和寒冷有一定耐受性,推測這可能是粘蛋白的一種新的功能(Reisetal., 2016)。飛蝗Locustamigratoria粘蛋白基因Lmhemomucin和Lmmucin-12被RNAi后,發(fā)現飛蝗在若蟲向成蟲轉變的蛻皮過程中35%～55%的若蟲不能蛻皮并在蛻皮前死亡,表明其對蝗蟲生存至關重要。干擾飛蝗粘蛋白LmIIM3后,在飛蝗胃、盲腸和中腸均表現出形態(tài)缺陷以及圍食膜厚度比對照組更薄,表明LmIIM3參與形成圍食膜(Zhaoetal., 2020)。

目前,有關粘蛋白在其他昆蟲的發(fā)育、結構和功能方面的研究已有大量積累。然而,對于蜜蜂中有關于粘蛋白的研究鮮有報道。Huang等(2019)研究東方蜜蜂微孢子蟲Nosemacerance時發(fā)現,飼喂靶向東方蜜蜂微孢子蟲基因編碼的Dicer(siRNA-Dicer組)的小干擾RNA阻斷東方蜜蜂微孢子蟲的RNA干擾機制,可使東方蜜蜂微孢子蟲的量顯著下調,而東方蜜蜂粘蛋白-2(Mucin-2)與未加Dicer小干擾RNA相比呈顯著上調,表明東方蜜蜂微孢子蟲量的減少可能是因為東方蜜蜂增強了自身圍食膜粘液屏障。本課題組前期研究發(fā)現,中華蜜蜂囊狀幼蟲病毒(Chinese sacbrood virus, CSBV)感染中華蜜蜂Apisceranacerana后,AcMucin5AC-1被下調。因此,本研究通過免疫定位和RNAi等技術對中華蜜蜂AcMucin5AC-1的生物學功能進行探究,為進一步深入解析AcMucin5AC-1蛋白在蜜蜂的生長發(fā)育中的重要功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲與病毒

健康中華蜜蜂幼蟲購自重慶市璧山區(qū)個體戶蜂農養(yǎng)殖場;CSBV病毒粒子由重慶師范大學資源昆蟲及其病原微生物學實驗室提供。

1.2 主要試劑及儀器

實驗所用的Premix Taq、pMD19-T Vector、Solution Ⅰ連接酶、限制性內切酶XhoⅠ和EcoRⅠ購于TaKaRa公司:EvoScript Universal cDNA Master反轉錄試劑盒、FastStart Essential DNA Green Master熒光定量PCR試劑盒購于Roche公司:擴增目的基因的引物、大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細胞、表達菌株Rosetta (DE3)感受態(tài)細胞、D-果糖、D-葡萄糖和酵母提取物(yeast extract)、瓊脂粉(agar)、氯化鈉(NaCl)、卡那抗生素(Kana)、十二烷基磺酸鈉(SDS)等購于生工生物工程股份有限公司;RIPA裂解液、抗熒光淬滅劑等購于碧云天生物技術有限公司;氯仿、冰醋酸、甲醇和二甲苯等常用試劑購于重慶化學試劑有限公司。

熒光定量 PCR 儀(美國 Bio-Rad 公司)、智能人工氣候箱(上海谷寧儀器有限公司)、高速冷凍離心機(Eppendorf)、蛋白質免疫印跡成像系統(tǒng)(上海培清科技有限公司)、體式解剖顯微鏡(萊卡顯微系統(tǒng)(上海)有限公司)等。

1.3 Mucin5AC生物信息學分析

Mucin5AC基因序列和蛋白質序列下載于NCBI(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/),中華蜜蜂AcMucin5AC的GenBank登錄號分別為XM_028522949.1, XM_016907334.1, XM_016917484.1, XM_016908527.1, XM_016907334.1, XM_016913703.1, XM_016912343.1, XM_016911427.1和XM_016911428.1;西方蜜蜂A.melliferaMucin5AC的GenBank登錄號分別為XM_006562291.2, XM_016770836.2, XM_ 026297546.1, XM_026302220.1, XM_026296595.1, XM_006569552.2, XM_006570794.1和XM_ 026295456.1。通過NetPhos 3.1(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)和NetNGlyc 1.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)、NetOGlyc 4.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)預測磷酸化和糖基化位點;通過TMHMM v2.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)、SignalP(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和SMART(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)對跨膜結構域、信號肽以及結構域進行預測;通過MotifScan(https:∥www.genome.jp/tools/motif/)和WegoLoc(http:∥www.btool.org/WegoLoc)功能基序分析和亞細胞定位等在線分析軟件分別對中華蜜蜂和西方蜜蜂Mucin5AC的蛋白質序列特征進行比較分析。

1.4 AcMucin5AC-1表達量分析

首先,使用無菌移蟲針從中華蜜蜂巢脾的巢穴中取2日齡幼蟲放至24孔板中,蓋好蓋子后放入人工氣候培養(yǎng)箱中(溫度為35 ℃,濕度為85%);培養(yǎng)24 h后,觀察幼蟲的存活情況;挑選出死亡及沒有活力幼蟲,其余2日齡幼蟲一部分用于收集4日齡時的中腸和表皮,每種組織來自3頭個體作為1個生物學重復;另一部分用于CSBV接種,分為兩組,一組為飼喂不含CSBV食物的對照組,另一組飼喂含CSBV食物(107copies/頭),隨后兩組均添加正常食物培養(yǎng);在添食CSBV病毒后的0, 12, 24, 48和72 h時各取6頭中華蜜蜂幼蟲的中腸,經滅菌ddH2O、75%乙醇和DEPC水清洗后,凍存于-80 ℃?zhèn)溆?。其?采用Trizol 法提取總RNA,參照EvoScript Univerrsal cDNA Master試劑盒說明合成cDNA。最后,以中華蜜蜂AcActif基因為內參基因,并通過qRT-PCR檢測AcMucin5AC-1在4日齡幼蟲中腸和表皮中以及2日齡幼蟲接種CSBV后中腸中的表達量,用CSBV的結構蛋白VP1基因的相對表達量檢測幼蟲體內CSBV的情況,引物序列見表1。使用CFX96TMTouch實時定量PCR系統(tǒng)進行qRT-PCR,反應體系: ddH2O 7 μL, Green Master 2×conc. 10 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各1 μL, cDNA 1 μL。反應程序: 95 ℃預變性10 min; 95 ℃變性10 s, 56/50 ℃退火10 s, 72 ℃延伸20 s, 熔解曲線65～95 ℃, 增幅0.5 ℃ 5 s, 39個循環(huán)。每個樣品進行3次技術重復以及3次生物學重復。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.5 AcMucin5AC-1的原核表達和多克隆抗體制備

根據GenBank中AcMucin5AC-1(GenBank登錄號: XM_028667148.1)序列設計特異性引物(表1),以1.4節(jié)合成的中華蜜蜂cDNA為模板進行體外擴增。PCR反應體系: cDNA 1 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各0.25 μL, Ex Taq Master Mix 5 μL,ddH2O 6 μL。PCR反應程序: 95 ℃預變性 5 min; 95 ℃變性40 s, 61.8 ℃退火40 s, 72 ℃延伸1 min, 32個循環(huán);72 ℃終延伸1 min, 12 ℃保存。通過1%瓊瓊脂糖凝膠電泳分離并回收目的片段,與pMD19-T載體連接后,將其轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中,經篩選陽性克隆并提取質粒,重組質粒經EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定后,送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行核苷酸測序。測序后的陽性的重組質粒pMD19-AcMucin5AC-1亞克隆至pET-28a載體,構建pET28a-AcMucin5AC-1轉入大腸桿菌RosettaTM(DE3)感受態(tài)細胞中培養(yǎng)。挑取陽性單克隆菌進行IPTG誘導表達。利用親和層析柱純化重組蛋白,操作步驟根據Ni-NAT Superflow Cartridge蛋白純化柱的說明書進行,將純化的AcMucin5AC-1重組蛋白作為抗原免疫云南昆明雌性小鼠,制備多克隆抗體。

1.6 AcMucin5AC-1在中華蜜蜂幼蟲中的表達及定位分析

采用RIPA裂解法提取中華蜜蜂3-6日齡幼蟲中以及4日齡幼蟲中腸、表皮和圍食膜的總蛋白,利用1.5節(jié)制備的多克隆抗體anti-AcMucin5AC-1-M作為一抗,HRP標記的羊抗鼠為二抗進行免疫印跡檢測,分析AcMucin5AC-1在上述不同發(fā)育階段和4日齡幼蟲組織中的表達。取新鮮中華蜜蜂4日齡幼蟲, 4 ℃避光固定于Gluta固定液中,通過包埋劑OTC(optimal cutting temperature compound)包埋幼蟲后,再將包埋的樣品切成厚度5 μm的橫切片,用粘附型破片撈出切片后置于4 ℃保存?zhèn)溆?。通過間接免疫熒光技術,將多克隆抗血清anti-AcMucin5AC-1-M為一抗,Alexa Fluor 488(488-N-羥基琥珀酰亞胺酯)亮綠色熒光染料標記的羊抗鼠為二抗,DAPI(4′,6-二脒基-2苯基吲哚)藍色熒光的DNA染料,進行觀察分析AcMucin5AC-1在4日齡幼蟲中的定位。

1.7 AcMucin5AC-1的RNAi和效果檢測

以pMD19-T-EGFP質粒和pMD19-T-AcMucin5AC-1質粒分別作為EGFP和AcMucin5AC-1的dsRNA體外擴增的模板,使用含有T7啟動子的特異性引物(表1),利用Promega公司的T7 RiboMAXTMExpress RNAi System合成dsRNAs。參考1.4節(jié)幼蟲培養(yǎng)方法收集2日齡幼蟲設置兩個干涉組,一組添加dsEGFP作為對照組,另一組添加dsAcMucin5AC-1作為實驗組,dsRNA用量為2.0, 1.0和0.5 μg/頭,飼喂12, 24, 48和72 h時每處理各取6頭活幼蟲,提取中腸RNA并合成cDNA,將cDNA定量到100 ng/μL進行qRT-PCR,方法同1.4節(jié),每處理生物學重復3次。取最佳干擾條件下的整頭幼蟲制備石蠟切片,通過HE染色后觀察RNAi干擾AcMucin5AC-1后24, 48和72 h時幼蟲形態(tài)。

1.8 數據分析

利用Bio-Rad CFX Manager軟件內置程序2-ΔΔCt方法進行計算(Livak and Schmittgen, 2001) RT-qPCR檢測的基因表達量,利用GraphPad Prism進行數據統(tǒng)計分析和作圖,使用t檢驗進行干擾效率和差異顯著性分析。

2 結果

2.1 中華蜜蜂和西方蜜蜂的Mucin5AC基因序列

結合在其他物種中已經報道Mucin特征,對中華蜜蜂和西方蜜蜂的基因組進行檢索和比對,發(fā)現中華蜜蜂基因組和西方蜜蜂基因組中都有8個Mucin5AC基因。通過生物信息學分析對中華蜜蜂和西方蜜蜂Mucin5AC粘蛋白結構域內的PTS/TS殘基比例和串聯重復序列百分比、O-糖基化百分比、信號肽、結構域進行了比較分析。結果表明,中華蜜蜂Mucin5AC氨基酸序列中絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)和脯氨酸(P)占Mucin5AC全長的21%～50%,而西方蜜蜂的為27%～40%。中華蜜蜂中有6個Mucin5AC(Ac016908527.1, Ac016907334.1, Ac016913703.1, Ac016912343.1, Ac016911427.1和Ac016911428.1),氨基酸序列中S+T/P+T+S含量占整個蛋白的20%以上,為粘蛋白Mucin5AC,另外3個Mucin5AC(Ac028522949.1, Ac016907334.1和Ac016917484.1)氨基酸序列中S+T/P+T+S重復區(qū)含量低于20%,為類粘蛋白(Mucin5AC-like)。西方蜜蜂中的8個Mucin5AC蛋白,S+T含量均大于20%,即為粘蛋白。中華蜜蜂Mucin5AC的O-糖基化(O-Glyc)占13%～39%,西方蜜蜂的占14%～19%。中華蜜蜂Mucin5AC包含的半胱氨酸數目在10～51個之間,西方蜜蜂的在4～27個之間。中華蜜蜂Mucin5AC特有的重復序列中T含量較多,西方蜜蜂中S含量較多,暗示中華蜜蜂Mucin5AC的糖基化(O-Glyc)位點多發(fā)生在S,而西方蜜蜂的多發(fā)生在T。

利用SMART預測保守結構域,發(fā)現中華蜜蜂中Ac028522949.1, Ac016907334.1和Ac16912343.1具有信號肽,表明這些是分泌性粘蛋白。Ac028522949.1, Ac016907334.1和Ac016907334.1具有2型的幾丁質結合結構域ChtBD2和PTS重復序列,這些ChtBD2內均含有保守6個半胱氨酸,屬于圍食膜因子(Peritrophin-A),預示這幾個蛋白可能定位于昆蟲腸道圍食膜。Ac016913703.1, Ac016911427.1和Ac016911428.1含有類胰蛋白酶絲氨酸蛋白酶(trypsin-like serine protease)活性位點Tryp_SPc結構域。Ac016907334.1含有糖苷水解酶18(O-glycosyl hydrolases18)家族的Glyo18結構域。與中華蜜蜂Mucin5AC相比,西方蜜蜂Mucin5AC氨基酸序列中均不含有ChtBD2和Glyo18結構域; Am006562291.2和Am016770836.2中含有錨蛋白重復基序(ankyrin repeat, ANK),Am026297546.1和Am006569552.2含有“溴”蛋白結構域(bromo domains, BROMO),可結合乙酰化賴氨酸殘基存并在相互作用; Am026302220.1具有4個CysCysHisHisCys(CCHHC)形成的環(huán)型鋅指結構域(zinc finger domains, Znf); Am026295456.1中含有1個“螺旋-環(huán)-螺旋”結構域(helix loop helix domain, HLH domain)(圖1)。

2.2 CSBV病毒侵染后中華蜜蜂幼蟲中AcMucin5AC-1的表達量

AcMucin5AC-1 在4日齡幼蟲的中腸和表皮均有表達,但在中腸中的表達量比在表皮中的表達量顯著高72%(P<0.05),表明AcMucin5AC-1在中腸組織大量表達(圖2: A)。CSBV病毒侵染后與未感染CSBV病毒的對照組比較,VP1基因在感染CSBV病毒的幼蟲中持續(xù)上調,在感染的48 h時幼蟲中達到最高相對表達量,說明CSBV病毒已侵染中華蜜蜂幼蟲,并在體內持續(xù)增殖(圖2: B);AcMucin5AC-1在感染CSBV病毒的幼蟲中腸中表達呈現整體下調,且在感染12和72 h時的幼蟲中表達量顯著降低(P<0.05)(圖2: C),表明CSBV病毒的侵染對AcMucin5AC-1在中腸組織的表達量產生了影響。

圖2 中華蜜蜂4日齡幼蟲中腸和表皮中AcMucin5AC-1的表達量(A)以及CSBV侵染2日齡幼蟲不同時間中腸中VP1(B)和AcMucin5AC-1的表達量(C)Fig. 2 Expression levels of AcMucin5AC-1 (A) in the midgut and cuticle of the 4-day-old larva of Apis cerana cerana,and of VP1 (B) and AcMucin5AC-1 (C) in the midgut of the CSBV-infected 2-day-old larva for different timeCK: 未感染CSBV的對照組 Control group without CSBV infection; CSBV: 中華蜜蜂囊狀幼蟲病毒Chinese sacbrood virus; VP1: CSBV的基因A gene of CSBV; CSBV: 感染CSBV組(107 copies/頭) CSBV-infected group (107 copies/ind.). 圖中據為平均值±標準誤;柱上星號表示兩組間差異顯著(*P<0.05; ** P<0.01)(t檢驗)。Data in the figure are mean±SE. Asterisk above bars indicates significant difference between the two groups (*P<0.05; ** P<0.01)(t-test).

2.3 AcMucin5AC-1的原核表達及多克隆抗體

SDS-PAGE 電泳檢測發(fā)現,重組蛋白主要以包涵體的形式表達(圖3: A)。隨后對重組蛋白 AcMucin5AC-1進行大量誘導表達并純化(圖3: B)將純化后的重組蛋白作為抗原免疫昆明雌性小鼠以制備相應的多克隆抗體。免疫印跡分析發(fā)現,在50 kD左右處檢測到單一的雜交信號條帶(圖3: C),說明重組蛋白AcMucin5AC-1的多克隆抗體制備成功。

圖3 重組蛋白AcMucin5AC-1的表達(A)和純化(B)的SDS-PAGE及多克隆抗體的Western blot檢測(C)Fig. 3 SDS-PAGE of expression (A) and purification (B) of the recombinant AcMucin5AC-1 and Western blotting of polyclonal antibody (C)M: 蛋白分子量標準Protein molecular weight marker; 1: 未經IPTG誘導的pET28a pET28a uninduced by IPTG; 2: 經IPTG誘導的pET28a pET28a induced by IPTG; 3: pET28a-AcMucin5AC-1未經IPTG誘導pET28a-AcMucin5AC-1 uninduced by IPTG; 4: pET28a-AcMucin5AC-1經IPTG誘導pET28a-AcMucin5AC-1 induced by IPTG; 5: pET28a-AcMucin5AC-1誘導表達產物上清 Induced product supernatant of pET28a-AcMucin5AC-1; 6: pET28a-AcMucin5AC-1誘導表達產物沉淀Induced product precipitation of pET28a-AcMucin5AC-1; 7: 純化的重組蛋白AcMucin5AC-1 Purified recombinant AcMucin5AC-1; 8: 重組蛋白AcMucin5AC-1與多克隆抗體雜交Recombinant AcMucin5AC-1 hybridized with polyclonal antibody; 9: 重組蛋白 AcMucin5AC-1與陰性血清雜交 Recombinant AcMucin5AC-1 hybridized with negative serum.

2.4 AcMucin5AC-1蛋白的表達和定位

在中華蜜蜂3-6日齡幼蟲總蛋白均能在80 kD之間雜交到信號條帶(圖4: A),與實際預測分子量(252.18 kD)不一致,推測可能的原因是AcMucin5AC-1分子量較大,在抽提蛋白時可能會引起蛋白降解,所以雜交到80 kD的降解條帶。同時,AcMucin5AC-1的抗體在4日齡幼蟲各組織總蛋白中也能雜交到相同大小的單一條帶(圖4: B),表明其在中華蜜蜂幼蟲的中腸、表皮和圍食膜均有表達。

利用間接免疫熒光技術通過熒光顯微鏡進行觀察,藍色熒光表示細胞核,綠色熒光表示AcMucin5AC-1蛋白分布情況,在4日齡幼蟲中,AcMucin5AC-1分布在中腸、圍食膜、腸腔基底膜周圍(basement membrane, BM)和微絨毛(microvilli, Mi)(圖5)。因此,推測AcMucin5AC-1可能是參與圍食膜形成。

圖5 間接免疫熒光檢測AcMucin5AC-1在中華蜜蜂幼4日齡蟲中的定位Fig. 5 Indirect immunofluorescence detection of the localization of AcMucin5AC-1 in the 4-day-old larva of Apis cerana ceranaNegative: 陰性血清(對照組)Negative serum (control group); UV: 紫外線Ultraviolet ray; DAPI: DAPI標記的細胞核 DAPI-labeled nuclei; Alexa Fluor 488: Alexa Fluor 488標記的AcMucin5AC-1 Alexa Fluor 488-labeled AcMucin5AC-1; Merge: DAPI和Alexa Fluor 488的疊加 Superposition of DAPI and Alexa Fluor 488; PM: 圍食膜Peritrophic membrane; Mi: 微絨毛Microvilli; BM: 腸腔基底膜Basement membrane of the intestinal lumen; MG: 中腸Midgut.

2.5 AcMucin5AC-1的RNAi

qRT-PCR檢測結果表明,2.0 μg/頭dsRNA處理中華蜜蜂2日齡幼蟲后24 h時AcMucin5AC-1在中腸中的表達量比對照組(dsEGFP)顯著下調92% (P<0.01)(圖6)。

圖6 中華蜜蜂2日齡幼蟲飼喂dsAcMucin5AC-1后AcMucin5AC-1在中腸中的表達量Fig.6 Expression levels of AcMucin5AC-1 in the midgut after feeding the 2-day-old larva of Apis cerana larvae with dsAcMucin5AC-1圖中數據為平均值±標準誤;柱上星號表示兩組間差異顯著(*P<0.05; ** P<0.01)(t檢驗)。Data in the figure are mean±SE. The asterisk above bars indicates significant difference between the two groups (*P<0.05; ** P<0.01)(t-test).

RNAi處理24, 48和72 h時各組織結構形態(tài)較為完整,圍食膜、柱狀細胞(columnar cell, CC)的微絨毛、柱狀細胞、脂肪體的滋養(yǎng)細胞(trophocyte, Tr)和絳色細胞(oenocyte, Oe)均清晰可見。AcMucin5AC-1被RNAi后24 h時(圖7: D)和48 h時(圖7: J)的幼蟲組織與對照組相比沒有明顯差異,均呈現出細胞核小而圓,細胞之間的間隙較小;但RNAi后72 h時的幼蟲 (圖7: P)細胞間隙增大,細胞和細胞核的形狀變得細胞間界限不清晰,細胞排列散亂。

3 討論與結論

昆蟲在漫長的進化過程中,已經形成了獨特的腸道防御機制,包括物理防御和免疫反應(Zengetal., 2022)。圍食物膜是昆蟲腸道物理防御系統(tǒng)的重要結構,主要由幾丁質和蛋白質組成(Hegedusetal., 2009; Kuraishietal., 2011)。而糖基化蛋白組成的黏液是另一個關鍵的物理結構(Miguel-Aliagaetal., 2018)。因此,解析昆蟲粘蛋白特征對病原入侵宿主的機制研究具有十分重要的意義。

粘蛋白是一個大型、復雜的糖基化蛋白家族,其重要的特征是“粘蛋白結構域”。本研究中發(fā)現,雖然中西方蜜蜂Mucin5AC蛋白均含有粘蛋白樣結構域(MD),但中華蜜蜂Mucin5AC粘蛋白結構域中ST/PTS串聯重復序列、O-糖基化位點和半胱氨酸數目都高于西方蜜蜂。其中,中華蜜蜂AcMucin5AC-1(028522949.1)含有ChtBD2和MD。根據含有CBD結構域的典型特征,將圍食膜因子分為peritrophin-A, peritrophin-B和peritrophin-C 3類(Tellametal., 1999),中華蜜蜂AcMucin5AC-1的ChtBD2結構域中含有6個半胱氨酸,其保守基序為X2-5CX10-11CX5-6CX12-15CX12-13CX8-10CX8-9,推測該蛋白屬于圍食膜peritrophin-A,表明AcMucin5AC-1可能參與圍食膜形成,ChtBD2結構域中保守的半胱氨酸殘基形成蛋白內部的二硫鍵結構,以提高蛋白質在富含消化水解酶的中腸環(huán)境中能夠保持穩(wěn)定性(Kuraishietal., 2011)。MD結構域中串聯重復序列的糖基化位點可能充當了病原物的吸附位點從而阻止病原物同上皮細胞結合(李新娜, 2012),暗示粘蛋白可能是昆蟲病原防控的潛在靶標。同時,對中華蜜蜂和西方蜜蜂Mucin5AC結構域比較分析發(fā)現,中華蜜蜂Mucin5AC含特異ChtBD2結構域、Glyo18結構域和Tryp_SPc結構域(圖1)。西方蜜蜂Mucin5AC有特異的BROMO結構域、ANK結構域、HLH 結構域、Znf-結構域。中華蜜蜂和西方蜜蜂Mucin5AC結構域的差異暗示該蛋白家族在中華蜜蜂和西方蜜蜂中的功能發(fā)生了分化,為今后研究Mucin5AC在中華蜜蜂和西方蜜蜂中的生物學功能奠定了基礎。

本研究獲得了AcMucin5AC-1的外源重組蛋白,主要以包涵體形式表達(圖3: A)。Western blot顯示該蛋白分子量的實際大小為50 kD(圖3: C),比預測的分子量(35 kD)偏大,經過核酸測序比對沒有發(fā)現突變現象;推測可能因為AcMucin5AC-1蛋白的ChtBD2結構域富含半胱氨酸,導致重組蛋白AcMucin5AC-1形成分子間或分子內二硫鍵,導致免疫印跡結果中的蛋白分子量偏大。利用獲得的多克隆抗體anti-AcMucin5AC-1對中華蜜蜂3-6日齡幼蟲(圖4: A)和4日齡不同組織AcMucin5AC-1的蛋白水平進行檢測,在中腸、表皮和圍食膜都檢測到信號條帶(圖4: B)。間接免疫熒光實驗表明AcMucin5AC-1蛋白主要分布在中腸和圍食膜(圖5)。Hegedus等(2009)根據昆蟲圍食膜的合成部位差異,將圍食膜分為由中腸上皮細胞分泌到腸腔形成的I型圍食膜和由前腸和中腸交界處賁門細胞分泌的II型圍食膜,推測AcMucin5AC-1可能是由中腸合成之后分泌至腸腔參與圍食膜的構成,這與同為膜翅目的無刺蜜蜂所報道的結果(Marques-Silvaetal., 2005; das Dores Teixeiraetal., 2015)一致。

本研究確定了dsAcMucin5AC-1在幼蟲組織的干擾條件,即dsRNA的量為2.0 μg/頭,干擾時間為24 h時能最大程度沉默AcMucin5AC-1(圖6)。通過HE染色觀察干擾AcMucin5AC-1后的72 h時的中華蜜蜂幼蟲切片(圖7),發(fā)現細胞間隙增大,細胞和細胞核的形狀變得不規(guī)則,推測沉默了AcMucin5AC-1可能會影響細胞間的松散程度。對照組dsEGFP干擾的48 h時能觀察到由微絨毛分泌蛋白以形成圍食膜,而dsAcMucin5AC-1處理48 h時則沒有觀察到,AcMucin5AC-1的沉默減少了AcMucin5AC-1的蛋白合成,由于AcMucin5AC-1蛋白的減少使得圍食膜的形成受阻。因此,后續(xù)的研究將重點關注AcMucin5AC-1在圍食膜形成中的作用,為解析圍食膜在CSBV病毒感染過程中的作用奠定基礎。