魚油來源的棕櫚油酸對神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活研究

楊衍卓，郁清婷，項(xiàng) 璐，楊最素，袁法磊

（1.浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 舟山 316022；2.鄂爾多斯市東勝區(qū)市場監(jiān)督管理局，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017000）

棕櫚酸（Palmitic acid，PA）是人體中最豐富的脂肪酸，在正常血液中PA 濃度為（122±48）μmol/L［1］。PA 在肥胖、非酒精性脂肪肝、動(dòng)脈粥樣硬化等多種代謝性疾病中高表達(dá)，有研究顯示阿爾茨海默癥患者大腦皮層的PA 水平顯著升高［2］。棕櫚油酸（Palmitoleic acid，POA）是一種十六碳的Omega-7 單不飽和脂肪酸。PA 在硬脂酰輔酶A 去飽和酶1 的作用下能夠轉(zhuǎn)化為POA［3］。正常人體血液中的POA濃度維持在50 μmol/L 以內(nèi)［4］。PA 和POA 的生理功能均不明確，而PA 被認(rèn)為是一種有害飽和脂肪酸［5］。2008 年，Cao 等［6］研究發(fā)現(xiàn)POA 是一種調(diào)節(jié)胰島素作用和肝臟代謝的脂質(zhì)因子（Lipokine）。后續(xù)研究顯示POA 作為膳食補(bǔ)充劑能夠有效降低超敏C 反應(yīng)蛋白而具有抗炎作用，同時(shí)能夠治療胰島素抵抗［7，8］。與POA 相關(guān)的膳食補(bǔ)充劑產(chǎn)品主要位于歐美市場，其原料來自沙棘果油或魚油，沙棘果油中含天然甘油酯型的POA，占總脂肪酸含量的30%～40%，但是沙棘果油來源的POA 原料價(jià)格高、產(chǎn)量少、受采摘季節(jié)限制。魚油來源的POA 是Omega-3 精制魚油的副產(chǎn)物，每生產(chǎn)1 t治療高血脂癥的處方藥Lovaza，產(chǎn)生1 t POA 含量約為15% 的生物柴油。此類生物柴油大部分都被當(dāng)作清潔能源燒掉，因此魚油中的POA 有很大的市場開發(fā)價(jià)值。高純度的POA 產(chǎn)品只有色譜標(biāo)準(zhǔn)品，售價(jià)高且產(chǎn)量有限。POA 因?yàn)榕cPA 分子量接近，常規(guī)的分離手段如分子蒸餾等無法有效分離，因此，魚油POA 產(chǎn)品需要多次尿素包合法才能將含量提高至50%。除了制備級液相色譜可制取高純度POA 作為標(biāo)準(zhǔn)品外，還沒有工業(yè)化的方法能夠?qū)OA 含量提高至60%。

下丘腦主要功能是調(diào)控體溫、體液平衡以及代謝［9］。小膠質(zhì)細(xì)胞是位于大腦中的一類巨噬細(xì)胞，主要功能為吞噬凋亡或者壞死后形成的細(xì)胞碎片，同時(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞本身被激活或損傷死亡后能夠釋放炎癥因子，對周圍健康組織起到預(yù)警作用［10］。小膠質(zhì)細(xì)胞通常表達(dá)Iba-1、CD11b、CD68 等蛋白，其中Iba-1 是較為特異的小膠質(zhì)細(xì)胞蛋白，可以通過Iba-1 的表達(dá)量來判斷小膠質(zhì)細(xì)胞的激活［11］。小膠質(zhì)細(xì)胞在受損后具有很強(qiáng)的自我更新能力，用特異性的抑制劑清除99%小膠質(zhì)細(xì)胞后能在一周時(shí)間內(nèi)全部恢復(fù)［12］。星形膠質(zhì)細(xì)胞接收激活或者死亡后的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的信號(hào)成為反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞，GFAP 是使用最廣的區(qū)分反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的蛋白［13］。最新研究表明，神經(jīng)元是被激活后的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞通過分泌長鏈飽和脂肪酸所殺死［14］，這提示在研究涉及神經(jīng)元死亡的退行性疾病如阿爾茨海默癥和飲食相關(guān)引起的下丘腦代謝紊亂時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞被激活的因素分析至關(guān)重要。高脂飲食會(huì)激活下丘腦小膠質(zhì)細(xì)胞，引起一系列炎癥性反應(yīng)包括下丘腦功能的失調(diào)。高脂飲食同時(shí)含有大量飽和脂肪酸如PA 和不飽和脂肪酸如油酸和POA，單一脂肪酸成分的功效和生理作用很難通過高脂飲食來研究，因此高脂飲食引起的下丘腦功能的失調(diào)機(jī)制尚不明確。

本研究通過體外細(xì)胞模型單獨(dú)分析PA 和POA對小膠質(zhì)細(xì)胞的損傷，然后制備高純度POA 用于動(dòng)物試驗(yàn)，并通過與PA 對比來研究POA 對神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級6～8 周齡ICR 雄性小鼠24只，體重（30.0±1.5）g，來源于杭州子源實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司［SCXK（浙）2019-0004］。動(dòng)物飼養(yǎng)以及試驗(yàn)在浙江海洋大學(xué)SPF 動(dòng)物房［SYXK（浙）2019-0031］。本研究經(jīng)浙江海洋大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2021-026），所有動(dòng)物試驗(yàn)均符合3R 指導(dǎo)原則。

1.1.2 細(xì)胞系 小鼠BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞（湖南豐暉生物科技有限公司）；Omega-7 魚油膠囊（美國Life Extension）。

1.1.3 試劑與設(shè)備DMEM 高糖培養(yǎng)基（PM150210）；0.25%胰蛋白酶（PB180228）；青霉素-鏈霉素溶液（PB180120）均由武漢普諾賽生命科技有限公司購買；無脂肪酸，低內(nèi)毒素-牛血清白蛋白（BSA，AS33654，浙江聯(lián)碩創(chuàng)先生物科技有限公司）；BI 胎牛血清（04-001-1ACS，以色列Biological Industries）；棕櫚酸鈉（S161420，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；棕櫚油酸（P111106，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；CCK-8 細(xì)胞增殖與毒性檢測試劑盒（#K1018，美國APE x BIO 生物科技有限公司）；碘化丙啶（PI）試劑盒（C1075，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；TUNEL 凋亡檢測試劑盒（MK1027，武漢博士德生物工程有限公司）；石蠟切片機(jī)（RM2135，德國徠卡公司）

1.2 方法

1.2.1 脂肪酸與BSA 復(fù)合物溶液的配制 在70 ℃水浴制備溶于蒸餾水的50 mmol/L PA 儲(chǔ)備液，200 mmol/L 的POA 儲(chǔ)備液用乙醇配制。然后將PA和POA 儲(chǔ)備液分別稀釋至2 mmol/L 和1 mmol/L，加入到37 ℃預(yù)熱的BSA 溶液中（控制脂肪酸與BSA 摩爾比為5∶1），并在37 ℃下孵育1 h，使脂肪酸與BSA充分結(jié)合。脂肪酸-BSA 復(fù)合物溶液用DMEM 稀釋并通過0.22 μm 濾膜過濾除菌。

1.2.2 細(xì)胞活力測定 細(xì)胞以2×104個(gè)/孔密度接種于96 孔板，待細(xì)胞貼壁完全，用含有BSA（對照），0、50、100、200、300 μmol/L PA，或0、50、100、200、400、500 μmol/L POA 的無血清培養(yǎng)基代替原培養(yǎng)基處理24 h。然后每孔加入占培養(yǎng)基10%體積的CCK-8 溶液37 ℃孵育2 h，用酶標(biāo)儀（SpectraMa，美國Molecular Devices）檢測波長490 nm 處的吸光值。

1.2.3 PI與TUNEL 檢測 小鼠BV-2 細(xì)胞系在條件為37 ℃和5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。完全培養(yǎng)基為高糖DMEM 培養(yǎng)基添加10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素溶液。細(xì)胞鋪滿24 孔培養(yǎng)板70%～80%時(shí)進(jìn)行給藥處理。用含有BSA（對照）、PA（200 μmol/L）或POA（200 μmol/L）的無血清培養(yǎng)基代替原培養(yǎng)基處理4 h 后進(jìn)行PI 染色。用與上述相同的處理方式處理細(xì)胞24 h 后按試劑盒說明書進(jìn)行TUNEL 檢測。PI 染色以及TUNEL 染色后進(jìn)行DAPI 復(fù)染細(xì)胞核，在熒光顯微鏡（OLYMPUS BX41，日本奧林巴斯株式會(huì)社）下觀察拍照。

1.2.4 負(fù)載結(jié)晶尿素硅膠柱分離純化魚油膠囊中棕櫚油酸乙酯 負(fù)載結(jié)晶尿素硅膠柱的制備：稱取40 g 的尿素溶解在95%乙醇中，在攪拌下加入60 g 200 目的硅膠充分混合后，真空旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑，得到柱層析固定相。稱取一定量柱層析固定相放入石油醚中，濕法裝入玻璃管柱（20 mm×600 mm）中，制備成負(fù)載結(jié)晶尿素硅膠色譜柱。

以石油醚和乙酸乙酯（V/V）（300∶1）為洗脫劑，取魚油樣品加洗脫劑溶解后上樣3 mL，控制流速1 mL/min 洗脫，每10 mL 收集一個(gè)洗脫份。對洗脫份進(jìn)行氣相色譜（安捷倫-7890A，美國安捷倫科技公司）分析，用面積歸一化法確定棕櫚油酸的含量。1.2.5 動(dòng)物免疫組織化學(xué)染色 將ICR 小鼠隨機(jī)分成3 組，每組8 只，在正常飲食的情況下給予BSA（對照）、PA（300 mg/kg）、POA（300 mg/kg）灌胃持續(xù)2周。小鼠經(jīng)心臟灌注鹽水和多聚甲醛后取腦，石蠟包埋后切片。小鼠腦組織石蠟切片經(jīng)脫蠟和復(fù)水后，使用檸檬酸鈉-EDTA 抗原修復(fù)液（P0086，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）抗原修復(fù)后，分別添加如下一抗：Iba-1 抗體（019-19741，日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社）；Ki67 抗體（12202T，美國Cell Signaling Technology）；GFAP 抗體［D262817，生工生物工程（上海）股份有限公司］；髓鞘堿性蛋白（MBP）抗體（78896，美國Cell Signaling Technology）。室溫孵育2 h，PBS 洗去一抗后，加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)多聚物二抗（PR30009，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）室溫孵育1 h 后，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，水性封片劑封片后在光學(xué)顯微鏡下拍照獲取圖片。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果采用Image J 軟件進(jìn)行分析。免疫組織化學(xué)染色定量分析采用陽性細(xì)胞或陽性區(qū)域與總區(qū)域像素比值為定量依據(jù)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，有至少3 次平行重復(fù)試驗(yàn)，數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行單因素方差分析，并采用Tukey’s 多重檢驗(yàn)進(jìn)行組間顯著性分析，P＜0.05 表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 POA 給藥濃度小于200 μmol/L 未造成小膠質(zhì)細(xì)胞死亡，而PA 引發(fā)大量焦亡和少量凋亡

PA 濃度在100 μmol/L 以下時(shí)對BV-2 細(xì)胞活力無明顯影響。150、200、300 μmol/L PA 處理細(xì)胞24 h細(xì)胞活力下降19.3%、50.0%、70.0%（圖1a）。50、100、200 μmol/L POA 處理細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞活力分別提高了3.7%、6.3%和2.8%。但是，當(dāng)POA 濃度達(dá)400、500 μmol/L時(shí)，細(xì)胞活力分別下降了13.4%和17.7%（P＜0.05）（圖1b）。這些結(jié)果表明，POA濃度在200 μmol/L以下時(shí)，對BV-2 細(xì)胞活力沒有顯著影響。

圖1 PA 和POA 處理小膠質(zhì)細(xì)胞后活力與PI陽性細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)

200 μmol/L PA 和POA 處理小膠質(zhì)細(xì)胞4 h 后，對細(xì)胞進(jìn)行PI 染色。BSA、PA 和POA 組細(xì)胞PI 陽性細(xì)胞占比分別為0.8%±0.3%、13.0%±0.9% 和0.9%±0.3%（圖1c）。該結(jié)果表明，PA 處理小膠質(zhì)細(xì)胞后會(huì)導(dǎo)致焦亡，而POA 處理BV-2 細(xì)胞4 h 并不會(huì)引起細(xì)胞焦亡。由于凋亡通常發(fā)生較慢，因此用200 μmol/L PA 和POA 處理小膠質(zhì)細(xì)胞24 h 后，對細(xì)胞進(jìn)行TUNEL 染色。PA 組TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)量顯著高于對照組（BSA）和POA 組（P＜0.05），而POA處理后未見有TUNEL 陽性細(xì)胞增多（圖2）。

圖2 PA 和POA 處理小膠質(zhì)細(xì)胞后PI與TUNEL 染色

2.2 尿素硅膠柱色譜法分離純化可獲得高純度棕櫚油酸乙酯

在前期篩選并優(yōu)化了負(fù)載尿素結(jié)晶硅膠柱色譜條件后，以柱長40 cm，流速1 mL/min，石油醚∶乙酸乙酯（V/V）300∶1，尿素硅膠質(zhì)量比2∶3，硅膠目數(shù)200 目為最終柱色譜條件。洗脫收集組分經(jīng)氣相色譜檢測后主要組分含量如表1 所示，最終以峰面積為定量依據(jù)，得到棕櫚油酸乙酯含量為72.3%，收率為35.0%。相較于魚油膠囊（棕櫚油酸乙酯含量50.5%，棕櫚酸乙酯含量9.3%），經(jīng)尿素結(jié)晶硅膠柱分離純化后，棕櫚油酸乙酯純度提高了21.8 個(gè)百分點(diǎn)，而棕櫚酸乙酯含量下降了3.7 個(gè)百分點(diǎn)（圖3，表1）。經(jīng)氣相色譜分析后的產(chǎn)物用于進(jìn)一步飼喂動(dòng)物。

表1 魚油膠囊經(jīng)尿素硅膠柱純化后棕櫚酸乙酯和棕櫚油酸乙酯含量對比（單位：%）

圖3 純化后棕櫚油酸乙酯的脂肪酸組分氣相色譜分布

2.3 POA 對小鼠下丘腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞無明顯影響，而PA 同時(shí)激活小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞

小鼠經(jīng)PA 和純化后POA 灌胃2 周后，取腦組織進(jìn)行石蠟包埋、切片，免疫組織化學(xué)染色分析Iba-1、GFAP、Ki67（圖4）。PA 組下丘腦Iba-1 陽性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量比對照組多45.6%（P＜0.05），且形態(tài)多為有觸角的激活態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞。而POA 處理組則未見顯著的小膠質(zhì)細(xì)胞增多與形態(tài)學(xué)上的變化（圖4，圖5a）。PA 組下丘腦GFAP 陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞比對照組多75.0%（P＜0.05），形態(tài)上多為胞體肥大的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞。POA 處理組則未見顯著的星形膠質(zhì)細(xì)胞增多與形態(tài)學(xué)上的變化（圖4，圖5b）。但是，PA 喂食組以及POA 喂食組中下丘腦細(xì)胞增殖標(biāo)記物Ki67 相較于對照組未見顯著增多（圖4，圖5c）。

圖4 小鼠下丘腦免疫組織化學(xué)染色

圖5 小鼠下丘腦免疫組織化學(xué)染色陽性細(xì)胞占比統(tǒng)計(jì)

2.4 棕櫚酸和棕櫚油酸均可以刺激小鼠下丘腦髓鞘合成

髓鞘堿性蛋白（MBP）是一種含有多種堿性氨基酸能維持CNS 髓鞘結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定的強(qiáng)堿性膜蛋白質(zhì)。圖6 顯示，相較于對照組，PA 和POA 喂食2 周均能增加下丘腦MBP的表達(dá)。MBP陽性區(qū)域占比統(tǒng)計(jì)如圖7 所示，PA 喂食組比對照組小鼠下丘腦MBP陽性區(qū)域占比增加了36.6%（P＜0.001），POA喂食組比對照組MBP陽性區(qū)域占比增加了18.1%（P＜0.01）。

圖6 小鼠下丘腦MBP 免疫組織化學(xué)染色

圖7 小鼠下丘腦MBP 免疫組織化學(xué)染色陽性細(xì)胞占比統(tǒng)計(jì)

3 討論

本研究通過PI和TUNEL 染色發(fā)現(xiàn)PA 導(dǎo)致的死亡主要是焦亡和凋亡，而POA 不引起焦亡或凋亡。同時(shí)探索了一種經(jīng)濟(jì)地制備高純度POA 的方法。飲食中的PA 能夠激活小鼠下丘腦小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，POA 則不激活小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。PA 和POA 能夠促進(jìn)小鼠下丘腦MBP 表達(dá)，這表明PA 和POA 都能增強(qiáng)少突膠質(zhì)細(xì)胞的髓鞘化作用。

少突膠質(zhì)細(xì)胞的主要功能是形成髓鞘包裹神經(jīng)元，增加神經(jīng)傳導(dǎo)效率。髓鞘是非常穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，有報(bào)道顯示，超過5 000 年的冰凍樣本髓鞘還非常完整［15］，這得益于髓鞘的特殊脂肪酸組成結(jié)構(gòu)，髓鞘的飽和脂肪酸含量高，不飽和脂肪酸僅約占4%，而灰質(zhì)中的不飽和脂肪酸則約占20%［16］。推測外周環(huán)境中的飽和脂肪酸能夠直接刺激MBP 的合成，而POA 能夠在硬脂酰輔酶A 去飽和酶1 的作用下部分轉(zhuǎn)化為PA，從而促進(jìn)MBP 合成。通過免疫組化分析觀察到PA 能夠同時(shí)促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活和增殖，但是增殖蛋白標(biāo)記的Ki67 陽性細(xì)胞數(shù)量卻未見顯著增多，這可能是因?yàn)镵i67 是分析動(dòng)物組織被固定瞬間的增殖細(xì)胞數(shù)量，后續(xù)試驗(yàn)考慮在飲水中添加BrdU 或腹腔注射BrdU的方法來分析長時(shí)間的細(xì)胞增殖情況［17］。

檢測細(xì)胞死亡的常用染料PI 通常被用于檢測細(xì)胞凋亡，但是PI 實(shí)際上首先檢測的是能夠在細(xì)胞膜上打孔的細(xì)胞壞死方式，因此PI 被認(rèn)為能夠快速準(zhǔn)確判斷細(xì)胞是否發(fā)生了焦亡［18，19］。焦亡是非常急性的一種壞死方式，通常外界刺激發(fā)生2 h 后就引起明顯焦亡，而凋亡作為一種無菌性的死亡方式通常先發(fā)生染色質(zhì)皺縮，細(xì)胞膜外翻［20］。

采用制備液相色譜因?yàn)樘盍铣杀靖撸a(chǎn)品附加值相對較低，難以產(chǎn)業(yè)化。本研究采用的尿素柱色譜作為一種簡單、經(jīng)濟(jì)的方法可被推廣用于制備高純度的POA。本研究中使用了石油醚作為洗脫溶劑，后續(xù)工業(yè)放大過程中可考慮選用食品加工助劑己烷替代石油醚，己烷作為食用油的浸出溶劑已獲廣泛應(yīng)用。后續(xù)研究將嘗試通過將POA 和PA 同時(shí)喂食的方式來確定POA 是否能夠保護(hù)PA 對下丘腦膠質(zhì)細(xì)胞的激活作用，并分析其作用機(jī)制。