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    黃芩苷通過調(diào)控MET/EGFR 通路對肝癌細(xì)胞增殖的影響

    2023-10-30 06:12:26胡志萍付皓云胡齊欣
    中成藥 2023年10期
    關(guān)鍵詞:克唑替尼吉非抑制率

    胡志萍,甘 寧,李 嫚,付皓云,胡齊欣

    (湖北省腫瘤醫(yī)院,湖北 武漢 430079)

    肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC) 是全球健康的重大威脅之一,雖然目前人類已經(jīng)在肝癌預(yù)防方面取得了巨大的進(jìn)展,但是肝癌的總發(fā)病率和死亡率仍在持續(xù)上升[1]。有研究發(fā)現(xiàn),表皮因子生長受體 (epidermal growth factor receptor,EGFR) 可以作為轉(zhuǎn)錄因子直接參與調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄,間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子 (mesenchymalepithelial transition factor,MET) 與癌細(xì)胞的惡性表型密切相關(guān)[2]。黃芩具有解熱、抗菌、抗炎、抗氧化等藥理作用[3-4],黃芩苷是其主要成分之一。有較多研究表明,黃芩苷能通過各種信號通路對肝癌細(xì)胞增殖、遷移和凋亡產(chǎn)生影響[5-7],但其對MET/EGFR 通路的作用機(jī)制以及其生物學(xué)功能尚不明確。本研究以黃芩苷、MET 抑制劑克唑替尼和EGFR 抑制劑吉非替尼處理人肝癌HepG-2 細(xì)胞,通過檢測MET/EGFR 信號通路相關(guān)的通路蛋白表達(dá)探討黃芩苷對肝癌細(xì)胞的影響及其可能機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞 人肝癌HepG-2 細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫,由武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司實(shí)驗(yàn)室保種。

    1.2 試劑與藥物 黃芩苷(上海阿拉丁生化科技有限公司,批號B110209)。MET 抑制劑克唑替尼、EGFR 抑制劑吉非替尼(美國MedChemExpress 公司,批號HY-50878、HY-50895)。MEM 培養(yǎng)基(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司,貨號TBD32561); 胎牛血清(武漢普諾賽生命科技有限公司,批號164210); 磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、0.25%胰蛋白酶(南京森貝伽生物科技有限公司,批號BL-O003、SBJ-L0045); CCK8 試劑、MET、EGFR、β-actin(武漢貝茵萊生物科技有限公司,批號C1706、PAB36425、PAB30672、PAB36265); AnnexinV-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒(上海撫生實(shí)業(yè)有限公司,批號FS-79505); PI/Rnase Staining Buffer Solution (上海谷研實(shí)業(yè)有限公司,批號GOY-K14070); p-MET、p-EGFR (英國Abcam 公司,批號ab5662、ab40815)。

    1.3 儀器 倒置熒光顯微鏡(東莞市瑞顯光學(xué)儀器有限公司); SpectraMax 酶標(biāo)儀[美谷分子儀器(上海) 有限公司];流式細(xì)胞儀(美國Agilent 公司); 電泳儀(美國Bio-Rad 公司); 全自動化學(xué)發(fā)光分析儀(上海天能科技有限公司)。

    1.4 黃芩苷最適質(zhì)量濃度、作用時間篩選 HepG-2 細(xì)胞以每孔3.0×103個的密度接種于96 孔板,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜,待細(xì)胞貼壁后棄培養(yǎng)基,分別加入含0、2.5、5、7.5、10、12.5 μg/mL 黃芩苷的培養(yǎng)基[6],每組3 個復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48 h,每孔加入10 μL CCK8 溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,在酶聯(lián)免疫檢測儀450 nm波長處測量各孔吸光度,設(shè)置調(diào)零孔(僅加培養(yǎng)基和CCK8 溶液),計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

    1.5 分組與給藥 HepG-2 細(xì)胞以每孔3×103個的密度接種于96 孔板,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜,待細(xì)胞貼壁后,分為對照組、黃芩苷組(12.5 μg/mL)、克唑替尼組 (1 μmol/L)、黃芩苷+克唑替尼組 (12.5 μg/mL+1 μmol/L)、吉非替尼組(1 μmol/L)、黃芩苷+吉非替尼組(12.5 μg/mL+1 μmol/L)、克唑替尼+吉非替尼組(1 μmol/L+1 μmol/L)、黃芩苷+克唑替尼+吉非替尼組(12.5 μg/mL+1 μmol/L+1 μmol/L),棄舊培養(yǎng)基,加入含相應(yīng)劑量藥物的新培養(yǎng)基,培養(yǎng)48 h。

    1.6 CCK-8 檢測細(xì)胞增殖抑制率 細(xì)胞按“1.5” 項(xiàng)下方法處理,48 h 后每孔加入10 μL CCK8 溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h,在酶聯(lián)免疫檢測儀450 nm 波長處測量吸光度,設(shè)置調(diào)零孔(僅加培養(yǎng)基和CCK8 溶液),計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

    1.7 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 收集各組細(xì)胞,每組約1×106個,4 ℃、400×g離心5 min,重懸于200 μL PBS 中,加入10 μL Annexin V-FITC、10 μL 碘化丙啶(propidium,PI),混勻后4 ℃避光孵育30 min,加入300 μL PBS 上機(jī)檢測,通過NovoExpress 軟件進(jìn)行分析。

    1.8 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 收集各組細(xì)胞,每組約1×107個,4 ℃、400×g離心5 min,重懸于300 μL PBS 中,加入700 μL 無水乙醇,置于-20 ℃冰箱中固定24 h 以上,4 ℃、700×g離心5 min,100 μL 1 mg/mL RNase A 溶液重懸細(xì)胞,于37 ℃培養(yǎng)箱中消化細(xì)胞RNA 30 min,加入400 μL 50 μg/mL PI 溶液,4 ℃避光孵育10 min,上機(jī)檢測,通過NovoExpress 軟件進(jìn)行分析。

    1.9 Western blot 法檢測細(xì)胞MET、EGFR 蛋白表達(dá) 取各組細(xì)胞,裂解提取蛋白,離心后取上清液,蛋白定量后進(jìn)行變性,經(jīng)SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜,5%脫脂奶粉溶液室溫封閉過夜,加一抗室溫孵育1 h,PBST 洗滌3次,加HRP 標(biāo)記的二抗(1 ∶10 000) 室溫孵育1 h,PBST洗滌3 次,加入ECL 發(fā)光液,于全自動化學(xué)發(fā)光分析儀中顯影,通過TANON GIS 軟件讀取相關(guān)條帶灰度值,以βactin 為內(nèi)參,計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)。

    1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 19.0 軟件進(jìn)行處理,計(jì)量資料以(±s) 表示,2 組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 黃芩苷最適質(zhì)量濃度、作用時間篩選 如表1 所示,除12.5 μg/mL 外,其他質(zhì)量濃度黃芩苷在干預(yù)12、24、48 h 后均對HepG-2 細(xì)胞增殖抑制率無明顯影響 (P>0.05); 12.5 μg/mL 黃芩苷干預(yù)12、24、48 h 后,HepG-2細(xì)胞增殖抑制率升高(P<0.05),以48 h 最顯著,因此選擇12.5 μg/mL 黃芩苷作用48 h。

    表1 不同質(zhì)量濃度黃芩苷作用不同時間對HepG-2 細(xì)胞增殖抑制率的影響(±s,n=3)

    表1 不同質(zhì)量濃度黃芩苷作用不同時間對HepG-2 細(xì)胞增殖抑制率的影響(±s,n=3)

    注: 與同一作用時間其他質(zhì)量濃度比較,*P<0.05。

    黃芩苷/(μg·mL-1)時間12 h24 h48 h 2.5-0.17±4.42-0.71±1.25-0.39±2.60 5-2.05±4.051.58±1.950.74±2.13 7.51.07±2.22-1.57±1.982.92±2.68 10-0.92±1.50-1.33±0.654.86±1.87 12.56.66±2.48*9.75±1.03*23.26±1.37*

    2.2 黃芩苷和MET、EGFR 信號通路抑制劑對HepG-2 細(xì)胞凋亡、增殖的影響 與對照組比較,其余組細(xì)胞凋亡率和G1期細(xì)胞比例升高(P<0.05),黃芩苷+吉非替尼組細(xì)胞凋亡率和G1期細(xì)胞比例高于吉非替尼組(P<0.05),黃芩苷+克唑替尼組細(xì)胞凋亡率和G1期細(xì)胞比例高于克唑替尼組(P<0.05),黃芩苷+克唑替尼+吉非替尼組細(xì)胞凋亡率和G1期細(xì)胞比例高于克唑替尼+吉非替尼組(P<0.05),見圖1~2、表2。

    圖1 各組HepG-2 細(xì)胞凋亡情況

    圖2 各組HepG-2 細(xì)胞周期變化

    表2 各組HepG-2 細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期比較(±s,n=3)

    表2 各組HepG-2 細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期比較(±s,n=3)

    注: 與對照組比較,*P<0.05; 與克唑替尼組比較,#P<0.05;與吉非替尼組比較,△P <0.05; 與克唑替尼+吉非替尼組比較,▲P<0.05。

    組別凋亡率/%G1 期細(xì)胞比例/%對照組2.34±1.3036.05±0.52黃芩苷組34.48±0.20*49.74±0.29*克唑替尼組18.16±0.8844.65±1.34黃芩苷+克唑替尼組43.17±0.64#53.02±0.60#吉非替尼組23.03±0.7345.88±0.39黃芩苷+吉非替尼組47.22±1.08△54.60±0.59△克唑替尼+吉非替尼組38.06±1.1249.44±0.73黃芩苷+克唑替尼+吉非替尼組 52.51±0.18▲59.86±0.55▲

    2.3 黃芩苷和MET、EGFR 信號通路抑制劑對HepG-2 細(xì)胞增殖抑制率的影響 與對照組比較,其余組細(xì)胞增殖抑制率均升高(P<0.05),黃芩苷+吉非替尼組細(xì)胞增殖抑制率高于吉非替尼組(P<0.05),黃芩苷+克唑替尼組細(xì)胞增殖抑制率高于克唑替尼組(P<0.05),黃芩苷+克唑替尼+吉非替尼組細(xì)胞增殖抑制率高于克唑替尼+吉非替尼組(P<0.05),見表3。

    表3 各組HepG-2 細(xì)胞增殖抑制率比較(±s,n=3)

    表3 各組HepG-2 細(xì)胞增殖抑制率比較(±s,n=3)

    注: 與對照組比較,*P<0.05; 與克唑替尼組比較,#P<0.05;與吉非替尼組比較,△P <0.05; 與克唑替尼+吉非替尼組比較,▲P<0.05。

    組別增殖抑制率/%對照組0.00±0.93黃芩苷組29.35±0.54*克唑替尼組13.90±1.33黃芩苷+克唑替尼組37.29±0.41#吉非替尼組17.22±0.04黃芩苷+吉非替尼組39.94±0.41△克唑替尼+吉非替尼組31.87±0.46黃芩苷+克唑替尼+吉非替尼組45.95±0.33▲

    2.4 黃芩苷和MET、EGFR 信號通路抑制劑對MET/EGFR信號通路蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較,其余組細(xì)胞p-MET、p-EGFR 蛋白表達(dá)降低(P<0.05),黃芩苷+吉非替尼組細(xì)胞p-MET、p-EGFR 蛋白表達(dá)低于吉非替尼組(P<0.05),黃芩苷+克唑替尼組細(xì)胞p-MET、p-EGFR 蛋白表達(dá)低于克唑替尼組(P<0.05),黃芩苷+克唑替尼+吉非替尼組細(xì)胞p-MET、p-EGFR 蛋白表達(dá)低于克唑替尼+吉非替尼組(P<0.05),見表4、圖3。

    圖3 各組HepG-2 細(xì)胞MET/EGFR 通路蛋白條帶

    表4 各組HepG-2 細(xì)胞MET/EGFR 信號通路蛋白表達(dá)比較(±s,n=3)

    表4 各組HepG-2 細(xì)胞MET/EGFR 信號通路蛋白表達(dá)比較(±s,n=3)

    注: 與對照組比較,*P<0.05; 與克唑替尼組比較,#P<0.05; 與吉非替尼組比較,△P<0.05; 與克唑替尼+吉非替尼組比較,▲P<0.05。

    組別METp-METEGFRp-EGFR對照組1 412.33±38.891 183.67±50.611 424.67±32.02932.67±28.50黃芩苷組1 467.00±23.261 067.00±39.15*1 399.33±35.70770.00±31.80*克唑替尼組1 429.00±41.15836.00±26.511 409.67±39.21690.33±27.10黃芩苷+克唑替尼組1 426.00±36.04755.33±30.57#1 400.00±33.60652.33±24.34#吉非替尼組1 462.67±28.291 046.67±23.031 452.67±38.07555.67±20.40黃芩苷+吉非替尼組1 382.00±46.00900.67±24.13△1 454.33±28.02467.67±21.13△克唑替尼+吉非替尼組1 382.00±44.03614.00±16.521 441.00±39.61378.00±21.28黃芩苷+克唑替尼+吉非替尼組1 360.33±47.75496.33±25.77▲1 460.67±34.59261.00±22.91▲

    3 討論

    黃芩是我國傳統(tǒng)中藥材,主產(chǎn)于河北、山東等地,具有解熱、抗菌、抗炎、抗氧化等藥理作用[8-9]。Oh 等[10]研究發(fā)現(xiàn),從甘草中提取的甘草查爾酮可以通過抑制EGFR和MET 來抑制肺癌細(xì)胞活性。傳統(tǒng)中藥在治療癌細(xì)胞中的價值越來越高。本研究發(fā)現(xiàn),黃芩苷干預(yù)后HepG-2 細(xì)胞增殖抑制率升高,與MET、EGFR 信號通路抑制劑單獨(dú)干預(yù)的效果相似; 黃芩苷與MET、EGFR 信號通路抑制劑同時干預(yù),能夠達(dá)到更好的HepG-2 細(xì)胞增殖抑制效果,與先前大鼠膽汁中黃芩苷的代謝物黃芩素6-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的研究相類似[11]。

    細(xì)胞凋亡作為程序性細(xì)胞死亡,在正常組織的發(fā)育和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起著重要的作用,不正常的凋亡可能表現(xiàn)為癌癥或自身免疫疾病[12-13]。細(xì)胞凋亡減少和細(xì)胞周期縮短都是腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)之一。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期也有一定的關(guān)系,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號通路的激活會終止細(xì)胞周期進(jìn)程[14]。目前已有研究指出,黃芩苷能夠通過PI3K/Akt/mTOR 途徑和線粒體功能障礙來抑制人軟骨肉瘤細(xì)胞生長和促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]。黃芩苷與信號通路調(diào)控細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期密切相關(guān)[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn),黃芩苷干預(yù)后HepG-2 細(xì)胞凋亡率和G1期細(xì)胞比例升高,與MET、EGFR信號通路抑制劑單獨(dú)干預(yù)的效果相似,且聯(lián)合干預(yù)也能獲得更好效果。這與黃芩苷可能通過JNK/FoxO1/BIM 信號通路抑制胰腺癌SW1990 細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡的研究[18]及黃芩苷能夠抑制慢性糜爛性胃炎濁毒患者體內(nèi)的Met 信號來減少炎癥并恢復(fù)細(xì)胞周期的研究相一致[19]。

    MET/EGFR 信號通路與肝臟發(fā)育、增殖和肝細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)[20]。該通路的研究已經(jīng)成為了癌癥治療的一大突破口。本研究發(fā)現(xiàn),黃芩苷干預(yù)后HepG-2 細(xì)胞中p-MET 和p-EGFR 蛋白表達(dá)均降低,表明黃芩苷具有抑制MET 和EGFR 信號通路的效果; 且黃芩苷和MET、EGFR信號通路抑制劑聯(lián)合干預(yù)后,MET、EGFR 通路蛋白表達(dá)降低更顯著,提示黃芩苷能單獨(dú)作為MET 和EGFR 信號通路的蛋白抑制劑,同時也能夠增強(qiáng)這2 條信號通路蛋白抑制劑的抑制作用。MET/EGFR 信號通路可作為多種中藥發(fā)揮藥效的信號通路,例如白藜蘆醇能夠靶向EGFR 和c-Met 信號通路來抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖[21]。

    綜上所述,黃芩苷對人肝癌細(xì)胞有明顯的抑制作用,對其凋亡和細(xì)胞周期較大影響,并且可能通過抑制MET/EGFR 信號通路來調(diào)控其細(xì)胞增殖和凋亡,提示黃芩苷有治療肝癌的潛力。

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