敲低S100A9對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷、炎癥反應(yīng)的影響及其機(jī)制

楊越，潘燕，叢麗娜，白楊

新疆醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，烏魯木齊 830001

腦缺血再灌注損傷是由缺血腦組織的血液再灌注引起炎癥因子大量釋放所致，多發(fā)生于缺血性疾病的治療階段，可加重腦組織損傷，導(dǎo)致長(zhǎng)期殘疾甚至死亡［1］。S100是一組具有相似結(jié)構(gòu)和功能的低分子量修飾結(jié)合蛋白，家族成員S100A9參與機(jī)體細(xì)胞凋亡、免疫炎癥反應(yīng)和胚胎發(fā)育，并可通過觸發(fā)特定的信號(hào)通路，導(dǎo)致炎癥因子如白細(xì)胞介素6（IL-6）、IL-1β 及腫瘤壞死因子α（TNF-α）的上調(diào)［2-3］。有研究發(fā)現(xiàn)，S100A9 在大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）模型大鼠腦組織中顯著上調(diào)，觸發(fā)TLR-4 或RAGE 介導(dǎo)的多種炎癥通路，加劇腦缺血灌注再損傷［4］。作為炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)的主導(dǎo)信號(hào)途徑，NF-κB 信號(hào)通路由介導(dǎo)多種細(xì)胞過程的重要轉(zhuǎn)錄因子組成，在典型的NF-κB 信號(hào)通路中，炎癥細(xì)胞因子和趨化因子的多種刺激可激活p65、p50 及cRel 亞基［5］。MyD88作為一種保守的細(xì)胞內(nèi)受體，在先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，其可向toll樣受體及IL-1受體下游傳遞信號(hào)，激活NF-κB信號(hào)通路，維持不同階段的免疫強(qiáng)度和免疫穩(wěn)態(tài)［6］。然而，缺血性腦卒中后S100A9 表達(dá)升高調(diào)控炎癥反應(yīng)的相關(guān)通路以及具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。2022 年2 月—11 月，本研究通過敲低MCAO 模型大鼠腦組織中S100A9表達(dá)，觀察其對(duì)大鼠神經(jīng)功能、腦梗死體積、腦組織炎癥細(xì)胞因子及NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響，以期為進(jìn)一步明確腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 SPF 級(jí)SD 雄性大鼠30 只，體質(zhì)量180～220 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供；TTC 染料、SYBR green qPCR、Western blotting實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑及IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒（武漢默沙克）；p65、磷酸化p65（p-p65）、MyD88及GAPDH抗體（北京中山金橋）；PVDF膜（德國(guó)默克）；生理記錄儀（美國(guó)BioPac）；腦立體定位儀（美國(guó)Stolelting）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific）；Western blotting 實(shí)驗(yàn)相關(guān)的全套電泳儀、電泳槽、標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置（美國(guó)Bio-Rad）；裂解緩沖液（美國(guó)Cell Signaling Technology）；細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)提取試劑盒（上海Beyotime Biotechnology）。

1.2 動(dòng)物分組與MCAO 模型制備 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（6 只）、模型組（6 只）、Lsh-NC 組（9 只）、Lsh-S100A9 組（9 只）。模型組、Lsh-NC 組、Lsh-S100A9 組采用線栓法制備MCAO 模型，大鼠在手術(shù)前禁食12 h之后，經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛（300 mg/kg）麻醉大鼠。將大鼠固定在仰臥位，通過頸正中切口暴露并分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈。將一根2.5 號(hào)尼龍單絲通過頸總動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈內(nèi)，阻塞右側(cè)大腦動(dòng)脈。隨后移除尼龍單絲，閉塞2 h后再灌注24 h。假手術(shù)組不插栓，僅暴露頸總動(dòng)脈及埋線處理。

1.3 大鼠腦組織慢病毒轉(zhuǎn)染 在造模24 h 后將S100A9 敲低慢病毒及空載體分別注入Lsh-S100A9組、Lsh-NC 組大鼠腦內(nèi)，注入速度為0.2 μL/min，總量為3 μL。定位坐標(biāo)為前囟后3.6 mm，側(cè)向2.0 mm，背向2.8 mm。每當(dāng)針頭定位后或是準(zhǔn)備拔出前都停留1 min，注射結(jié)束后縫合傷口。

1.4 大鼠腦組織S100A9 mRNA 檢測(cè) 采用RTqPCR 法。慢病毒轉(zhuǎn)染30 min 后，3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，取腦組織100 mg，TRIzol法提取組織總RNA，微量核酸測(cè)定儀檢測(cè)總RNA 的純度、濃度。按照M-MLV 試劑盒說明書操作將總RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，qPCR 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，具體參照qPCR 擴(kuò)增試劑盒說明配制反應(yīng)體系。引物序列：S100A9 上游引物5'-GCAGCATAAGCACCATCATCAAT-3'，下游引物5'-ACTTTCCCATCAGCATCATACACTC-3'；GAPDH 上游引物5'-GCCTTCCGTGTTCCTACCCC-3'，下 游 引 物 5'-CGCCTGCTTCACCACCTTCT-3'。以GAPDH 為內(nèi)參，按2-ΔΔCt計(jì)算S100A9 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.5 神經(jīng)功能缺損程度評(píng)價(jià) 采用NSS 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠神經(jīng)功能缺損程度進(jìn)行評(píng)價(jià)。0 分：神經(jīng)功能正常；1 分：輕度神經(jīng)功能缺損（提尾時(shí)左前肢屈曲）；2 分：中度神經(jīng)功能缺損（行走時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈）；3分：中度神經(jīng)功能缺損（向左側(cè)傾斜）；4分：無自發(fā)行走，意識(shí)減退；5分：死亡。

1.6 大鼠腦組織梗死體積測(cè)算 采用TTC 染色。各組麻醉后打開其胸腔，用4%多聚甲醛從心尖部灌注。接下來，將灌注后的大腦在4%多聚甲醛中固定2 d，浸入30%的蔗糖溶液中。用切片機(jī)切出30 μm的切片，-20 ℃冰箱保存。在黑暗中于37 ℃下用1% TTC染色15～20 min。將TTC染色的大腦在室溫下用4%甲醛固定24 h，并用數(shù)碼相機(jī)拍照。使用Image J 軟件分析梗塞體積，遵循雙盲原則。計(jì)算公式：梗死體積百分比=100%×（左側(cè)半球正常腦容積-右側(cè)半球正常腦容積）/左側(cè)半球正常腦容積。

1.7 大鼠腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α 檢測(cè) 采用ELISA 法。由缺血處腦組織獲得實(shí)驗(yàn)樣本后進(jìn)行全蛋白提取，收集培養(yǎng)物上清液，保存在-80 ℃冰箱直至使用。ELISA 法檢測(cè)各組大鼠腦組織內(nèi)IL-1β、IL-6、TNF-α 用于評(píng)估炎癥水平，各項(xiàng)操作嚴(yán)格按照ELISA試劑盒的說明進(jìn)行。

1.8 大鼠腦組織p65、p-p65 及MyD88 蛋白檢測(cè)采用Western blotting 法。使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解緩沖液裂解和提取Lsh-NC 組及Lsh-S100A9 組缺血側(cè)腦組織的蛋白質(zhì)，使用細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)提取試劑盒提取細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白。蛋白質(zhì)通過10%～12% SDS-PAGE 分離并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，在室溫下用TBST 中的5%脫脂奶粉封閉1.5 h 后，將膜與一抗在4 ℃下孵育過夜。在次日用TBST洗膜，滴加對(duì)應(yīng)二抗，室溫1 h。使用Image J軟件分析條帶灰度值，以GAPDH 作為內(nèi)源性對(duì)照，以目的條帶與對(duì)照條帶灰度比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism7 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用Shapiro-Wilk 法行正態(tài)性檢驗(yàn)，呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以-x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組S100A9 mRNA 表達(dá)比較 假手術(shù)組、模型組、Lsh-NC 組、Lsh-S100A9 組S100A9 mRNA 表達(dá)分別為0.84 ± 0.22、1.56 ± 0.35、1.47 ± 0.48、0.33 ±0.23；S100A9 表達(dá)模型組、Lsh-NC 組＞假手術(shù)組＞Lsh-S100A9組（P均＜0.05）。

2.2 各組神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分比較 假手術(shù)組、模型組、Lsh-NC 組、Lsh-S100A9 組神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分分別為（0.00 ± 0.00）、（4.00 ± 0.82）、（4.33 ±0.47）、（1.33 ± 0.47）分；神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分模型組、Lsh-NC 組＞Lsh-S100A9 組＞假手術(shù)組（P均＜0.05）。

2.3 各組腦梗死體積比較 模型組、假手術(shù)組、Lsh-NC 組、Lsh-S100A9 組缺血側(cè)腦梗死體積分別為48.95% ± 2.82%、0.00% ± 0.00%、48.41% ±6.96%、26.94% ± 3.92%；缺血側(cè)腦梗死體積模型組、Lsh-NC 組＞Lsh-S100A9 組＞假手術(shù)組（P均＜0.05）。

2.4 各組腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α 表達(dá)比較 腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α 表達(dá)模型組、Lsh-NC 組＞Lsh-S100A9組＞假手術(shù)組（P均＜0.01）。見表1。

表1 各組腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)比較（）

表1 各組腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)比較（）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

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2.5 Lsh-NC 組、Lsh-S100A9 組腦組織p65、p-p65 及MyD88 蛋白表達(dá)比較 Lsh-S100A9 組腦組織pp65、MyD88 蛋白表達(dá)低于Lsh-NC 組（P均＜0.01），兩組腦組織p65表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 各組腦組織p65、p-p65及MyD88蛋白表達(dá)比較（-x ± s）

3 討論

腦卒中是導(dǎo)致中老年人死亡和殘疾的主要原因之一，具有起病急、發(fā)展迅速、預(yù)后差的特點(diǎn)。對(duì)于高致殘率和高病死率的腦卒中疾病，常以恢復(fù)血液供應(yīng)為主要治療手段，然而，恢復(fù)血液供應(yīng)過程中不可避免地會(huì)引起腦缺血再灌注損傷［7］。因此，尋找新的治療方法、有效的生物標(biāo)志物以及新的干預(yù)靶點(diǎn)非常有必要。本研究結(jié)果顯示，S100A9 mRNA 在MCAO 模型腦組織中上調(diào)，可通過增加腦梗死體積和損傷神經(jīng)功能來促進(jìn)大腦發(fā)生缺血再灌注損傷，這與之前研究一致［2，8］。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，抑制S100A9 的表達(dá)可以有效降低腦缺血再灌注損傷引起的炎癥，減少腦梗死體積，降低神經(jīng)功能缺損評(píng)分，提示S100A9能夠通過升高炎癥因子的表達(dá)發(fā)揮促炎作用。S100A9 作為一種低分子量修飾結(jié)合蛋白，可介導(dǎo)許多炎癥反應(yīng)的調(diào)控，具有促炎作用，與之前報(bào)道一致［9-10］。

越來越多的證據(jù)表明，炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致腦缺血再灌注后發(fā)生繼發(fā)性腦損傷［11］。來自大腦皮層的免疫效應(yīng)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生并釋放大量促炎因子，如IL-1β、TNF-α 和IL-6等。這些促炎因子會(huì)啟動(dòng)并加重炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步加重腦損傷［12］。因此，減少促炎因子的產(chǎn)生和釋放是減輕缺血再灌注損傷的有效治療手段［13］。有研究表明，在缺血性腦損傷期間上調(diào)TNF-α、IL-1β 皆可加重腦損傷，而在使用相應(yīng)的中和抗體后，損傷程度明顯降低［3，14］。研究顯示，S100A9能夠誘導(dǎo)MyD88 受體復(fù)合物從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜，并與活性受體相互作用，從而激活NF-κB信號(hào)通路，刺激炎癥因子產(chǎn)生［15］。近期研究發(fā)現(xiàn)，S100A9可通過誘導(dǎo)RAGE 受體的表達(dá)并與其結(jié)合，激活NF-κB 信號(hào)通路，介導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生，在免疫、炎癥反應(yīng)中起到關(guān)鍵作用［16］。p65 及MyD88 作為NF-κB 通路的關(guān)鍵因子能夠很好地反映S100A9 對(duì)NF-κB 通路的調(diào)控作用。p65 在細(xì)胞內(nèi)定位于細(xì)胞質(zhì)中，并與IκB蛋白結(jié)合在一起，形成非激活狀態(tài)的NF-κB復(fù)合物，當(dāng)NF-κB 通路被激活時(shí)，p-p65 的表達(dá)升高［5-6］；而信號(hào)分子MyD88 通過觸發(fā)IκB 的降解，促使NF-κB 復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核并激活特定的基因，從而調(diào)控免疫和炎癥反應(yīng)。

本研究通過構(gòu)建大鼠MCAO 模型發(fā)現(xiàn)，造模引起大鼠腦梗死體積增多，大鼠神經(jīng)功能缺損程度升高；而與Lsh-NC 組比較，S100A9 慢病毒干預(yù)可顯著降低MCAO大鼠腦梗死體積和大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分。采用ELISA 法檢測(cè)炎癥因子水平可見，與假手術(shù)組比較，MCAO模型大鼠腦組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 表達(dá)升高，而Lsh-S100A9 組中炎癥因子表達(dá)降低。qPCR 結(jié)果顯示，相較于假手術(shù)組，S100A9 表達(dá)在模型組中上調(diào)，S100A9 敲低慢病毒干預(yù)后腦組織中S100A9表達(dá)降低。上述結(jié)果提示，在腦缺血再灌注損傷發(fā)生后，S100A9 表達(dá)升高，敲低S100A9表達(dá)可以抑制炎癥因子表達(dá)，改善大鼠腦缺血再灌注損傷。我們進(jìn)一步采用Western blotting法檢測(cè)Lsh-NC 組和Lsh-S100A9 組大鼠腦組織中p-p65、p65 及MyD88 的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與LSh-NC 組比較，LSh-S100A9 組大鼠腦組織中p-p65、MyD88 蛋白表達(dá)下調(diào)，提示S100A9可能通過上調(diào)促炎細(xì)胞因子促進(jìn)腦缺血再灌注損傷并可能通過調(diào)控NF-κB信號(hào)通路影響炎癥。

綜上所述，S100A9 在MCAO 模型大鼠腦組織中表達(dá)升高，敲低S100A9 可減輕腦組織炎癥、神經(jīng)功能缺損程度及梗死體積，減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能與調(diào)控NF-κB 信號(hào)通路影響炎癥反應(yīng)有關(guān)。S100A9 或可成為腦缺血再灌注損的潛在治療靶點(diǎn)發(fā)揮作用。但是，本研究只進(jìn)行了敲低S100A9 對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織影響的體外實(shí)驗(yàn)，存在一定的局限性，未對(duì)S100A9 如何通過NF-κB信號(hào)通路影響炎癥反應(yīng)的具體生物學(xué)行為做更深入的探討，這些問題我們將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中更進(jìn)一步進(jìn)行研究。