復方板藍根顆粒物質(zhì)基礎研究及其整體質(zhì)量評價

胡 青，程益清，曹 帥，孫 健，季 申*

（1.中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院，上海 201203； 2.上海市食品藥品檢驗研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中藥質(zhì)量控制重點實驗室，上海 201203）

復方板藍根顆粒收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準》 中藥成方制劑第十二冊 （編號WS3-B-2377-97），由板藍根、大青葉經(jīng)水提醇沉工藝制得，用于治療風熱感冒、咽喉腫痛，可能通過多途徑、多靶點干預來COVID-19［1］。查詢國家藥監(jiān)局網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有復方板藍根顆粒生產(chǎn)企業(yè)147家，批準文號151 個，質(zhì)量標準17 個，其中1 個部頒標準僅收載了2 項理化鑒別項，無薄層鑒別、含量測定項目，而其余16 個國家標準增加了靛玉紅等成分的TLC 鑒別或含量測定項目，故存在較嚴重的“不同標準” 情況，導致質(zhì)量控制水平落后，市售產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊。

目前，關于復方板藍根顆粒物質(zhì)基礎的文獻較少［2-3］，而涉及質(zhì)量標準的也集中于中靛玉紅、尿苷等1～4 種成分的控制［4-6］，無法全面反映該制劑整體質(zhì)量。因此，本實驗采用UPLC-Q-TOF-MS 法對復方板藍根顆粒進行物質(zhì)基礎研究、整體質(zhì)量評價，以期為進一步提高其質(zhì)量標準提供方向。

1 材料

Waters VION IMS Q-TOF 型液相質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Waters 公司）； Milli-Q Gradient A10 型純水儀（美國Millipore 公司）； 電子分析天平（德國Sartorius 公司）； 超聲儀； 離心機。板藍根（批號121177-201608）、大青葉 （批號121367-200401）對照藥材及靛玉紅（批號110717-201805）、（R，S） -告依春（批號111753-202007）、鳥苷（批號111977-201501）、腺苷（批號110879-201703）、尿苷（批號110887-201803）、酪氨酸（批號140624-201506）、苯丙氨酸（批號140624-201506）、牡荊苷（批號111687-200501）、檸檬酸（批號111679-200401）、紫丁香苷（批號111574-200201） 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院； 靛苷（批號M06A11K120647 ）、3-吲哚甲醛（批號H24A9Z59589）、落葉松樹脂醇 B （ 批號T06A11Z120554 ）、異金雀花素（批號P07A11S120560）、異落葉松樹脂醇 （ 批號Y28J11H116890） 對照品均購自上海源葉生物科技有限公司； 2，4-喹唑啉二酮對照品 （批號20191130） 購自上海沃凱生物技術有限公司。復方板藍根顆粒共112 批，來自50 家企業(yè)（Q1 ～Q50）。乙腈、甲酸為色譜純（德國Merck 公司）；水為超純水。

2 方法

2.1 UPLC-Q-TOF-MS 分析條件

2.1.1 色譜 Waters HSS T3 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）； 流動相乙腈（A） -0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0 ～1 min，100% B； 1 ～6 min，100% ～80%B； 6～18 min，80% ～35%B； 18 ～18.5 min，35% B ～0； 18.5 ～19.5 min，0； 19.5 ～23 min，0 ～100% B）； 體積流量0.5 mL/min； 柱溫40 ℃； 進樣量2 μL。

2.1.2 質(zhì)譜 電噴霧離子源（ESI）； 負離子掃描； 毛細管電壓2.5 kV； 錐孔電壓40 V； 除溶劑氣氮氣，體積流量800 L/h； 除溶劑溫度550 ℃；離子源溫度120 ℃； 掃描范圍m/z50 ～1 000； 掃描時間0.2 s； 碰撞氣氮氣，低能量掃描時碰撞能量4 eV，高能量掃描時碰撞能量25 ～60 eV。以50 pg/μL 亮氨酸-腦啡肽溶液為校正標準液。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取各對照品適量，甲醇制成質(zhì)量濃度均為20 μg/mL 的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取112 批樣品，每批各約2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入10 mL甲醇，密塞，稱定質(zhì)量，超聲 （功率250 W，頻率40 kHz，40 ℃以下） 處理1 h，放冷，甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，4 000 r/min 離心5 min，取上清液，即得。

2.3 數(shù)據(jù)處理與分析 采用UNIFI 軟件采集數(shù)據(jù)，對于有對照品的成分，通過比對兩者保留時間、質(zhì)譜碎片特征進行鑒定； 對于沒有對照品的成分，查閱中英文相關文獻，收集已報道組方藥材中的成分信息，包括名稱、分子式、CAS 號、化學結構等，建立初步化學成分數(shù)據(jù)庫，將UNIFI 軟件與其進行自動匹配，質(zhì)量數(shù)偏差設置為±5×10-6，并根據(jù)化合物二級質(zhì)譜信息進行人工確認。

3 結果

3.1 成分鑒定 基峰離子流色譜圖見圖1，共檢測到37 種主要成分［7-15］，包括8 種生物堿、7 種苯丙素、3 種核苷、2 種氨基酸、6 種有機酸、4 種黃酮、1 種含硫成分、6 種其他成分，具體見表1。以峰5、7、15、19、20、24 為例，對其鑒定過程進行分析。

表1 復方板藍根顆?；瘜W成分鑒定結果Tab.1 Results of chemical constituent identification in Compound Banlangen Granules

圖1 復方板藍根顆?；咫x子流色譜圖Fig.1 Base peak ion current chromatogram of Compound Banlangen Granules

峰5 準分子離子峰m/z282.084 0 ［M-H］-，保留時間3.66 min，分子式C10H13N5O5； 二級質(zhì)譜圖中碎片離子為脫去一分子核糖后生成的m/z150.042 4 ［M-H-rib］-，通過比對對照品、查閱文獻［7］、匹配數(shù)據(jù)庫，推測該化合物為鳥苷，屬于核苷類成分。

峰7 準分子離子峰m/z164.071 7 ［M-H］-，保留時間4.27 min，分子式C9H11NO2； 二級質(zhì)譜圖中碎片離子主要有m/z147.044 4 ［M-H-NH3］-、103.054 1 ［M-H-CO2-NH3］-，通過比對對照品、查閱文獻［7］、匹配數(shù)據(jù)庫，推測該化合物為苯丙氨酸，屬于氨基酸類成分。

峰15 準分子離子峰m/z294.098 1 ［M-H］-，保留時間6.09 min，分子式C14H17NO6； 二級質(zhì)譜圖中碎片離子為脫去一分子葡萄糖后生成的m/z131.037 2 ［M-H-Glc-H］-，通過比對對照品、查閱文獻［7］、匹配數(shù)據(jù)庫，推測該化合物為靛苷，屬于生物堿類成分。

峰19 準分子離子峰m/z729.261 0 ［M ＋COOH］-，保留時間6.26 min，分子式C32H44O16；二級質(zhì)譜圖中主要是糖苷鍵斷裂，先丟失一分子或兩分子葡萄糖，再丟失CH2O 形成的碎片離子m/z521.202 5 ［M-H-Glc］-、359.152 3 ［M-H-2Glc］-、329.142 4 ［M-H-2Glc-CH2O］-，通過比對對照品、查閱文獻［12］、匹配數(shù)據(jù)庫，推測該化合物為落葉松樹脂醇B，屬于苯丙素類成分。

峰20 準分子離子峰m/z181.014 5 ［M-H］-，保留時間6.65 min，分子式C8H6O5； 二級質(zhì)譜圖中主要是連續(xù)脫去中性分子CO2后形成的碎片離子m/z137.022 4 ［M-H-CO2］-、m/z93.034 4 ［MH-2CO2］-，通過查閱文獻［7］、匹配數(shù)據(jù)庫，推測該化合物為2-羥基-1，4-苯二甲酸，為有機酸成分。

峰24 準分子離子峰m/z431.097 9 ［M-H］-，保留時間7.75 min，分子式C21H20O10； 二級質(zhì)譜圖碎片離子主要有m/z341.068 9 ［M-HC3H6O3］-、311.056 5 ［M-H-C4H8O4］-、283.060 0［M-H-C5H10O5］-，通過比對對照品、查閱文獻［13］、匹配數(shù)據(jù)庫，推測該化合物為牡荊苷，屬于黃酮類成分。

3.2 整體質(zhì)量評價 選擇3 個主要生產(chǎn)企業(yè)Q1、Q5、Q9 （收集批次最多） 的33 批樣品（Q1 13批，Q5 11 批，Q9 9 批） 作為研究對象，采用SPSS 19.0 軟件，以平均Euclidean 距離為度量標準，通過組間連接法，以37 個共有峰峰面積為變量進行系統(tǒng)聚類分析，結果見圖2。由此可知，組間距為10 時各批樣品聚為3 類，Q1 的3、19、2、43、33、1、18、30、32、5、53，Q5 的31、71、34、37、41、8、105、29 為一類； Q1 的10、61，Q5 的17、107，Q9 的44、106、20、27、35、26、72、21、13 為一類； Q5 的49 為一類，表明其總體聚類區(qū)分較明顯，同一生產(chǎn)企業(yè)樣品質(zhì)量一致性較好，而不同生產(chǎn)企業(yè)的較差。

圖2 33 批復方板藍根顆粒聚類分析圖Fig.2 Cluster analysis plot for thirty-three batches of samples

采用SIMCA-P 13.0 軟件，以37 個共有峰峰面積為自變量，各批樣品為應變量，采用偏最小二乘法-判別分析 （PLS-DA） 依次提取3 個主成分，模型解釋率R2X為0.653，預測能力參數(shù)Q2為0.784，均高于0.5，說明擬合程度較好。將模型建立時分類Y矩陣變量定義為隨機排列20 次，并進行置換檢驗，得到R2為0.279，Q2為-0.322，表明模型未出現(xiàn)過擬合。經(jīng)PLS-DA 模型擬合分析得到散點圖、置換檢驗圖、VIP 圖，分別見圖3 ～5，可知不同生產(chǎn)企業(yè)樣品分別聚類，區(qū)分較明顯，與聚類分析結果一致，表明其質(zhì)量存在一定差異，但同一生產(chǎn)企業(yè)不同批次樣品質(zhì)量差異較小。再對模型各投影VIP 參數(shù)進行分析，其數(shù)值大于1 表明有顯著影響，可作為質(zhì)量差異標志物，其中尿苷、鳥苷、腺苷、檸檬酸、酪氨酸是對分類起到最重要作用的5 個變量，即為區(qū)分不同生產(chǎn)企業(yè)樣品的重要指標，提示在生產(chǎn)過程中應重點監(jiān)控其質(zhì)量變化以減少批次間差異，保證整體質(zhì)量穩(wěn)定。

圖3 PLS-DA 得分散點圖（3 家生產(chǎn)企業(yè)）Fig.3 Score scatter plot for PLS-DA （ three production enterprises）

圖4 模型置換檢驗圖Fig.4 Permutation test plot for model

圖5 PLS-DA VIP 值Fig.5 VIP values for PLS-DA

采用SIMCA-P 13.0 軟件，以37 個共有峰峰面積為自變量，112 批樣品為應變量進行PLS-DA 分析，結果見圖6。由此可知，Q30 樣品65、66 與Q19 樣品42 明顯離群，與其他生產(chǎn)企業(yè)樣品差異較大，并且 （R，S） -告依春、腺苷、鳥苷、尿苷、靛玉紅色譜峰峰面積明顯小于其他樣品，提示其投料的板藍根、大青葉質(zhì)量較差。

圖6 PLS-DA 得分散點圖（所有生產(chǎn)企業(yè)）Fig.6 Score scatter plot for PLS-DA （ all production enterprises）

尿苷、鳥苷、腺苷為板藍根、大青葉共有核苷類成分，是區(qū)分不同生產(chǎn)企業(yè)樣品的重要指標，而（R，S） -告依春為2020 年版《中國藥典》 規(guī)定的板藍根指標成分。為了更好地評價復方板藍根顆粒質(zhì)量，本實驗采用HPLC 法測定上述4 種成分的含量，結果見表2。由此可知，不同生產(chǎn)企業(yè)樣品中各成分含量存在顯著差異； 3 家生產(chǎn)企業(yè)樣品中其平均含量依次為Q5＞Q1＞Q9，并且Q9 樣品中各成分總含量僅為Q5 的21.4%，表明其質(zhì)量不佳；Q19、Q30 的3 批樣品中各成分含量偏低，與PLSDA 分析結果一致，可能存在藥材質(zhì)量較差或不足量投料生產(chǎn)的情況。

4 討論

復方板藍根顆粒具有較強的抗菌、抗病毒、增強免疫力等功效［16］，但其現(xiàn)行標準質(zhì)量控制項目不足，缺乏專屬性，是導致企業(yè)間產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊的重要原因。另外，水提醇沉工藝不利于靛玉紅溶出； 部分企業(yè)所用板藍根、大青葉質(zhì)量較差，使得指標成分［如靛玉紅、（R，S） -告依春等］ 含量較低； 可能存在不足量投料生產(chǎn)的情況。

本實驗采用UPLC-Q-TOF-MS 法對復方板藍根顆粒物質(zhì)基礎進行研究，參考文獻、數(shù)據(jù)庫匹配、二級質(zhì)譜分析，共鑒定出37 個化合物，主要為生物堿、苯丙素、核苷、有機酸、黃酮等，其中板藍根中的生物堿類成分具有多種藥理活性，如抗病毒、抗炎、抗菌、抗腫瘤等［17-19］，有機酸、核苷類成分具有顯著的抗內(nèi)毒素活性［20-21］，結合氨基酸具有抗病毒、抗炎等作用［22］。再通過聚類分析、PLS-DA 等化學計量學方法評價了復方板藍根顆粒整體質(zhì)量，可為該制劑后續(xù)相關研究提供科學依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。