SPRY2 基因在細(xì)胞表型中的研究進(jìn)展

梅其杰 胡 琪 徐文飛 郭錦榮 李崇銘 張久一 袁長深 段 戡▲

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)四肢創(chuàng)傷骨科，廣西南寧 530023；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，廣西南寧 530000

眾所周知，目前許多疾病的病因病機(jī)尚未得以攻克。而隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，這些疾病的機(jī)制逐漸得以證實(shí)。細(xì)胞表型及其功能的研究可以幫助了解相關(guān)基因、蛋白、藥物的機(jī)制，進(jìn)一步解析疾病的病因病機(jī)，其漸漸成為基礎(chǔ)研究不可或缺的手段?？蒲泄ぷ髡哌\(yùn)用生物分子檢測手段判斷細(xì)胞表型及功能，推斷目的基因在組織細(xì)胞中的功能，進(jìn)而闡述目的基因在相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）、微RNA（microRNA，miRNA）、信使RNA（messengerRNA，mRNA）組成的表達(dá)網(wǎng)絡(luò)lncRNA/miRNA/mRNA 作為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，其中mRNA 作為通路的下游因子，在細(xì)胞表型及功能的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用?？焖侔l(fā)育生長因子同源蛋白（sprouty，SPRY）作為一種關(guān)鍵的mRNA，是體內(nèi)受體酪氨酸激酶（receptor protein tyrosine kinase，RTKs）信號(hào)傳導(dǎo)的抑制劑[1]，參與調(diào)控多種疾病發(fā)展；其在細(xì)胞中表達(dá)量的差異性會(huì)誘導(dǎo)出不同的細(xì)胞表型。由SPRY 轉(zhuǎn)錄翻譯的SPRY 蛋白是許多生長因子的共同拮抗劑，在調(diào)節(jié)生物體的生長和發(fā)育方面起著極為重要的作用。目前有4 種亞型：SPRY1、SPRY2、SPRY3 和SPRY4，其中備受關(guān)注的是SPRY2。與其他亞型比較，SPRY2 對(duì)RTKs 體酪氨酸激酶信號(hào)通路的抑制作用顯著增加，其獨(dú)特的生物效應(yīng)在細(xì)胞表型的誘導(dǎo)中起著重要作用。冀為讓臨床工作者更充分地分認(rèn)識(shí)SPRY2 在不同細(xì)胞表型中的功能，本文通過整理文獻(xiàn)并進(jìn)行歸納；同時(shí)為SPRY2 的研究提供有力的理論支持。

1 SPRY 基因與蛋白

1.1 SPRY2 基因

SPRY 家族最早在果蠅基因的研究中發(fā)現(xiàn)，后來在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)4 個(gè)家庭成員SPRY1、SPRY2、SPRY3和SPRY4。SPRY 作為RTKs 調(diào)控成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）和表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）信號(hào)通路的拮抗因子。隨后，在人類胚胎干細(xì)胞中進(jìn)一步證實(shí)SPRY2 是RTKs信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞過程的調(diào)控關(guān)鍵因子；其功能包括調(diào)控細(xì)胞活力[2]、新陳代謝、遷移[3]和細(xì)胞周期[4]控制等。在人類組織樣本中，SPRY2 廣泛表達(dá)于人體組織，如腎上腺、闌尾、骨髓等。SPRY2 的表達(dá)受復(fù)雜、多層次的不同信號(hào)通路調(diào)控，其復(fù)雜的生物學(xué)功能由其翻譯合成的蛋白來實(shí)現(xiàn)。

1.2 SPRY2 蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

SPRY2 是一種含硅和含鐵的蛋白質(zhì)，運(yùn)用透射電子顯微鏡三維重構(gòu)其結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)出類似“甜甜圈”的形狀，帶有兩個(gè)松散連接的唇蓋部分，7 個(gè)大小不等的裂片和2 個(gè)部分覆蓋其孔兩側(cè)的唇裂，總共是9 個(gè)裂片。SPRY2 蛋白含有315 個(gè)人類氨基酸殘基（35 kD），178-282 C’末端殘基富含半胱氨酸。SPRY2 抑制多種RTKS 信號(hào)蛋白和調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖過程主要由其獨(dú)特的、高度保守的、富含半胱氨酸的C’端結(jié)構(gòu)域參與，該區(qū)域是SPRY2 膜易位所必需的。而SPRY2 蛋白的N’末端部分不太保守，這些序列差異可能是SPRY 蛋白之間功能差異的原因[5]。

2 SPRY2 的功能

SPRY2 通過拮抗RTKs 信號(hào)傳導(dǎo)及與各種生長因子相互作用賦予細(xì)胞特定的形態(tài)和功能，導(dǎo)致不同的細(xì)胞表型，包括增殖、凋亡、遷移、侵襲、自噬、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和血管生成等。

2.1 細(xì)胞增殖

SPRY2 作為調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖重要的mRNA[6]，可通過調(diào)控細(xì)胞增殖影響癌癥的進(jìn)展[7]。Liao 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)SPRY2 表達(dá)可以增強(qiáng)RTK 活性并激活RTK/Ras/MAPK 信號(hào)通路，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)[9]，過表達(dá)SPRY2 可抑制小鼠成骨細(xì)胞增殖表達(dá)；相反，用小干擾RNA 沉默SPRY2 后，與轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞比較，F(xiàn)GF 誘導(dǎo)的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1和2 活化增加。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中[10]，集落形成測定法發(fā)現(xiàn)過表達(dá)ALKBH5 可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，敲低miR-21 可阻斷ALKBH5 pcDNA3.1 和FOXO3shRNA 的聯(lián)合作用，而SPRY2 shRNA 則可以逆轉(zhuǎn)這種作用；而在卵巢癌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)[11]，敲低SPRY2可挽救GAS5 對(duì)A2780 細(xì)胞增殖的抑制作用；表明SPRY2 可影響細(xì)胞生長，為調(diào)控癌細(xì)胞增殖的關(guān)鍵mRNA。

SPRY2 本身不僅可有效調(diào)控細(xì)胞增殖，而且其增殖能力還具有特異性[12]。在Sprouty 家族中，SPRY2 和SPRY4 對(duì)細(xì)胞增殖的影響存在差異[13]：在骨肉瘤SPRY2 和SPRY4 蛋白水平低內(nèi)源性細(xì)胞系U2OS 細(xì)胞中，SPRY4 異位表達(dá)10 d 后測量的細(xì)胞克隆數(shù)量并沒有減少，而SPRY2 表達(dá)使U2OS 細(xì)胞的克隆量減半；與SPRY4 比較，過表達(dá)的SPRY2 對(duì)U2OS 細(xì)胞在96 h 內(nèi)并沒有翻兩番，而對(duì)照細(xì)胞幾乎翻了兩番。同樣，在野生型小鼠中[14]，SPRY2 在產(chǎn)前第18 天在脛骨的所有細(xì)胞類型中大量表達(dá)；表明SPRY2 對(duì)細(xì)胞增殖具有明顯的特異性。

2.2 細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡表現(xiàn)多基因（Bcl-2 家族、caspase 家族[15]等）嚴(yán)格控制的過程，該過程的紊亂可能與許多疾病的發(fā)生有直接或間接的關(guān)系，但具體過程及確切機(jī)制尚不完全清楚。敲除SPRY2 可調(diào)控ERK 信號(hào)，增加促M(fèi)APK 的活性，而MAPK 可促進(jìn)凋亡Bcl-2 家族成員Bad 和Bim 的去磷酸化，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致黑色素瘤細(xì)胞死亡[16]。在胰腺癌細(xì)胞中，沉默SPRY2 可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞從G0/G1期向S 期的轉(zhuǎn)變，減少凋亡細(xì)胞的數(shù)量；過表達(dá)SPRY2 對(duì)MIA PaCa-2 細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)展和凋亡具有相反的影響[17]。為確定SPRY2對(duì)細(xì)胞凋亡的作用，蛋白質(zhì)印跡法分析顯示，敲低SPRY2 導(dǎo)致Bax 和裂解半胱天冬酶3 的蛋白表達(dá)降低，而Bcl-2 蛋白表達(dá)增加，抑制細(xì)胞凋亡[18]。上述研究表明，SPRY2 在高水平表達(dá)時(shí)具有抗凋亡功能。

2.3 細(xì)胞遷移

細(xì)胞遷移逐漸成為當(dāng)前細(xì)胞生物學(xué)研究的熱點(diǎn)，可作為認(rèn)識(shí)相關(guān)疾病機(jī)制的另一條新線索。為明確SPRY2 對(duì)細(xì)胞遷移的調(diào)控作用，在肝癌干細(xì)胞中，miR-22-3p 降低了SPRY2 的泛素化并使其穩(wěn)定，可抑制肝癌干細(xì)胞遷移和侵襲[19]；在成纖維樣滑膜細(xì)胞中，過表達(dá)SPRY2 可有效抑制成纖維樣滑膜細(xì)胞的遷移和侵襲，降低了炎癥因子[20]。為進(jìn)一步了解SPRY2 對(duì)細(xì)胞遷移的特異性，分別用SPRY2 和SPRY4兩種腺病毒感染高內(nèi)源性SPRY 蛋白水平的骨肉瘤MG63 細(xì)胞系，并在感染后48 h 進(jìn)行劃痕測定，發(fā)現(xiàn)當(dāng)僅SPRY2 過表達(dá)時(shí)，間隙縮小的時(shí)間顯著延遲，過表達(dá)SPRY2 可調(diào)控細(xì)胞遷移（1 h 內(nèi)）覆蓋12 μm 的距離，而對(duì)照處理的細(xì)胞移動(dòng)速度快約1.3 倍；而過表達(dá)SPRY4 不僅增加間隙閉合的速度，還起到非抑制作用[21]。另外在胰腺導(dǎo)管腺癌中發(fā)現(xiàn)[22]，SPRY2 可有效調(diào)控胰腺導(dǎo)管腺癌PANC-1 和SW1990 兩種細(xì)胞系的遷移速度；同時(shí)經(jīng)跨孔遷移和侵襲試驗(yàn)表明，敲除SPRY2 后細(xì)胞侵襲數(shù)量明顯增加，而過表達(dá)SPRY2 可顯著抑制兩種細(xì)胞系的遷移和侵襲能力；這表明SPRY2 為調(diào)節(jié)胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞中的遷移能力關(guān)鍵mRNA。

2.4 細(xì)胞侵襲

細(xì)胞侵襲是正常細(xì)胞和癌細(xì)胞應(yīng)對(duì)化學(xué)和機(jī)械刺激的反應(yīng)，又稱為細(xì)胞吞噬。SPRY2 作為MAPK 信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)劑，在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞侵襲中起著關(guān)鍵作用[23]。一項(xiàng)在體研究中發(fā)現(xiàn)，SPRY2 作為肝內(nèi)膽管癌侵襲的腫瘤抑制因子，F(xiàn)GF1 刺激可顯著增加FGF 受體2 表達(dá)正常的腫瘤侵襲，但當(dāng)FGF 受體2 被敲低時(shí)，HuCCT-1 細(xì)胞的侵襲減少，當(dāng)SPRY2 被敲低時(shí)增加[24]。為了證實(shí)細(xì)胞遷移和侵襲的影響是否由SPRY2 介導(dǎo)，利用HepG2 模擬細(xì)胞，HepG2 過表達(dá)miR-22-3p細(xì)胞和HepG2 過表達(dá)miR-22-3p/SPRY2 敲低細(xì)胞的Transwell 遷移測定和基質(zhì)凝膠侵襲測，表明SPRY2 可有效調(diào)節(jié)細(xì)胞侵襲[25]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，將SPRY2 的載體引入A549-CUG2 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SPRY2 可抑制CUG2 誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移和侵襲[26]；而沉默SPRY2 可升高M(jìn)CF7 細(xì)胞中金屬蛋白酶水平，使細(xì)胞的侵襲能力明顯增強(qiáng)[27]。

2.5 細(xì)胞自噬

自噬作為細(xì)胞的一種自我保護(hù)機(jī)制，在真核細(xì)胞中廣泛存在，作為調(diào)節(jié)細(xì)胞生存和死亡的關(guān)鍵因素。細(xì)胞自噬基因突變會(huì)導(dǎo)致疾病，尤其是在腫瘤、炎癥及神經(jīng)系統(tǒng)等疾病[28]。有研究將miR-122 Agomir 轉(zhuǎn)染到氧葡萄剝奪誘導(dǎo)的小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞系N2a 中，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-122 可下調(diào)SPRY2 活力，降低N2a 細(xì)胞的細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期停滯和自噬；同時(shí)，觀察到S期細(xì)胞數(shù)量升高，用miR-122 Agomir 進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析以評(píng)估細(xì)胞凋亡（Bax 和活性半胱天冬酶-3）和自噬相關(guān)蛋白（Beclin-2 和LC3B-Ⅱ），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用miR-122 Agomir 轉(zhuǎn)染后氧葡萄剝奪處理的N2a 細(xì)胞中Bax、活性半胱天冬酶-3、Beclin-2 和LC3B-Ⅱ的表達(dá)下降，提示低表達(dá)SPRY2 能夠抑制細(xì)胞自噬，加重缺血性卒中的神經(jīng)損傷[29]；同樣，敲低SPRY2 可消除miR-22-3p 對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用[19]。因此，SPRY2 有望成為研究細(xì)胞自噬的熱點(diǎn)。

2.6 EMT

EMT 是指上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程，而通過EMT，可獲得較高的遷移與侵襲、抗凋亡和降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力等間質(zhì)表型。某些炎癥細(xì)胞來源的細(xì)胞因子，特別是轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factorβ，TGFβ）的表達(dá)升高，參與EMT，導(dǎo)致多種纖維化疾病的發(fā)病機(jī)制，而SPRY2 對(duì)TGFβ 信號(hào)具有負(fù)調(diào)控作用。為了進(jìn)一步剖析SPRY2 如何調(diào)節(jié)TGFβ2誘導(dǎo)的EMT 和遷移的機(jī)制，在晶狀體上皮細(xì)胞中檢測ERK1/2 的磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)它們分別參與規(guī)范和非規(guī)范TGFβ 信號(hào)通路的激活，表明SPRY2 通過抑制ERK1/2 磷酸化[30]來抑制TGFβ 信號(hào)傳導(dǎo)；另外，SPRY2 還可通過甲基化[31]增加了結(jié)直腸癌的癌癥表型和EMT。Liu 等[32]研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SPRY2 可抑制miR-23b 表達(dá)，從而促進(jìn)晶狀體上皮細(xì)胞的遷移和EMT。因此，SPRY2 對(duì)EMT 起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。

2.7 血管生成

血管生成作為疾病的發(fā)展轉(zhuǎn)移過程的重要因素，其機(jī)制復(fù)雜，且參與并促進(jìn)血管生成的因子也眾多。SPRYT 蛋白的N’端區(qū)域是高度發(fā)散的，除了果蠅和哺乳動(dòng)物蛋白之間相似的兩個(gè)小區(qū)域。其中一個(gè)區(qū)域已被證明與泛素連接酶c-Cbl 結(jié)合，泛素連接酶c-Cbl 是RTK 信號(hào)傳導(dǎo)的已知負(fù)調(diào)節(jié)劑。c-Cbl 介導(dǎo)表皮生長因子受體、血小板衍生生長因子受體和集落刺激因子1 受體等多重泛素化，從而靶向通過蛋白酶體/溶酶體途徑降解[33-34]。SPRY2 作為膜錨定蛋白，可負(fù)調(diào)節(jié)血管生成相關(guān)RTKs 信號(hào)傳導(dǎo)并抑制血管生成，過表達(dá)SPRY2 可抑制FGF2 和血管內(nèi)皮生長因子誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖和分化[35]。在外泌體miR-21靶向SPRY2 的研究中，證實(shí)miR-21/SPRY2 軸在正常血管上皮細(xì)胞生成和上皮表型調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用[36]。

3 展望

SPRY2 作為一個(gè)雙抑制因子，廣泛表達(dá)在多種組織中，屬于Sprouty 家族的蛋白質(zhì)。該蛋白間接參與非細(xì)胞自主抑制作用對(duì)成纖維細(xì)胞生長因子的信號(hào)傳導(dǎo)；與Cas-Br-M（小鼠）外向逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)化序列相互作用，可作為EGF/MAPK 信號(hào)傳導(dǎo)的雙峰調(diào)節(jié)劑。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)SPRY2 可以抑制癌細(xì)胞惡性行為的核心細(xì)胞功能，包括細(xì)胞增殖、分化、遷移和侵襲。還與甲基化、泛素化關(guān)系密切。最近，細(xì)胞表型在規(guī)模、分辨率和通量方面進(jìn)行了大規(guī)模的改革，這歸因于成像細(xì)胞。

SPRY2 作為MAPK 信號(hào)通路的重要抑制因子，發(fā)揮著抑制細(xì)胞增殖、分化及遷移等生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)，SPRY2 可作為一種抑癌基因分子，在多種癌癥中得以證實(shí)，如前列腺癌、乳腺癌、肝細(xì)胞癌和肺癌等腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)被明顯抑制，從而使得RTKs 等信號(hào)通路逃避抑制而被過度激活，造成腫瘤細(xì)胞異常增殖，從而促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。當(dāng)SPRY2 高表達(dá)時(shí)，能夠顯著地抑制細(xì)胞的增殖、生長和遷移。并且，SPRY2 還能夠明顯地促進(jìn)細(xì)胞黏附、伸展。SPRY蛋白也被證實(shí)能夠與某些膜蛋白，如Cav-l，發(fā)生直接的相互作用，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)其抑制細(xì)胞增殖、遷移等生物學(xué)效應(yīng)。

檢測細(xì)胞的表型，可以幫助了解相關(guān)基因、蛋白、藥物的機(jī)制，是科學(xué)研究不可或缺的手段。而SPRY2參與多種細(xì)胞表型，作為一種關(guān)鍵的mRNA，值得去挖掘深究。