乳腺癌患者血清CCL8、CCL21水平與保乳術(shù)后局部復(fù)發(fā)的關(guān)系

劉臻臻，宋遠(yuǎn)鵬，何英，張雪琳，鄭小東，弋文，杜果城

南充市中心醫(yī)院甲狀腺乳腺血管外科，四川南充 637000

乳腺癌是常見的女性惡性腫瘤，其發(fā)病率位居女性惡性腫瘤之首，并且有不斷升高的趨勢［1］。目前，乳腺癌的治療以手術(shù)、放化療等綜合治療為主。保乳手術(shù)是治療乳腺癌常用的手術(shù)方式，具有較高的安全性和有效性，且能減少傳統(tǒng)手術(shù)對患者心理的負(fù)面影響。但由于術(shù)前評估不準(zhǔn)確及術(shù)中淋巴結(jié)清掃不徹底等因素，部分患者行保乳術(shù)后會發(fā)生局部復(fù)發(fā)［2］。因此，尋找保乳術(shù)后復(fù)發(fā)的危險因素具有重要臨床意義。CC 趨化因子配體8（CCL8）及CCL21為趨化因子CC亞家族成員，參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)和炎癥過程［3］。CCL8 能夠趨化單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞，促進(jìn)乳腺組織中免疫抑制性M2 型巨噬細(xì)胞浸潤及乳腺腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移［4］。CCL21 是一種主要趨化胸腺細(xì)胞和活化T 淋巴細(xì)胞的趨化因子，研究顯示，乳腺組織中CCL21 能夠通過結(jié)合調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞表面的CC趨化因子受體7（CCR7）抑制機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)，促進(jìn)乳腺腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移及血管生成［5］。但CCL8、CCL21 水平與乳腺癌患者臨床病理特征及保乳術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系尚不清楚。本研究通過檢測乳腺癌患者血清CCL8、CCL21 水平，分析兩者與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系并探討保乳術(shù)后局部復(fù)發(fā)的影響因素，旨在為乳腺癌患者保乳術(shù)后局部復(fù)發(fā)的早期預(yù)測提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 經(jīng)南充市中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（20140103005），選取2014年2月—2018年1月在本院行保乳術(shù)治療的乳腺癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合保乳術(shù)手術(shù)指征并有保乳意愿，實(shí)施乳腺癌保乳術(shù)；②經(jīng)術(shù)后病理組織檢查確診為乳腺癌；③初次診治，入院前未進(jìn)行手術(shù)及放化療治療；④臨床資料完整；⑤患者及家屬均知情同意并且簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①非原發(fā)性乳腺癌或存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；②病變廣泛，難以達(dá)到切緣陰性或理想保乳外形；③存在彌漫分布的惡性特征鈣化灶；④合并其他惡性腫瘤；⑤術(shù)后未在我院進(jìn)行規(guī)范化治療；⑥合并精神障礙性疾病；⑦不能配合治療及隨訪。共收集符合上述標(biāo)準(zhǔn)的乳腺癌患者581 例作為乳腺癌組，另選取同期體檢的健康女性124 例作為對照組。乳腺癌組年齡（42.17 ± 10.25）歲，病理類型浸潤性非特殊癌447例、非浸潤性癌78例、浸潤性特殊癌56例；腫瘤最大直徑≤2 cm 377 例、＞2 cm 204 例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移67 例，腫瘤TNM 分期Ⅰ期367 例、Ⅱ期214 例，組織學(xué)分級Ⅰ級99例、Ⅱ級240例、Ⅲ級242例，雌激素受體（ER）陽性238例，孕激素受體（PR）陽性321例，人表皮生長因子受體2（HER-2）陽性66 例。對照組年齡（43.04 ± 9.57）歲。兩組年齡具有可比性。

1.2 血清CCL8、CCL21 檢測方法 采用ELISA 法。術(shù)前留取兩組清晨空腹靜脈血4 mL，2 500 r/min 離心15 min，離心半徑10 cm。ELISA 法檢測血清CCL8、CCL21（人CCL8 ELISA 檢測試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司，人CCL21 ELISA 檢測試劑盒購自上海信裕生物科技有限公司），檢測步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 術(shù)后隨訪及局部復(fù)發(fā)判定方法 術(shù)后隨訪5 年，以門診或電話方式進(jìn)行復(fù)查隨訪。術(shù)后第1年每3月隨訪1次，第2年每6月隨訪1次，第3～5年每年隨訪1 次。隨訪內(nèi)容為常規(guī)體格檢查、乳腺鉬靶X 線檢查、B 超、核磁共振、血清腫瘤標(biāo)志物等。隨訪截止日期為2023 年1 月，隨訪終點(diǎn)為出現(xiàn)腫瘤局部復(fù)發(fā)或隨訪時間結(jié)束。局部復(fù)發(fā)定義為腫瘤治療措施所涉及范圍內(nèi)（手術(shù)及放療）的腫瘤復(fù)發(fā)，同時經(jīng)穿刺活檢或腫塊手術(shù)切除后病理組織學(xué)明確診斷［6］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用Shapiro-Wilk 進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以-x±s表示，兩組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較行單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，組間比較行χ2檢驗(yàn)；比較保乳術(shù)后發(fā)生與未發(fā)生局部復(fù)發(fā)的乳腺癌患者臨床資料，取有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的臨床資料進(jìn)一步納入多因素Logistic 回歸分析。采用多因素Logistic 回歸分析乳腺癌患者保乳術(shù)后局部復(fù)發(fā)的影響因素，并通過繪制受試者工作特征（ROC）曲線分析血清CCL8、CCL21 對乳腺癌患者保乳術(shù)后局部復(fù)發(fā)的預(yù)測效能。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清CCL8、CCL21 水平比較 乳腺癌組、對照組血清CCL8 水平分別為（296.33 ± 61.73）、（220.54 ± 46.89）ng/L，血清CCL21 水平分別為（315.61 ± 35.99）、（201.31 ± 36.75）ng/L，乳腺癌組血清CCL8、CCL21 水平均高于對照組（P均＜0.05）。

2.2 不同臨床病理特征乳腺癌患者血清CCL8、CCL21 水平比較 TNM 分期Ⅱ期、腫瘤最大徑＞2 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者血清CCL8、CCL21 水平高于TNM 分期Ⅰ期、腫瘤最大徑≤2 cm、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者（P均＜0.05）；不同年齡、家族史、病理類型、組織學(xué)分級、ER 狀態(tài)、PR 狀態(tài)、HER-2 狀態(tài)乳腺癌患者血清CCL8、CCL21 水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見表1。

表1 不同臨床病理特征乳腺癌患者血清CCL8、CCL21水平比較（ng/L，-x ± s）

2.3 血清CCL8、CCL21 水平與乳腺癌患者保乳術(shù)后局部復(fù)發(fā)的關(guān)系 581 例行保乳術(shù)的乳腺癌患者在隨訪中失訪3 例，隨訪5 年中發(fā)生局部復(fù)發(fā)42例、未發(fā)生局部復(fù)發(fā)536 例，局部復(fù)發(fā)率為7.27%。發(fā)生局部復(fù)發(fā)的乳腺癌患者年齡（52.43 ± 4.64）歲，有乳腺癌家族史6 例、無乳腺癌家族史36 例，病理類型為浸潤性非特殊癌28 例、非浸潤性癌8 例、浸潤性特殊癌6 例，TNM 分期Ⅰ期25 例、Ⅱ期17例，腫瘤最大徑≤2 cm 26 例、＞2 cm 16 例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20 例、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22 例，組織學(xué)分級Ⅰ級10 例、Ⅱ級12 例、Ⅲ級20 例，ER 狀態(tài)陽性18 例、陰性24 例，PR 狀態(tài)陽性18 例、陰性24 例，HER-2 狀態(tài)陽性7 例、陰性35 例，術(shù)后規(guī)范化療17 例、未規(guī)范化療25 例，術(shù)后足程放療18 例、未足程放療24 例，血清CCL8 水平（357.61 ± 66.34）ng/L，血清CCL21水平（379.35 ± 43.64）ng/L；未發(fā)生局部復(fù)發(fā)的乳腺癌患者年齡（51.71 ± 4.89）歲，有乳腺癌家族史51 例、無乳腺癌家族史485 例，病理類型為浸潤性非特殊癌417 例、非浸潤性癌69 例、浸潤性特殊癌50 例，TNM 分期Ⅰ期339 例、Ⅱ期197 例，腫瘤最大徑≤2 cm 349 例、＞2 cm 187 例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47 例、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移489 例，組織學(xué)分級Ⅰ級89 例、Ⅱ級228 例、Ⅲ級219 例，ER 狀態(tài)陽性216 例、陰性320 例，PR 狀態(tài)陽性301 例、陰性235 例，HER-2 狀態(tài)陽性58 例、陰性478 例，術(shù)后規(guī)范化療331 例、未規(guī)范化療205 例，術(shù)后足程放療366例、未足程放療170例，血清CCL8水平（291.67 ±52.78）ng/L，血清CCL21水平（310.69 ± 29.71）ng/L。發(fā)生與未發(fā)生局部復(fù)發(fā)的乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)后規(guī)范化療、術(shù)后足程放療、血清CCL8、血清CCL21 比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。以上述有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的因素為自變量，乳腺癌患者保乳術(shù)后是否發(fā)生局部復(fù)發(fā)為因變量，納入多因素Logistic 回歸分析。賦值：發(fā)生局部復(fù)發(fā)=1，未發(fā)生局部復(fù)發(fā)=0；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移=1，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移=0；術(shù)后規(guī)范化療=1、未規(guī)范化療=0；術(shù)后足程放療=1、未足程放療=0；血清CCL8、CCL21 水平位連續(xù)數(shù)值原型輸入。結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高血清CCL8、高血清CCL21 是乳腺癌患者保乳術(shù)后局部復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險因素，術(shù)后規(guī)范化療、術(shù)后足程放療是乳腺癌患者保乳術(shù)后局部復(fù)發(fā)的獨(dú)立保護(hù)因素（P均＜0.05）。見表2。

表2 乳腺癌患者保乳術(shù)后局部復(fù)發(fā)的多因素Logistic回歸分析結(jié)果

2.4 血清CCL8、CCL21 水平對乳腺癌患者保乳術(shù)后局部復(fù)發(fā)的預(yù)測效能 ROC 曲線分析結(jié)果顯示，血清CCL8、血清CCL21預(yù)測乳腺癌患者保乳術(shù)后局部復(fù)發(fā)的AUC 依次為0.726、0.727，兩項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合預(yù)測乳腺癌患者保乳術(shù)后局部復(fù)發(fā)的AUC 為0.827。見表3。

表3 血清CCL8、CCL21水平對乳腺癌患者保乳術(shù)后局部復(fù)發(fā)的預(yù)測效能

3 討論

乳腺癌異質(zhì)性較高，部分患者行保乳術(shù)后仍可能發(fā)生局部復(fù)發(fā)［2］。血清標(biāo)志物檢測具有簡便快捷、無創(chuàng)及便于連續(xù)監(jiān)測等優(yōu)點(diǎn)，在乳腺癌臨床診治及術(shù)后隨訪監(jiān)測過程中具有重要的臨床價值［7］。深入研究乳腺癌保乳術(shù)后局部復(fù)發(fā)的影響因素，尋找能夠評估術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險的血清標(biāo)志物具有重要臨床意義。

趨化因子是一類小分子量的蛋白多肽，包括CC、CXC、CX3C 及XC 四個亞家族，能夠分泌到細(xì)胞外，發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞定向遷移、控制免疫細(xì)胞趨化等生物學(xué)作用［8］。CCL8 屬于CC 趨化因子家族成員，能夠招募及活化單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞，參與機(jī)體炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)答過程［9］。近年來發(fā)現(xiàn)，腦膠質(zhì)瘤［10］、乳腺癌［4］等惡性腫瘤中存在CCL8 表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象。CCL8 可通過招募單核巨噬細(xì)胞促進(jìn)腫瘤免疫抑制微環(huán)境形成，同時促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腫瘤惡性進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌患者血清CCL8水平升高，且高TNM 分期、高腫瘤最大徑、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者血清CCL8水平高于低TNM 分期、低腫瘤最大徑、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者，提示CCL8 水平與乳腺癌不良臨床病理特征存在一定的聯(lián)系，CCL8可能參與促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。腫瘤細(xì)胞過度增殖使腫瘤微環(huán)境處于缺血、缺氧狀態(tài)，研究顯示，缺血、缺氧環(huán)境可導(dǎo)致缺氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子ZEB1 表達(dá)升高，促進(jìn)CCL8 mRNA 的轉(zhuǎn)錄，CCL8通過結(jié)合其配體CCR2招募單核巨噬細(xì)胞，從而促進(jìn)腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移［11］。此外，CCL8在乳腺癌中還能夠通過自分泌作用促進(jìn)白細(xì)胞介素（IL）-8 及基質(zhì)金屬蛋白酶2 的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展［12］。本研究中，發(fā)生局部復(fù)發(fā)的乳腺癌患者血清CCL8 水平高于未發(fā)生局部復(fù)發(fā)患者，血清CCL8＞320 ng/L 是乳腺癌患者保乳術(shù)后局部復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險因素，提示血清CCL8 水平有助于評估乳腺癌保乳術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險。分析其原因可能為CCL8 能夠促進(jìn)免疫抑制腫瘤微環(huán)境的形成［13］，促進(jìn)乳腺癌腫瘤轉(zhuǎn)移，從而增加保乳術(shù)后腫瘤局部復(fù)發(fā)風(fēng)險。另有研究發(fā)現(xiàn)，CCL8能夠促進(jìn)乳腺癌腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞向M2型極化。M2型巨噬細(xì)胞通過分泌產(chǎn)生IL-4、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對化療治療的耐藥性形成，從而降低乳腺癌患者術(shù)后化療療效，導(dǎo)致腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)［14］。

CCL21也是一種CC趨化因子，主要表達(dá)于活化T 淋巴細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞，通過結(jié)合B 淋巴細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞表面的配體CCR7 參與免疫調(diào)控及細(xì)胞骨架狀態(tài)的調(diào)節(jié)［5］。研究表明，肝細(xì)胞癌中CCL21 表達(dá)升高，其可通過促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中CD3+T 淋巴細(xì)胞及CD20+B 淋巴細(xì)胞的浸潤促進(jìn)腫瘤免疫逃逸［15］。本研究中，乳腺癌患者血清CCL21 水平升高，且高TNM 分期、高腫瘤最大徑、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等不良臨床病理特征的乳腺癌患者血清CCL21 水平更高，提示CCL21 可能參與了乳腺腫瘤的惡性進(jìn)展。分析其原因可能為，乳腺癌腫瘤微環(huán)境中TGF-β1能夠通過p38 MAPK 激酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活促進(jìn)腫瘤中CCL21 表達(dá)，CCL21 能夠結(jié)合淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞表面的CCR7，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移［16］。此外，CCL21 還能夠通過結(jié)合乳腺癌腫瘤細(xì)胞表面的CCR7 配體，促進(jìn)N-鈣黏素、波形蛋白等間質(zhì)性標(biāo)志物表達(dá)，而上皮型鈣黏素表達(dá)降低，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生，促進(jìn)腫瘤惡性侵襲和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致腫瘤惡性進(jìn)展［17］。本研究結(jié)果顯示，發(fā)生局部復(fù)發(fā)的乳腺癌患者血清CCL21 水平高于未發(fā)生局部復(fù)發(fā)患者，血清CCL21＞340 ng/L 是乳腺癌患者保乳術(shù)后局部復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險因素，提示血清CCL21水平是潛在的保乳術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險評估的血清指標(biāo)。TEITZ-TENENBAUM 等［18］報(bào)道，對CCL21 表達(dá)升高的黑色素瘤進(jìn)行局部放射治療后，腫瘤組織中樹突狀細(xì)胞不能對腫瘤抗原進(jìn)行有效的抗原提呈，腫瘤微環(huán)境內(nèi)部的效應(yīng)性CD4+及CD8+T 淋巴細(xì)胞明顯減少，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞放療抵抗的發(fā)生，進(jìn)而增加腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險。

本研究結(jié)果同時顯示，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者保乳術(shù)后局部復(fù)發(fā)風(fēng)險較高，與既往研究報(bào)道一致［19］，其原因主要是合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者一般腫瘤分期較高，病情較為嚴(yán)重，腫瘤容易發(fā)生局部侵襲及轉(zhuǎn)移，術(shù)中難以徹底切除腫瘤，進(jìn)而增加患者腫瘤術(shù)后局部復(fù)發(fā)風(fēng)險。本研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后規(guī)范化療、術(shù)后足程放療是乳腺癌患者保乳術(shù)后局部復(fù)發(fā)的獨(dú)立保護(hù)因素，提示術(shù)后規(guī)范化療、術(shù)后足程放療能夠減少術(shù)中殘留腫瘤細(xì)胞，減少腫瘤微小轉(zhuǎn)移灶的存在，降低保乳術(shù)后腫瘤局部復(fù)發(fā)風(fēng)險。

此外，本研究還進(jìn)行了血清CCL8、CCL21 水平對乳腺癌保乳術(shù)后局部復(fù)發(fā)的預(yù)測效能研究。結(jié)果顯示，血清CCL8、CCL21 水平對乳腺癌患者術(shù)后局部復(fù)發(fā)具有一定的預(yù)測效能。CCL8 和CCL21 兩指標(biāo)的聯(lián)合應(yīng)用能較好地預(yù)測和評估乳腺癌保乳術(shù)后的局部復(fù)發(fā)，有助于臨床醫(yī)師做出對高風(fēng)險患者的早期預(yù)警。

綜上所述，乳腺癌保乳術(shù)后局部復(fù)發(fā)患者血清CCL8、CCL21水平升高，兩者與TNM 分期、腫瘤最大徑及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，均參與乳腺癌腫瘤進(jìn)展。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血清CCL8 及CCL21 升高是影響乳腺癌患者保乳術(shù)后局部復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險因素，術(shù)后規(guī)范化療、術(shù)后足程放療是影響乳腺癌患者保乳術(shù)后局部復(fù)發(fā)的獨(dú)立保護(hù)因素。根據(jù)血清CCL8、CCL21水平對乳腺癌保乳術(shù)后局部復(fù)發(fā)風(fēng)險進(jìn)行評估及風(fēng)險分層，對于高?；颊哂枰苑e極治療，或許有助于改善患者臨床預(yù)后。本研究也存在不足，本研究未對保乳術(shù)后患者血清CCL8、CCL21水平的動態(tài)變化進(jìn)行監(jiān)測，且兩者在不同分子亞型乳腺癌患者中的預(yù)測價值可能存在一定的差異，有待今后繼續(xù)進(jìn)行深入的臨床研究。