無舌川西小黃菊的抗炎及促凝和抗凝活性的初步測試

趙雙雙 尹子麗 李 翔 楊麗萍

云南中醫(yī)藥大學，云南 昆明 650500

無舌川西小黃菊(Pyrethrumtatsienensevar.tanacetopsis)系菊科(Compositae)匹菊屬(Pyrethrum)植物川西小黃菊(Pyrethrumtatsienense)的變種。多年生草本，生長于海拔3500～5200 m 的灌叢、高山草甸或山坡礫石地等。在我國主要分布于云南的貢山、德欽、麗江及西藏等地[1-2]。貢山怒族人民多稱其為“雪參”。該植物在怒族人民的日常生活中有較為廣泛的運用，并深受歡迎。怒族人民多用于高血壓、風濕類疾病、胸背痛、頭痛、濕熱、刀傷或跌打損傷的治療[2]，還因其特殊的香味，也常被作為香料使用，多用作煮雞、燉肉等烹飪調料。但其藥用功效和用法是在民間實踐的經(jīng)驗中積累出來的，對其化學成分和現(xiàn)代藥理學研究尚未見報道。

此外，其原種川西小黃菊是一味藏藥，藏名譯音“色爾君木多美”，以全草入藥，性寒、味苦。有活血、祛濕、消炎止痛功效，主治跌打損傷，濕熱[1]。對該種植物的化學成分研究表明其主要包含單萜、倍半萜、三萜、黃酮、香豆酸和聚炔類化合物[3-7]，而黃酮是其主要成分[5-7]。藥理學研究[8]表明川西小黃菊的水提、醇提物具有鎮(zhèn)痛抗炎、抗缺氧及肝損傷保護活性。一氧化氮(nitric oxide，NO)具有廣泛而重要的生物學調控功能，在炎癥、腫瘤及心血管系統(tǒng)等均有重要作用。當免疫細胞遭受微生物內毒素、炎癥介質等刺激時，會生成大量的誘導型一氧化氮合成酶(induced NO synthase，iNOS)，產(chǎn)生NO進行免疫應答，因此抑制NO生成是化合物抗炎活性的直接指標[9-10]。此外，正常血液循環(huán)中，血小板處于靜止狀態(tài)，在受傷或其他病理條件下，血小板發(fā)生活化、聚集。止血及活血都與血小板的活性有關[11]。筆者通過選取無舌川西小黃菊的抗炎及促/抗凝血活性的藥理模型進行初步測試，并對無舌川西小黃菊中總黃酮含量及抗氧化活性進行測定，還通過氣相色譜-質譜聯(lián)用技術分析其精油化學成分，旨在為其藥理作用研究及其入藥提供試驗依據(jù)。并闡明變種無舌川西小黃菊和川西小黃菊是否具有類似的藥理活性，從而為川西小黃菊提供替代來源奠定基礎。

1 材料與儀器

1.1 材料

1.1.1 研究對象 無舌川西小黃菊，樣本采自貢山縣嘎娃嘎普雪山。經(jīng)中國科學院武漢植物園胡光萬研究員鑒定為菊科匹菊屬植物無舌川西小黃菊。

1.1.2 動物 日本大耳白兔，許可證號：SYXK(湘)2019-0004，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。由昆明植物研究所天然藥物活性篩選中心提供。實驗動物自由攝食飲水，實驗前適應性飼養(yǎng)7 d。

1.1.3 細胞 小鼠單核巨噬細胞RAW264.7購自中科院上海細胞庫。

1.1.4 試劑 DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自BI公司。Griess Reagent、LPS、對照藥物L-NMMA、肝素(HEP，批號119K1581)購自Sigma公司。乙醇消毒液(批號：181206，云南利鍵消毒制品有限公司)；ADP (批號：3449，美國Chronolog公司)；DMSO(批號：RNBB7886，sigma公司)。凝血質控血漿(批號：093B-J186A，德國TECO公司)；PT試液(批號：10002706，德國TECO公司)；Tris-HCl(批號：20160118，美國Amresco公司)；TT試液(批號：30002697，德國TECO公司)；APTT試液(批號：20002745，德國TECO公司)；CaCl2(批號：031N-J073A，德國TECO公司)；依諾肝素(LMWH，批號：4SH69，葛蘭素史克)。亞硝酸鈉(批號：20160705，天津市大茂化學試劑廠)；三氯化鋁[批號：GA030192，薩恩化學技術(上海)有限公司]。無水硫酸鈉(批號：20200407國藥集團化學試劑有限公司)。氫氧化鈉(批號：170703，四川西隴化工有限公司)。蘆丁(批號：R189033，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；維C(批號：STBH7296，生工生物)

1.2 儀器 Chronolog-700型血小板聚集儀、一次性比色杯 (批號418503)、攪拌子(批號91415A)均為美國Chronolog公司產(chǎn)品；5804R型低速冷凍離心機，一次性4 mL枸櫞酸鈉抗凝真空采血管 (批號20200413，武漢致遠醫(yī)療科技有限公司)；醫(yī)用一次性采血針(批號20181229，江西洪達醫(yī)療器械集團有限公司)；VORTEX-5旋渦混勻器(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；METTLER TOLEDO XS105型電子天平(瑞士梅特勒-托利多)；移液槍(eppendorf research plus，德國艾本德)。德國美創(chuàng)MC-4000血凝儀、瑞士步琦旋轉蒸發(fā)儀、賽默飛Thermo Scientific NanoDrop 2000分光光度計；TECAN帝肯Infinite M200 Pro多功能酶標儀。Agilent-6890 型氣相色譜-質譜聯(lián)用(GC-MS)儀(美國 Agilent Technologies 有限公司)。cyclodex-b色譜柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)，美國 Agilent Technologies 有限公司。

2 方法與結果

2.1 提取 取無舌川西小黃菊全草500 g，用95%甲醇室溫浸泡提取3次(3天、2天、2天)，合并3次提取液，減壓蒸餾濃縮后得粗提浸膏W1并記錄其總重量。將浸膏分散于水中，分別用石油醚和乙酸乙酯進行萃取。萃取后分別減壓蒸餾濃縮得到石油醚和乙酸乙酯萃取相濃縮物并記錄它們的總重量。得到粗提浸膏W1和乙酸乙酯萃取浸膏W2待用。

取新鮮無舌川西小黃菊全草100 g，以水蒸汽蒸餾法提取，乙醚帶餾，提取時間為8 h。餾出液經(jīng)無水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾除去乙醚，獲得110 mg黃色揮發(fā)油。

2.2 無舌川西小黃菊提取物對一氧化氮(NO)生成抑制活性的檢測 將小鼠單核巨噬細胞RAW264.7細胞接種至96孔板，用1 μg/mL LPS脂多糖誘導一氧化氮合成酶的生成，導致NO濃度顯著增高。同時加入待測化合物(終濃度50 μg/mL)處理，設置不含藥物組和L-NMMA(L-單甲基精氨酸，一氧化氮合成酶抑制劑)組做對照。細胞過夜培養(yǎng)后取培養(yǎng)基通過Griess法檢測NO生成，在570 nm處測定吸光值來檢測亞硝酸鹽(NO2-)的相對含量，從而達到評價化合物在細胞水平抑制NO生成活性的目的。在剩余培養(yǎng)基中加入MTS，孵育2 h后進行細胞存活率檢測，排除化合物對細胞的毒性影響，同時排除化合物對NO生成抑制活性是由細胞毒性過大而造成假陽性的可能。IC50值測定時，待測化合物濃度從50 μg/mL開始2倍稀釋。

NO生成抑制率(%)=(非藥物處理組OD570 nm-樣品組OD570 nm)/非藥物處理組OD570 nm × 100% IC50(50% concentration of inhibition)按Reed&Muench法計算。

無舌川西小黃菊提取物在50 μg/mL濃度下的一氧化氮(NO)生成抑制活性詳見表1。其中W1在50 μg/mL濃度時有顯著細胞毒性，結果僅供參考；其濃度降低至12.5 μg/mL時(已無明顯毒性)的抑制率為43.42%±0.47%，與陽性對照L-NMMA在50 μM(12.4 μg/mL)的抑制率51.74%±0.62%接近。W2在50 μg/mL濃度時有非常顯著的抑制活性。

表1 無舌川西小黃菊提取物NO生成抑制率

為了深入研究無舌川西小黃菊提取物的一氧化氮(NO)生成抑制活性，課題組測定了兩種提取物對一氧化氮(NO)生成抑制活性的IC50值(表2)。其中W1在高濃度(50 μg/mL和25 μg/mL)時有細胞毒性，抑制率是不準確的。降低濃度后其抑制率未超過50%，因此無法得到IC50。W2的IC50值為(21.53±0.68)μg/mL，高于陽性對照L-NMMA的IC50值(46.82±0.22)μM[(11.62±0.05)μg/mL]。文獻[12]報道紫莖澤蘭具有抗炎活性，其甲醇提取物一氧化氮(NO)生成抑制活性的IC50值為50.38 μg/mL，高于W2的IC50值，說明無舌川西小黃菊提取物的抗炎活性要明顯高于紫莖澤蘭提取物的抗炎活性。文獻[13]報道具有抗炎活性的二萜類化合物pepluanone的一氧化氮(NO)生成抑制活性的IC50值為31.40 μg/mL，也高于W2的IC50值，說明無舌川西小黃菊提取物的抗炎活性甚至要比某些單體化合物的抗炎活性還要好。綜上所述，無舌川西小黃菊提取物顯示了良好的一氧化氮(NO)生成抑制活性。

表2 無舌川西小黃菊提取物NO生成活性的IC50值

2.3 無舌川西小黃菊提取物的誘導血小板聚集活性 樣品配制：精確稱取W1和W2，加入DMSO配制成濃度40 mg/mL溶液，最后用P h 7.4 0.02 M Tris-HCl(含5% Tween 80)稀釋至4 mg/mL。陽性對照二磷酸腺苷(ADP)試液，按說明書方法配制成濃度1 mmoL/L溶液，按100 μL/管分裝后冷藏(-80 ℃)備用。

富血小板血漿(PRP)和貧血小板血漿(PPP)的制備：日本大耳白兔耳中央用乙醇消毒液擦拭后，用醫(yī)用一次性采血針經(jīng)耳中央動脈抽取血液 (枸櫞酸鈉真空抗凝采血管，全血：枸櫞酸鈉為9∶1)，輕輕顛倒采血管數(shù)次使血液和抗凝劑混合均勻。所得抗凝血離心 (200 μg，10 min)，收集上清液為富血小板血漿 (PRP)；剩余血液再次離心 (2400 μg，20 min)，收集上清液為貧血小板血漿 (PPP)，以PPP調PRP血小板計數(shù)為500(109個/L)[14]。

血小板聚集實驗：將帶攪拌子的比色杯與不帶攪拌子的比色杯分別置于血小板聚集儀預溫孔，37 ℃預溫10 min。向預溫好的帶攪拌子的比色杯中加入250 μL PRP，不帶攪拌子的比色杯中加入250μL PPP，同時加入2.5 μL溶解樣品所用的溶媒。然后繼續(xù)預溫5 min后，將兩比色杯分別放入PRP測試位和PPP測試位。調整記錄曲線的基線，按表2所示劑量向PRP測試杯中加入誘導劑或受試樣品，記錄血小板聚集曲線并計算最大聚集率。

表3 無舌川西小黃菊提取物誘導血小板聚集活性

樣品W1、W2，在400 μg/mL 的終濃度下，均沒有明顯誘導兔血小板聚集的作用，誘導家兔血小板聚集的最大聚集率分別為8.8%±11.3%，6.2%±5.2%，與陰性對照DMSO比較沒有顯著性差異(P>0.05)；陽性對照ADP(10 μM)誘導家兔血小板聚集的最大聚集率為64.7%±5.5%，與陰性對照比較具有非常顯著性差異(P<0.01)。

2.4 無舌川西小黃菊提取物的抗凝血活性PT、TT、APTT測試 樣品配制：電子天平分別精確稱取W1和W2，加入DMSO配制成濃度40 mg/mL溶液，最后用Ph 7.4 0.02M Tris-HCl(含5% Tween 80)稀釋至4 mg/mL。陽性對照：PT，肝素(HEP)；TT和APTT，依諾肝素(LMWH)。 空白對照：pH7.4 0.02M Tris-HCl (含5% Tween 80和10% DMSO)作為空白對照。

試驗檢測：按試劑盒說明書進行，在37 ℃預溫比色杯中加入待測樣品溶液或對照品溶液，然后加入人質控血漿，37 ℃下預熱2 min，分別加入PT、TT (37 ℃預溫)試劑，記錄凝血時間。加入 APTT試劑，37 ℃下孵育3 min后，加入0.02 M CaCl2(37 ℃預溫)，記錄凝血時間。

PT(prothrombin time)凝血酶原時間，是在待測血漿中加入過量的組織凝血活酶浸出液和鈣離子，使凝血酶原轉變?yōu)槟福M而使得纖維蛋白原變?yōu)槔w維蛋白，從而使得血漿凝固所需時間。TT(thrombin time)血漿凝血酶時間，是在待測血漿中加入標準化的凝血酶溶液，促進纖維蛋白原變?yōu)槔w維蛋白，導致血漿凝固所需時間。APTT(activated partial thromboplastin time)活化部分凝血活酶時間，是在37℃下以激活劑激活因子Ⅻ和Ⅺ，以部分凝血活酶腦磷脂懸液代替血小板提供凝血的催化表面，在鈣離子參與下，血漿凝固所需要的時間。它們分別代表了外源性凝血途徑、共同凝血途徑和內源性凝血途徑，反映了化合物體外抗凝血活性。由表4可知，受試樣品W2，對PT有微弱的延長作用，W1則沒有效果。由表5可知，受試樣品W1和W2，對TT均沒有影響。由表6可知，受試樣品W1在檢測濃度下能微弱縮短APTT，而W2對APTT均沒有影響。

表4 無舌川西小黃菊提取物抗凝血活性PT測試

表6 無舌川西小黃菊提取物抗凝血活性APTT測試

2.5 無舌川西小黃菊總黃酮含量測定 無舌川西小黃菊總黃酮的提?。壕_稱取無舌川西小黃菊粉末，用甲醇90 ℃回流提取制備總黃酮溶液，定容加入乙醇配制成一系列濃度梯度的溶液。

蘆丁標準曲線的繪制：精確稱取蘆丁樣品，用乙醇配置成標準溶液。分別取30 μL、50 μL、70 μL、90 μL、110 μL、130 μL的標準溶液，加入70%乙醇補至體積均為130 μL。加入40 μL 5%的NaNO2，混勻靜置6 min，加入40 μL 8%的AlCl3，混勻靜置6 min，加入 290 μL 5%的NaOH，混勻靜置15 min。以不加蘆丁標液的空白組作為對照在510 nm處測量各組的吸光度。以蘆丁標準品溶液的濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，進行線性回歸，得到標準曲線方程y=0.031x-0.0012(R2=0.9991)。如圖1所示。

圖1 蘆丁標準曲線圖

精密度：精密吸取蘆丁標準溶液6份，每份130 μL，按蘆丁標準曲線的繪制方法測定吸光度。結果吸光度的RSD=0.32%，表明該方法、儀器的精密度較好。

穩(wěn)定性：取樣品溶液按上述方法制備并每隔10 min按蘆丁標準曲線的繪制方法測定一次吸光度，記錄60 min內樣品溶液吸光度值，計算RSD值。結果表明該供試品在60 min內保持穩(wěn)定，RSD值為0.72%。

重復性：取同一批樣品6份，配置溶液，按蘆丁標準曲線的繪制方法測定吸光度。結果顯示RSD=0.65%，表明該測定方法重復性好。

提取物中總黃酮含量的測定：將部分樣品溶液各自稀釋相應倍數(shù)，取130 μL的樣品溶液，加入40 μL5%的NaNO2，混勻靜置6 min，加入 40 μL 8%的AlCl3，混勻靜置6 min，加入 290 μL 5%的NaOH，混勻靜置15 min。在510 nm處測量吸光度，由蘆丁標準曲線計算總黃酮濃度。計算無舌川西小黃菊中總黃酮含量為5.16%，RSD為0.87%。

2.6 無舌川西小黃菊提取物抗氧化活性測定 樣品配制：電子天平分別精確稱取W1和W2，加入乙醇配制成一系列濃度梯度的溶液。精確稱取一定的DPPH，用甲醇溶解配置成1 mmoL/L DPPH甲醇溶液。精確稱取一定的維生素C，配置成維生素C標準品溶液。

清除DPPH自由基能力測定：將樣品稀釋成不同倍數(shù)制成不同濃度的樣品溶液，加入 200 μL 1 mmoL/L DPPH甲醇溶液，用甲醇補至300 μL體積，避光室溫反應30 min，以甲醇溶液做空白對照用酶標儀在517 nm處測量吸光度，記作A1。甲醇替代DPPH測吸光度記作A2，甲醇替代樣品測空白吸光度記作A0。則其自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100%。以維生素C(Vc)標準品溶液為陽性對照。每一濃度做3個平行樣，取平均值。

由圖2可知，無舌川西小黃菊提取物和維生素C均顯示了較強的清除DPPH自由基能力，且均顯示出隨濃度增大清除率增大，到一定濃度清除率趨于穩(wěn)定。其中維生素C的清除能力在各個濃度均最強，其IC50值為0.34 mg/mL，且趨于穩(wěn)定后抑制率達到90%；與W2相比，W1清除DPPH自由基能力呈現(xiàn)出兩頭弱，中間高的趨勢，其IC50值為0.84 mg/mL，趨于穩(wěn)定后抑制率達到78%；相對于W1，W2清除DPPH自由基能力呈現(xiàn)出兩頭強，中間低的趨勢，其IC50值為0.54 mg/mL，趨于穩(wěn)定后抑制率達到82%。說明總體上W2清除DPPH自由基能力要強于W1。

圖2 無舌川西小黃菊提取物(總黃酮濃度)及維生素C對DPPH自由基清除能力圖

2.7 無舌川西小黃菊精油成分分析 樣品配制：取無舌川西小黃菊精油0.1 mL，加入適量乙醚稀釋，進行GC-MS分析。升溫程序：初始柱溫為60 ℃，保存2 min，然后8 ℃/min升溫至220 ℃，保存10 min。載氣為氦氣，流速為1.0 mL/min，不分流進樣，進樣體積為1 μL。EI電離源，電子能量：70 eV；質量掃描范圍：40～400 amu。

通過以上色譜條件對無舌川西小黃菊精油進行分析，得到總離子流圖(TIC)。如圖3所示，共分離出37種物質。利用 NIST2005和Wiley275標準譜庫進行檢索共鑒定出30個組分，占總量的48.99%。主要成分為吉馬酮(12.15%)、古蕓烯(5.63%)、摩勒烯(3.45%)等。但保留時間為8.856(0.36%)、17.874(37.63%)、17.938(2.05%)、18.120(2.93%)、18.907(0.30%)、21.372(4.92%)、21.708(2.82%)的七個主要成分未能鑒定出，尤其是17.874分鐘的組分在精油中含量最高(37.63%)，它們的結構值得未來進一步研究。

表7 無舌川西小黃菊精油成分的GC-MS測定結果

表7(續(xù))

圖3 無舌川西小黃菊精油化學成分總離子流圖

3 討論

無舌川西小黃菊在怒族民間用于高血壓、風濕類疾病、刀傷或跌打損傷的治療，但是其藥理學依據(jù)尚未有研究報道。NO作為一種神經(jīng)遞質，參與了炎癥反應的過程，是各種炎癥疾病發(fā)生的促炎因子。測試了其粗提浸膏W1和乙酸乙酯萃取浸膏W2的抗一氧化氮生成活性。結果表明，粗提浸膏W1和乙酸乙酯萃取浸膏W2均顯示出顯著的抗一氧化氮生成活性，其中W2的活性明顯強于紫莖澤蘭提取物及報道的抗炎單體二萜的活性，暗示其中含有豐富的強抗炎活性的化合物。無舌川西小黃菊在怒族民間用于風濕類疾病的治療，而炎癥是風濕疾病的主要癥狀，實驗結果與該植物的民間藥用功效是一致的，從而為其民間用藥提供了現(xiàn)代藥理學依據(jù)。這一實驗結果也與其原種川西小黃菊報道的抗炎鎮(zhèn)痛活性一致，說明這兩種植物都含有大量具有抗炎活性的化合物。對無舌川西小黃菊的精油進行了分析，發(fā)現(xiàn)其中含有吉馬酮等成分，而吉馬酮報道有抗炎、抗氧化等活性[15]，暗示吉馬酮可能為其活性成分。進一步的化學成分研究結合藥理學實驗有望從中發(fā)現(xiàn)新的抗炎候選藥物。

血小板在止血過程中發(fā)揮著重要作用，而血小板活化、聚集是其發(fā)揮止血作用的前提。無舌川西小黃菊在民間多用于刀傷止血作用，因此測試了其粗提浸膏W1和乙酸乙酯萃取浸膏W2誘導血小板聚集活性。然而實驗結果表明，無舌川西小黃菊提取物并沒有顯示出血小板聚集活性?？紤]到止血機制比較復雜，而血小板聚集只是其中的一種，有可能無舌川西小黃菊通過其他機制發(fā)揮止血功能，例如形成凝膠狀物質堵塞血管以加速凝血過程等[16-17]。其潛在的止血機制還有待未來的研究加以揭示。

無舌川西小黃菊和川西小黃菊在民間都有治療跌打損傷和活血化瘀的用途，這提示可能具有抗血小板凝聚的功能。據(jù)此，測試了無舌川西小黃菊粗提浸膏W1和乙酸乙酯萃取浸膏W2的抗凝血活性。經(jīng)測試它們對內源性凝血途徑、外源性凝血途徑和共同凝血途徑的影響，結果表明，無舌川西小黃菊的提取物只顯示了微弱的抗凝血活性。因此，無舌川西小黃菊在民間用于治療跌打損傷與其活血活性關系不大。據(jù)報道[7]，川西小黃菊具有鎮(zhèn)痛活性，雖然無舌川西小黃菊這方面的活性在本次實驗中并沒有加以研究，有可能該植物也具有一定的鎮(zhèn)痛活性，從而被民間用于治療跌打損傷。

川西小黃菊的主要化學成分是黃酮類化合物，因此課題組對無舌川西小黃菊的總黃酮含量進行了測定。結果表明其總黃酮含量達到5.16%，與其原種川西小黃菊總黃酮含量相當[7]。由于黃酮類化合物多具有抗氧化、清除自由基的功能，課題組對舌川西小黃菊粗提浸膏W1和乙酸乙酯萃取浸膏W2的DPPH自由基清除能力進行了研究，結果表明W1和W2都具有良好的清除自由基能力，它們的IC50值分別為0.84 mg/mL和0.54 mg/mL。

綜上所述，無舌川西小黃菊的提取物具有顯著的消炎和清除自由基的活性，這為從中發(fā)現(xiàn)新的消炎候選藥物奠定了基礎。其原種川西小黃菊作為著名的藏藥，目前面臨著資源過度開發(fā)，瀕臨枯竭的困境[6]，對其變種無舌川西小黃菊的藥理學研究，發(fā)現(xiàn)它們具有類似的藥理學活性，為其作為藏藥川西小黃菊的替代品提供了依據(jù)。無舌川西小黃菊作為我國少數(shù)民族聚集區(qū)怒江州常見的野生植物，其進一步開發(fā)對于有效利用資源，科學高效扶貧具有一定的積極意義。