星豹蛛兩個GST基因克隆、鑒定及其對溴氰菊酯脅迫的響應(yīng)表達(dá)

焦麗亞琳, 趙萌萌, 王 美, 牛 越, 王 西, 李 銳

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 太谷 030801)

蜘蛛是自然界陸地生態(tài)系統(tǒng)中最豐富的捕食性天敵,在害蟲防控方面起到非常重要的作用(Lafageetal., 2020)。星豹蛛Pardosaastrigera隸屬于蛛形綱(Arachnida)蜘蛛目(Araneae)狼蛛科(Lycosidae)豹蛛屬Pardosa,是一種游獵型蜘蛛,是我國長江流域和黃河流域棉區(qū)的優(yōu)勢種蜘蛛之一。具有習(xí)性兇猛、捕食量大、壽命長等的特點,可以捕食蚜蟲,黏蟲Leucaniaseparata、棉鈴蟲Helicoverpaarmigera、玉米螟等的幼蟲,在農(nóng)田害蟲防治中具有不可忽視的作用(李敏等, 2020)。近年來,隨著殺蟲劑使用種類的增加以及高劑量使用,不僅使害蟲對殺蟲劑的耐受性大大增強(qiáng)而產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗性,而且對害蟲天敵的生存造成了嚴(yán)重的威脅。星豹蛛又作為捕食優(yōu)勢種之一,其種群數(shù)量的多少直接影響到田間害蟲的發(fā)生程度(李生才等, 2006)。因此,在農(nóng)田生產(chǎn)中害蟲天敵應(yīng)著重得到保護(hù)和利用,研究星豹蛛對化學(xué)殺蟲劑的解毒代謝,為害蟲天敵的保護(hù)提供理論依據(jù),也為天敵星豹蛛的綠色防控策略提供參考,降低該物種在殺蟲劑影響下的生存危機(jī)。

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathioneS-transferases, GSTs)是一種由多基因編碼的多功能超家族解毒酶系,分布于動物、植物、細(xì)菌、真菌等幾乎全部好氧生物體內(nèi),屬于重要的Ⅱ相解毒酶(Sheehanetal., 2001; 劉婷, 2012)。Booth等(1961)在小鼠的肝臟中首次發(fā)現(xiàn)了GSTs,對昆蟲GSTs的研究主要集中于GSTs對殺蟲劑的解毒代謝能力(Enayatietal., 2005)。目前已知的GSTs參與殺蟲劑抗性的機(jī)制主要有以下3種:第1種是GSTs催化谷胱甘肽(glutathione, GSH)與殺蟲劑發(fā)生軛合反應(yīng),生成毒性較低的軛合物排出體外;第2種是通過消除反應(yīng);第3種是GSTs具有GSH過氧化物酶活性,可保護(hù)細(xì)胞免受殺蟲劑誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷(張邦賢, 2017)。此外,GSTs還參與生物體內(nèi)激素合成和代謝、信號傳導(dǎo)和胞間物質(zhì)運輸、抗氧化應(yīng)答以及嗅覺行為等多種代謝過程(Xuetal., 2016; Durandetal., 2018)。目前,昆蟲GSTs功能的研究在東亞飛蝗Locustamigratoriamanilensis、家蠶Bombyxmori、蘋果蠹蛾Cydiapomonella較為深入(胡曉明, 2012; Zhangetal., 2014; 王煒, 2019)。蛛形綱中,在擬環(huán)紋豹蛛Pardosapseudoannulata、暗豹蛛Pardosalugubris、二斑葉螨Tetranychusurtica等物種中關(guān)于GSTs的研究已有報道(Wilczeketal., 2004; 王娟娟等, 2013; Liuetal., 2019)。有關(guān)星豹蛛GST基因的研究還未見報道。本研究在課題組已獲得的星豹蛛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上(李薩麗, 2017),利用RT-PCR克隆得到星豹蛛2個GST基因的cDNA序列,生物信息學(xué)分析,并分析其時空表達(dá)模式以及在溴氰菊酯脅迫下的表達(dá)情況,初步推測基因的功能,為過表達(dá)基因功能的驗證提供數(shù)據(jù)支撐,為后續(xù)深入研究GST基因的解毒代謝分子機(jī)理提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試星豹蛛

供試星豹蛛采自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)太谷校區(qū)農(nóng)作站試驗田,采集亞成蛛帶回實驗室在人工氣候箱中飼養(yǎng)[溫度(29±1) ℃,相對濕度75%,光周期16L∶8D],每頭放入一個指形管中單獨飼養(yǎng),管內(nèi)放入適當(dāng)大小濕棉球保濕,以黑腹果蠅Drosophilamelanogaster和黃粉蟲Tenebriomolitor作為主要食物,每隔1 d飼喂1次,1周更換1次指形管。

1.2 主要試劑和儀器

試劑:UNIQ-10柱式總 RNA 抽提試劑盒、零背景TOPO-Blunt平末端克隆試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司;HiScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix購自南京諾維贊生物科技股份有限公司;TransStart?FastPfu DNA Polymerase購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司;25 g/L溴氰菊酯(deltamethrin)乳油生產(chǎn)自拜耳作物科學(xué)(中國)有限公司。

儀器:MGC-300H人工氣候箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);T100TMThermal Cycler PCR儀(Bio-Rad);PowerPAac HC 164-5052瓊脂糖凝膠電泳儀(Bio-Rad);AT126SL凝膠成像儀(Alpha Innotech);Mx3000PTM熒光定量PCR儀(Stratagene)。

1.3 星豹蛛GST基因的克隆

取星豹蛛雌雄成蛛各1頭,在液氮低溫環(huán)境下充分研磨至粉末狀,利用UNIQ-10 柱式總 RNA 抽提試劑盒提取總RNA,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白儀檢測總RNA濃度、純度和完整性合格后,取5 μg 總RNA用于cDNA第1鏈的合成,-20 ℃保存。

從本課題組已有轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中獲得編號為CL231.Contig1和Unigene20935的序列,使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計特異性引物(表1)。以上述合成的cDNA為模板,使用高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR反應(yīng)體系(50 μL): 模板cDNA 2 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各1 μL, 5×TransStart?FastPfuBuffer 10 μL,TransStart?FastPfuDNA Polymerase 1 μL, dNTPs(2.5 mmol/L) 4 μL, Nuclease-free Water 31 μL。PCR反應(yīng)程序: 95 ℃ 1 min; 95 ℃ 20 s, x ℃ 20 s, 72 ℃ 40 s, 40個循環(huán);72 ℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司測序。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.4 生物信息學(xué)分析

使用在線網(wǎng)站NCBI ORF Finder(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)分析1.3節(jié)克隆的兩個基因的開放閱讀框(ORF),使用CD-search分析氨基酸的保守結(jié)構(gòu)域,使用Expasy ProtParam(https:∥web.expasy.org/protparam/)分析所編碼蛋白質(zhì)基本的理化性質(zhì),用Expasy ProtScale(https:∥web.expasy.org/protscale/)分析所編碼蛋白的親疏水性,使用cell-PLoc2.0(http:∥www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)分析蛋白的亞細(xì)胞定位,使用SignalP 5.0進(jìn)行信號肽分析,使用Psipred在線工具預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu),使用clustalx進(jìn)行多序列比對后利用ESPript在線軟件(https:∥espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)對序列比對結(jié)果進(jìn)行驗證,同時將二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果進(jìn)行標(biāo)注?；谛潜隤aGSTd1和PaGSTd2與其他物種GSTs氨基酸序列使用MEGA6軟件采用鄰接法(neighbour-joining method, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,各分支均進(jìn)行1 000次的重復(fù)檢驗。

1.5 星豹蛛GST基因的時空表達(dá)檢測

收集星豹蛛2齡若蛛60頭、3齡若蛛35頭、4齡若蛛20頭、5齡若蛛10頭、6齡若蛛4頭和雌雄成蛛各1頭,液氮速凍放入-80 ℃冰箱備用。選取星豹蛛雌雄成蛛各20頭,液氮速凍后迅速在冰上解剖出頭胸部、腹和足,樣品放入液氮中保存?zhèn)溆?。以上每個樣品均進(jìn)行3次重復(fù)。分別提取以上樣品的RNA,并反轉(zhuǎn)錄合成為單鏈cDNA于-80 ℃保存?zhèn)溆?。以?Actin作為內(nèi)參基因(李銳等, 2015)檢測1.3節(jié)克隆的兩個基因的時空表達(dá)。RT-qPCR擴(kuò)增引物使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計,上海生工生物工程股份有限公司合成(表1)。RT-qPCR擴(kuò)增根據(jù)ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒說明書進(jìn)行。RT-qPCR反應(yīng)體系(20 μL): 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各0.4 μL, cDNA 1 μL, ddH2O 8.2 μL。RT-qPCR反應(yīng)程序: 95 ℃ 30 s; 95 ℃ 10 s, 60 ℃ 30 s, 40個循環(huán);生成熔解曲線:95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 95 ℃ 15 s。技術(shù)重復(fù) 3次。

1.6 溴氰菊酯脅迫后星豹蛛GST基因的表達(dá)量檢測

選取體型均一且發(fā)育正常的星豹蛛雄成蛛,采用藥膜法處理星豹蛛,檢測1.3節(jié)克隆的2個GST基因在溴氰菊酯脅迫下的相對表達(dá)量。溴氰菊酯濃度參照本課題組已有的生物測定結(jié)果:LC10: 5.151 mg/L; LC30:8.619 mg/L; LC50:12.311 mg/L(李薩麗, 2017)。將溴氰菊酯用丙酮稀釋為以上3個濃度作為試驗組,對照組試蟲使用等量的丙酮處理。藥液放入4 mL離心管密封保存,用移液槍移取1 mL藥液到指形管中,用手堵住管口晃動,使藥液在管內(nèi)壁形成一層均勻的藥膜,陰涼處自然風(fēng)干備用。向準(zhǔn)備好的藥管中轉(zhuǎn)移星豹蛛雄成蛛,使雄成蛛在管內(nèi)活動25 min后轉(zhuǎn)移至另一個干凈的指形管,放入人工氣候箱中,開始計時。在6, 12, 18, 24和48 h時收集活躍的雄成蛛進(jìn)行GST基因表達(dá)量檢測。每個樣品取樣3頭,重復(fù)3次。其中LC10共處理55頭,LC30共處理70頭,LC50共處理100頭,對照組共處理45頭。RNA提取及cDNA第1鏈合成同1.3節(jié);RT-qPCR反應(yīng)體系與步驟同1.5節(jié)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

基因表達(dá)量數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt方法計算,利用SPSS 25.0軟件分析差異顯著性,雌雄成蛛間相同組織中基因表達(dá)量差異進(jìn)行獨立樣本t檢驗,其他數(shù)據(jù)使用Duncan氏新復(fù)極差法。

2 結(jié)果

2.1 星豹蛛GST基因的克隆與序列

克隆獲得星豹蛛2個Delta亞族 GST基因PaGSTd1(GenBank登錄號: OR096398)和PaGSTd2(GenBank登錄號: OR096399) (圖1),cDNA全長分別為708和793 bp,均包含一個645 bp完整的開發(fā)閱讀框,編碼214個氨基酸殘基,推測蛋白分子式分別為C1111H1710N272O323S10和C1101H1722N274O324S10,分子量分別為24.37和24.30 kD,等電點分別為 5.09和6.45。PaGSTd1不穩(wěn)定系數(shù)為40.33,屬不穩(wěn)定蛋白;PaGSTd2不穩(wěn)定系數(shù)為35.12,屬于穩(wěn)定蛋白。PaGSTd1和PaGSTd2總平均親水系數(shù)分別為-0.330和-0.368,預(yù)測兩蛋白均為親水性蛋白。PaGSTd1和PaGSTd2屬于細(xì)胞質(zhì)型GSTs,均沒有信號肽,屬于非分泌蛋白,二級結(jié)構(gòu)與其他GSTs一樣,含有完整的N端(第3-76位氨基酸)和C端(第90-207位氨基酸)結(jié)構(gòu)域,且N端由β-α-β-α-β-β-α共由7個結(jié)構(gòu)基序組成,而C端由5～6個α螺旋組成,沒有β折疊。其中PaGSTd1 N端具有GSH結(jié)合位點:S11-H52-C53-V54-E66-S67,C端具有疏水性底物結(jié)合位點:I103-Y107-K108-G111-E112-Y115-K120-S164-F167-F206;PaGSTd2的N端具有GSH結(jié)合位:C11-H52-T53-V54-E66-S67,C端具有疏水性底物結(jié)合位點:N103-S107-K108-S111-E112-N115-N163-A167-F206。

系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示(圖2),星豹蛛與擬環(huán)紋豹蛛Pardosapseudoannulata的親緣關(guān)系最近,其中PaGSTd1與擬環(huán)紋豹蛛GST(GenBank登錄號: QGA31147.1)的氨基酸序列一致性為90.19%,PaGSTd2與擬環(huán)紋豹蛛GST(GenBank登錄號: QGA31146.1)的氨基酸序列一致性為96.73%。

圖2 鄰接法構(gòu)建的基于氨基酸序列的星豹蛛與其他物種GSTs的系統(tǒng)進(jìn)化樹(1 000次重復(fù))Fig. 2 Phylogenetic tree of GSTs of Pardosa astrigera and other species based on the amino acid sequence by neighbour-joining method (1 000 replicates)

2.2 星豹蛛GST基因的時空表達(dá)

不同發(fā)育階段GST基因的相對表達(dá)量檢測結(jié)果表明,PaGSTd1和PaGSTd2在星豹蛛各發(fā)育階段均有表達(dá)。PaGSTd1在4齡若蛛中表達(dá)量最高,與6齡若蛛中的表達(dá)量無顯著差異(P>0.05),其次是在成蛛、3齡若蛛和2齡若蛛中的表達(dá)量,在5齡若蛛中的表達(dá)量最低,顯著低于其他發(fā)育階段個體中的(P<0.05)(圖3: A)。PaGSTd2在成蛛中的表達(dá)量最高,與在3齡若蛛中的表達(dá)量無顯著差異(P>0.05),在5齡若蛛中的表達(dá)量最低,與在2, 4和6齡若蛛中的表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)(圖3: B)。

不同成蛛組織中GST基因的相對表達(dá)量檢測結(jié)果表明,PaGSTd1和PaGSTd2在星豹蛛雌雄成蛛頭胸部、腹和足中均有表達(dá),且存在顯著性差異。PaGSTd1在雄成蛛足中表達(dá)量最高,顯著高于在雄成蛛腹中的表達(dá)量(P<0.05),與在頭胸部的表達(dá)量無顯著差異(P>0.05);PaGSTd1在雄成蛛頭胸部和足中的表達(dá)量顯著高于雌成蛛的(P<0.05),在腹中的表達(dá)量于雌雄成蛛間無顯著差異(P>0.05)(圖4: A)。PaGSTd2在雄成蛛足中的表達(dá)量最高,在腹中的次之,在頭胸部的最低;對于同種組織而言,PaGSTd2在雄成蛛的表達(dá)量均顯著高于在雌成蛛的(P<0.05)(圖4: B)。

圖4 星豹蛛PaGSTd1(A)和PaGSTd2(B)在雌雄成蛛不同組織中的相對表達(dá)量Fig. 4 Relative expression levels of PaGSTd1 (A) and PaGSTd2 (B) in different tissues of female and male adults of Pardosa astrigera圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;柱上不同大小寫字母分別表示雌雄成蛛不同組織間基因表達(dá)量經(jīng)Duncan氏新復(fù)極差法檢驗差異顯著(P<0.05);柱上符號表示同一組織不同性別之間基因表達(dá)量經(jīng)獨立樣本t檢驗時的差異顯著性(*P<0.05; ns P>0.05)。Data in the figure are mean±SD. Different uppercase and lowercase above bars indicate significant difference in the gene expression level among different tissues of female and male adults, respectively, by Duncan’s new multiple range test (P<0.05). Symbols above bars indicate significance of difference in the gene expression level in the same tissue between different genders by independent samples t-test (*P<0.05; ns P>0.05).

2.3 溴氰菊酯脅迫后星豹蛛GST基因的表達(dá)量

經(jīng)LC10濃度溴氰菊酯脅迫18和24 h時PaGSTd1表達(dá)量與其他脅迫時間的表達(dá)量存在顯著差異(P<0.05),且在24 h時表達(dá)量達(dá)到最高。LC30濃度溴氰菊酯脅迫6, 12, 18, 24和48 h時PaGSTd1表達(dá)量之間均存在顯著差異(P<0.05),且在48 h時表達(dá)量最高,其次是18 h時的,在6 h時的表達(dá)量最低。LC50濃度溴氰菊酯脅迫6, 12和48 h時PaGSTd1表達(dá)量與其他2個時間點存在顯著差異(P<0.05),在18 h時表達(dá)量最低(圖5: A)。

LC10, LC30和LC50濃度溴氰菊酯脅迫6 h時,PaGSTd1表達(dá)量與對照組(等量丙酮處理)相比均顯著降低(P<0.05),且LC30濃度下表達(dá)量最低;脅迫12 h時3個濃度間PaGSTd1表達(dá)量均沒有顯著差異(P>0.05);脅迫18 h時LC10和LC50濃度下PaGSTd1表達(dá)量與對照組相比顯著降低(P<0.05),LC30濃度下PaGSTd1表達(dá)量與對照組相比顯著上調(diào)(P<0.05);LC10, LC30和LC50濃度溴氰菊酯脅迫24 h時PaGSTd1表達(dá)量與對照組相比均顯著上調(diào)(P<0.05),且LC10濃度下表達(dá)量最高,但LC30和LC50濃度下PaGSTd1表達(dá)量間無顯著差異(P>0.05)。LC10和LC50濃度溴氰菊酯脅迫48 h時PaGSTd1表達(dá)量與對照組相比顯著降低(P<0.05),LC30濃度下PaGSTd1表達(dá)量與對照組相比顯著上調(diào)(P<0.05)(圖5: A)。

LC10濃度溴氰菊酯脅迫6, 12, 18, 24和48 h時PaGSTd2表達(dá)量兩兩時間點之間均存在顯著差異(P<0.05),且在6 h時表達(dá)量達(dá)到最高,24 h時表達(dá)量最低。LC30濃度溴氰菊酯脅迫12, 18和24 h時PaGSTd2表達(dá)量與6和48 h時的表達(dá)量存在顯著差異(P<0.05),且在18 h時表達(dá)量最高,在24 h時表達(dá)量最低。LC50脅迫6 h時PaGSTd2表達(dá)量與12, 18, 24和48 h時表達(dá)量間存在顯著差異(P<0.05),且在6 h時表達(dá)量最低(圖5: B)。

溴氰菊酯脅迫6 h時,LC10濃度下PaGSTd2表達(dá)量與對照組相比顯著上調(diào)(P<0.05),LC30和LC50濃度下PaGSTd2表達(dá)量與對照組相比顯著降低(P<0.05),且LC50濃度下PaGSTd2表達(dá)量最低。脅迫12 h時,LC10和LC30濃度下PaGSTd2表達(dá)量與對照組相比均顯著降低(P<0.05),且LC30濃度下PaGSTd2表達(dá)量最低。溴氰菊酯脅迫18 h時,LC10和LC30濃度下PaGSTd2表達(dá)量與對照組相比顯著上調(diào)(P<0.05),且LC30濃度下PaGSTd2表達(dá)量最高,LC50濃度下PaGSTd2表達(dá)量與對照組相比顯著降低(P<0.05)。溴氰菊酯脅迫24 h時,LC10和LC30濃度下PaGSTd2表達(dá)量與對照組相比顯著降低(P<0.05),LC30濃度下PaGSTd2表達(dá)量最低,LC50濃度下PaGSTd2表達(dá)量溴氰菊酯脅迫顯著上調(diào)(P<0.05)。溴氰菊酯脅迫48 h時,LC10, LC30和LC50下PaGSTd2表達(dá)量與對照組相比均顯著降低(P<0.05),且LC30濃度下PaGSTd2表達(dá)量最低(圖5: B)。

3 討論

本研究基于星豹蛛轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果,利用RT-PCR技術(shù)克隆得到2個谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶Delta亞族基因的cDNA全長序列。2個蛋白均包含完整的N端和C端結(jié)構(gòu)域(圖1),且N端包含有GSH結(jié)合位點(G位點)以及C端包含有疏水性底物結(jié)合位點(H位點),這兩個位點構(gòu)成了GST的活性中心。推測蛋白通過催化GSH與底物特異性結(jié)合,來減少蟲體免受底物的損傷。多序列連配和系統(tǒng)進(jìn)化結(jié)果顯示,PaGSTd1和PaGSTd2的氨基酸序列與其他物種Delta亞族GSTs表現(xiàn)出很高的一致性,與擬環(huán)紋豹蛛的親緣關(guān)系最近(圖2)。Delta和Epsilon亞族是昆蟲特有的家族(Kettermanetal., 2011)。已有研究多次報道GSTs通過基因上調(diào)表達(dá)對多種殺蟲劑的脅迫做出了響應(yīng),說明與昆蟲的抗藥性緊密相關(guān)(Lietal., 2007)。

昆蟲GST基因在不同組織中的表達(dá)存在一定的差異,而不同表達(dá)模式暗示其潛在的生物學(xué)功能(Wangetal., 2019)。一般認(rèn)為,中腸、脂肪體和馬氏管是昆蟲三大主要的解毒器官(Mengetal., 2019)。在本研究中,PaGSTd1和PaGSTd2在星豹蛛成蛛頭胸部、腹部和足中均有表達(dá),且都是在足中表達(dá)量最高(圖4)。蜘蛛的頭胸部是神經(jīng)中樞的聚集地(龔忱和王智, 2011),且分布有口、咽、食道和吸吮胃,這些消化器官主要作用是把食物吸入體內(nèi);蜘蛛腹部分布有中腸和馬氏管,足部分布著中腸分支盲囊,主要作用是暫時儲存液態(tài)食物(張征田等, 2010)?？梢酝茰y出GST基因在星豹蛛成蛛不同組織中均發(fā)揮著解毒代謝的作用,而足部盲囊對食物的儲存可能提高了足部GST基因的表達(dá)來代謝外源有毒物質(zhì)。

昆蟲GST基因生長發(fā)育的表達(dá)在不同物種間具有特異性(Liuetal., 2017)。楊雪清(2014)的研究表明,蘋果蠹蛾CpGSTd1在幼蟲階段表達(dá)量較低,在蛹和成蟲期表達(dá)量較高;而You等(2015)的研究表明小菜蛾的GSTd4和GSTd5在幼蟲階段的表達(dá)量要顯著高于其他階段的,與本研究2個基因在星豹蛛不同發(fā)育階段的表達(dá)模式不同。在本研究中,PaGSTd1和PaGSTd2在星豹蛛6個發(fā)育階段均有表達(dá),說明GST基因參與了星豹蛛整個生長發(fā)育過程。PaGSTd1在4齡若蛛、6齡若蛛和成蛛表達(dá)量較高,PaGSTd2在3齡若蛛和成蛛中表達(dá)量高(圖3)。在若蛛期表達(dá)量高可能是由于若蛛在生長發(fā)育的過程需要提高代謝來抵御外來有毒物質(zhì)的入侵;成蛛表達(dá)量高可能是由于成蛛捕食量過大,通過基因的高表達(dá)來達(dá)到解毒代謝的目的。也可以推測出星豹蛛不同GST基因在其生長發(fā)育的不同關(guān)鍵時間點起作用。

溴氰菊酯,又叫敵殺死,是擬除蟲菊酯類農(nóng)藥中殺蟲活性較大的一種,具有觸殺和胃毒作用,且觸殺作用迅速,擊倒力強(qiáng)。已有大量研究表明,昆蟲抗藥性的產(chǎn)生與基因過表達(dá)有關(guān)。樊東和劉艷(2019)用不同濃度高效氯氰菊酯處理黏蟲不同時間,結(jié)果顯示,在處理24 h時,各濃度處理MsGSTe1表達(dá)量顯著上調(diào),且谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的酶活性提高,這與本研究中不同濃度溴氰菊酯處理星豹蛛24 h后PaGSTd1表達(dá)情況一致。金燕璐等(2018)用氯蟲苯甲酰胺脅迫二化螟Chilosuppressalis12 h后,10個基因表達(dá)量顯著上調(diào),推測這些基因?qū)β认x苯甲酰胺的脅迫做出了響應(yīng);而在本研究中,溴氰菊酯脅迫星豹蛛12 h后2個基因表達(dá)量均低于對照,但在其他時間點出現(xiàn)了表達(dá)量升高的情況。推測可能因為藥劑處理后星豹蛛蟲體出現(xiàn)中毒現(xiàn)象,基因選擇性下調(diào)表達(dá),起一個補(bǔ)償作用。PaGSTd1在LC30濃度溴氰菊酯處理18和48 h后被顯著誘導(dǎo),LC10濃度溴氰菊酯處理下在24 h時被顯著誘導(dǎo)后又恢復(fù)到之前表達(dá)水平(圖5: A)。PaGSTd2在LC10濃度溴氰菊酯處理下基因表達(dá)處于一個反復(fù)波動的情況,具體原因需要進(jìn)一步探究;在18 h時LC10和LC30濃度溴氰菊酯處理PaGSTd2都被誘導(dǎo)表達(dá),LC50濃度溴氰菊酯處理在24 h時PaGSTd2被誘導(dǎo)表達(dá)(圖5: B)。由此可以推斷溴氰菊酯對PaGSTd2的誘導(dǎo)存在明顯的濃度和時間效應(yīng),且不同時間蟲體對藥物的敏感程度不一。進(jìn)一步可以證明,有基因上調(diào)的同時必然有基因下調(diào)去參與解毒,每個解毒酶基因在不同的藥劑處理時間發(fā)揮不同作用,才能維持蟲體的正常生理需求。本研究可以初步推測出星豹蛛PaGSTd1和PaGSTd2兩個基因?qū)︿迩杈挣サ拿{迫做出了一定程度的響應(yīng)。

本研究成功克隆得到2個星豹蛛谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因,并分析其時空表達(dá)模式以及溴氰菊酯脅迫后基因的表達(dá)情況,初步推測出兩基因?qū)︿迩杈挣サ拿{迫做出了響應(yīng),為后續(xù)繼續(xù)通過RNAi或基因敲除等技術(shù)探究基因的功能提供線索。