非編碼RNA 在胃腸腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的作用機(jī)制研究

鐘俊斌，魏建昌，王強，楊平，張通，陳華翠

廣州市第一人民醫(yī)院胃腸外科，廣東廣州 510180

胃腸腫瘤是一種臨床常見的惡性腫瘤，有著較高發(fā)病率及病死率。雖然近年來我國醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，胃腸腫瘤患者的預(yù)后有了一定情況的改善，但終歸治標(biāo)不治本[1]，遠(yuǎn)期效果無法得到保證。一般來說，在基因測序中，有超過兩萬種蛋白編碼基因，其中有90%以上的轉(zhuǎn)錄因子為非編碼RNA（non-coding, ncRNA）[2]，也有許多學(xué)者對其進(jìn)行了研究。而長鏈非編碼RNA（long-non-coding RNA,lncRNA）則是一種較長的ncRNA，也屬于ncRNA 的范疇，主要存在于真核細(xì)胞中，一般都是由RNA 聚合酶轉(zhuǎn)爐形成的，有著一定的特異性[3]。會參與到真核細(xì)胞中的生物活動，對于細(xì)胞的凋亡和分化會產(chǎn)生較大的影響。有相關(guān)研究表明，ncRNA 與疾病的發(fā)展有著密切的關(guān)系，lncRNA 在同源基因中有著一定的生物學(xué)意義，包括基因反義基因間RNA（HOX anti-sense intergenic RNA, HOTAIR）、HOXA遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)錄本（HOXAtranscript at the distal tip,HOTTIP）等[4-5]。本文基于此，于2022 年4—12 月廣州市第一人民醫(yī)院選擇100 只成年雄性大鼠開展試驗，對胃腸腫瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，探討ncRNA 在胃腸腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的作用機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇本院的成年健康雄性大鼠共100 只，所有大鼠均進(jìn)行了適應(yīng)性飼養(yǎng)，對其長期喂養(yǎng)富含硝酸鹽的食物，讓其出現(xiàn)胃腸腫瘤，共94 只大鼠出現(xiàn)胃腸腫瘤，并選擇相應(yīng)的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。本研究所選研究動物經(jīng)過動物倫理委員會批準(zhǔn)（2022A01 0013）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) RUNX1-IT1 是一種表達(dá)較為穩(wěn)定的細(xì)胞，作為ncRNA 細(xì)胞的同源基因，Lv-RUNX1-IT1 與陰性對照細(xì)胞（negative control, LV-NC）進(jìn)行了對比，并在溫度為37℃進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，在使用蘇木素-伊紅進(jìn)行染色之后，通過顯微鏡對其進(jìn)行觀察。對于胃癌細(xì)胞而言，選擇MGC-803、BGC-823、SGC-7901、HGC-27 進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，結(jié)直腸癌細(xì)胞選擇RKO、HCT116、HT-29、SW620、SW480 進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。將胃癌細(xì)胞放入RPMI-1640 培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)直腸癌細(xì)胞放入L-15 培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含有10%的胎牛血清。溫度為37℃為最佳。

1.2.2 RNA 的提取 無論是胃癌細(xì)胞還是結(jié)直腸癌細(xì)胞及其周邊組織，都通過TRIzol 試劑對其進(jìn)行提取。步驟包括以下幾點：①清洗標(biāo)本組織表面的血液后，放入EP（eppendorf, EP）櫻姬管當(dāng)中，隨后在EP 管中加入適當(dāng)?shù)腡RIzol 試劑，剪碎標(biāo)本組織后，將其吹打均勻。而胃癌細(xì)胞的培養(yǎng)基，使用磷酸鹽緩沖液（phosphate bufferend saline, PBS）清洗干凈，在六孔板當(dāng)中加入適當(dāng)TRIzol 試劑，在室溫下進(jìn)行靜置，目的是讓細(xì)胞裂解。②在EP 管中加入氯仿，并持續(xù)進(jìn)行震蕩，震蕩時間為15 s，并在室溫的條件下靜置5 min。③將EP 管加入到離心機(jī)中，離心時間為15 min，取出EP 管后，吸取上層水放入到新的EP 管中，加入500 mL 丙醇，搖蕩均勻后在室溫下靜置。④將EP 管重新加入到離心機(jī)中，離心時間為10 min，取出EP 管將上清液去除[5]，加入1 mL 的75%乙醇，在搖蕩之后，懸浮沉淀，如此重復(fù)，去掉上清液，并在室溫的條件下進(jìn)行干燥，就形成了RNase-Freed 水溶沉淀，等到RNA 溶解完畢后，進(jìn)行RNA 的純度測試，放入低溫中進(jìn)行保存。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄 對已經(jīng)提取到的RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，使用PrimeScriptTMREGENTkit 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用2 μl的5×gDNA Eraser Buffer、1 μl 的gDNA Eraser、1 μg的RNA，加入到10 μl 的RNase-Free dH2O 當(dāng)中，隨后進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR），溫度為42℃，時間為2 min，等到反應(yīng)結(jié)束之后，將其置于冰上。

1.2.4 PCR 定量 借助SYBR Premix Ex Tap Ⅱ與Light Cycler 480Ⅱ Real-time PCR 儀器上面進(jìn)行PCR 定量。目的是按照成分配置出25 μl 反應(yīng)液。首先，各取出0.5 μl 的PCR 上游引物和下游引物，并使用9.5 μl 的ddH2O 以及2 μl 的cDNA，將其與12 μl 的SUBR Premix Ex Tap Ⅱ配置，得到總體積為25 μl 的反應(yīng)液[6]。

1.3 觀察指標(biāo)

本研究主要將ncRNA 在胃腸腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)能力、大鼠生存時間、大鼠增殖遷移能力作為觀察指標(biāo)，具體如下。

①表達(dá)能力：胃腸腫瘤細(xì)胞選擇HOTTIP 及甘油醛-3 磷酸脫氫酶（glycaraldehyde-3Phosphate dehydrogenase, GAPDH），將其作為ncRNA 的同源基因，并將其與癌旁組織的表達(dá)能力進(jìn)行對比。

②生存時間：根據(jù)ncRNA 同源基因的表達(dá)能力將大鼠分為高表達(dá)組以及低表達(dá)組，統(tǒng)計兩組大鼠的生存時間。

③遷移增殖能力：將94 只大鼠體內(nèi)的RUNX1-IT1 與LV-NC 細(xì)胞在37℃下進(jìn)行培養(yǎng)，并對比其中的遷移能力，于0、24、48、72、96 h 對比兩個細(xì)胞的增殖能力。

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料需符合正態(tài)分布，采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，檢測出ncRNA 及其同源基因的表達(dá)情況，使用Wilcoxon 對其中的表達(dá)水平進(jìn)行檢驗，并且進(jìn)行比較。借助Kaplan-Meier 對不同基因表達(dá)的差異性進(jìn)行評估，并使用Cox 風(fēng)險模型進(jìn)行單因素和多因素的Fenix。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ncRNA 在胃腸腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)

借助PCR 對胃腸腫瘤細(xì)胞及周圍組織的ncRNA 同源基因HOTTIP 表達(dá)水平進(jìn)行檢測，研究結(jié)果表明，HOTTIP 和GAPDH 引物為單峰，特異性較高，且能夠持續(xù)進(jìn)行擴(kuò)增，但是相較于胃腸腫瘤癌細(xì)胞周圍的組織而言，表達(dá)水平都有所降低，呈低 表 達(dá)。HOTTIP 的 單 峰 為（5 518.33±157.30），GAPDH 的單峰為（5 433.86±128.31），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.942，P=0.004），見圖1、圖2。

圖1 HOTTIP 引物溶解曲線

圖2 GAPDH 引物溶解曲線

胃腸腫瘤組織相較于癌旁組織，ncRNA HOTTIP表達(dá)水平明顯較高，HOTTIP 在胃癌組織中的表達(dá)為（3.99±1.05），在癌旁組織的表達(dá)為（3.50±1.03），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.356,P=0.021）。見圖3。

圖3 胃腸腫瘤與癌旁組織表達(dá)對比

2.2 ncRNA 同源基因與胃腸癌腫瘤大鼠預(yù)后的結(jié)果分析

在該次納入的94 只大鼠中，通過基因表達(dá)將其分為高表達(dá)組（n=51）和低表達(dá)組（n=43），兩組大鼠總生存率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 ncRNA 同源基因與胃腸癌腫瘤大鼠預(yù)后結(jié)果分析（n）

2.3 細(xì)胞遷移、增殖實驗結(jié)果

研究結(jié)果表明，相較于LV-NC，Lv-RUNX1-IT1的遷移能力較差，RUNX1-IT1 的相對細(xì)胞表達(dá)量為（1 531.07±15.33），而LV-NC 的相對細(xì)胞表達(dá)量為（1.18±0.29），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=705.55，P＜0.001），見圖4。

圖4 LV-NC 與LV-RUNX1-IT1 遷移能力對比

在增殖試驗中，分別在0、24、48、72 h 以及96 h對LV-NC 及Lv-RUNX1-IT1 的吸光度進(jìn)行對比，研究結(jié)果表明，在0、24、48、72 h 時，兩組的增殖速度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但是在96 h 后發(fā)現(xiàn)，Lv-RUNX1-IT1 的增殖能力明顯低于Lv-NC，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 LV-NC 與LV-RUNX1-IT1 增殖能力對比(±s

表2 LV-NC 與LV-RUNX1-IT1 增殖能力對比(±s

組別Lv-RUNX1-IT1（n=94）LV-NC（n=94）t 值P 值0 h 0 0 24 h 0.12±0.03 0.13±0.03 2.285 0.023 48 h 0.28±0.03 0.32±0.03 9.141＜0.001 72 h 0.46±0.02 0.51±0.03 13.445＜0.001 96 h 0.91±0.04 1.30±0.05 5.330＜0.001

3 討論

胃腸腫瘤是臨床十分常見的惡性腫瘤，無論是病死率還是發(fā)病率都非常高[7]。在近幾年的發(fā)展中，我國醫(yī)學(xué)水平整體提高，能夠有效改善患者的臨床癥狀[8]。但是在遠(yuǎn)期的預(yù)后上還是存在較大的問題。ncRNA 是一種不編碼蛋白質(zhì)的RNA，一般是在聚合酶Ⅱ當(dāng)中合成，在許多腫瘤疾病的調(diào)控、轉(zhuǎn)爐、染色上都有著廣泛的應(yīng)用[9-12]，對于腫瘤的發(fā)展有著至關(guān)重要的作用。HOTTIP 以及RUNX1-IT1 是ncRNA 的同源基因，大部分患者的胃腸腫瘤被發(fā)現(xiàn)時，已經(jīng)進(jìn)入了發(fā)展期或者晚期[13]。為了能夠明確胃腸腫瘤的作用機(jī)制，要尋找靶向治療的位點，從而將其當(dāng)作早期診斷的依據(jù)[14]。有相關(guān)研究表明，ncRNA 中的HOTTIP 在肝癌、皮膚癌、乳腺癌等癌癥當(dāng)中都呈高表達(dá)，在表達(dá)水平上與預(yù)后不良有著密切的關(guān)系[15]。但是在本研究中，發(fā)現(xiàn)HOTTIP 在胃腸腫瘤的表達(dá)中并無明顯的相關(guān)性，可能與腫瘤不同有著密切的關(guān)系。在一項乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 的影響研究中[10]，對lncRNA 的HOTAIR 進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)對照組的Snail 蛋白明顯增加，干預(yù)組Snail 蛋白明顯下降，說明干預(yù)HOTAIR 能夠有效降低乳腺癌。有學(xué)者也證實了HOTAIR 在癌組織的表達(dá)中高于癌旁組織，且與肝移植有著密切的關(guān)系。不僅如此，還證實了HOTAIR 在水平表達(dá)中與肝移植有著密切的關(guān)系[11]。

lncRNA 的長度較長，是一種蛋白質(zhì)編碼RNA，在行業(yè)內(nèi)有著廣泛的關(guān)注，很多學(xué)者將其當(dāng)作是一種新型的標(biāo)志物。有研究表明，ncRNA 同源基因MALAT1 在胃腸腫瘤當(dāng)中是高表達(dá)，可對癌細(xì)胞進(jìn)行侵襲，降低癌細(xì)胞的增殖能力，可以對靶蛋白進(jìn)行調(diào)節(jié)，與本文結(jié)果大致一致。還有研究表明，HOTAIR 能夠與蛋白抑制復(fù)合物Ⅱ產(chǎn)生共同作用，可調(diào)控相關(guān)基因，對于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有著重要的作用。本研究在遷移移植實驗中表明，TUNX1-1TI 能夠有效地抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移能力，與上文的研究一致。在一項關(guān)于lncRNA uc、412 介導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子-β1 的細(xì)胞自噬機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，患者的p62、Lnc RNA uc、412 有所增加，整體表達(dá)有所提高，為慢性腎臟病治療提供了全新的思路。本文腫瘤微環(huán)境的研究中，相較于癌旁組織，表達(dá)也有所提高，研究結(jié)果一致。在一項lncRNA HOTAIR 對胃腸間質(zhì)瘤細(xì)胞影響研究中，發(fā)現(xiàn)HOTAIR 在胃腸癌中的表達(dá)明顯高于正常組織（P=0.042），且在藥物的作用下，HOTAIR 對DNA 損傷細(xì)胞比例為（21.4±4.3），明顯高于正常組的（10.5±1.6）（P=0.037），與本文結(jié)果基本類似。

本研究結(jié)果表明，單峰表達(dá)中，HOTTIP 單峰為（5 518.33±157.30），GAPDH 單 峰 為（5 433.86±128.31）（P=0.004）；HOTTIP 在胃癌組織的表達(dá)為（3.99±1.05），癌 旁 組 織 表 達(dá) 為（3.50±1.03）（P=0.021）；RUNX1 相對細(xì)胞表達(dá)量（1 531.07±15.33），LV-NC 相對細(xì)胞表達(dá)量為（1.18±0.29）（P＜0.001）；最后在遷移、增殖實驗當(dāng)中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖能力和遷移能力都有所下降（P＜0.05）。

綜上所述，ncRNA 在胃腸腫瘤的表達(dá)水平上有明顯的降低，但是能夠有效提高診斷的準(zhǔn)確率，且細(xì)胞的遷移能力和增殖能力有所降低。