結(jié)核分枝桿菌分子生物檢測(cè)與常規(guī)痰涂片檢驗(yàn)結(jié)核菌的臨床比較

葛冰磊，陳永紅，徐成春，趙成娟

宣城市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽宣城 242000

當(dāng)前，結(jié)核病仍然是全球范圍內(nèi)的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題。結(jié)核分枝桿菌是導(dǎo)致結(jié)核病的主要病原體，其傳播和感染對(duì)于早期診斷和有效治療至關(guān)重要。傳統(tǒng)的痰涂片檢驗(yàn)是結(jié)核病的常規(guī)診斷方法之一，但其存在一些局限性，如低靈敏度和特異性以及需大量時(shí)間來(lái)培養(yǎng)和鑒定細(xì)菌[1-2]。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，結(jié)核分枝桿菌的分子生物檢測(cè)方法逐漸成為結(jié)核病診斷和監(jiān)測(cè)的重要工具。這些分子生物學(xué)方法基于對(duì)結(jié)核分枝桿菌DNA 的擴(kuò)增和檢測(cè)，能夠提供更快速、準(zhǔn)確和敏感的診斷結(jié)果。與傳統(tǒng)的痰涂片檢驗(yàn)相比，分子生物檢測(cè)方法可以在更短的時(shí)間內(nèi)完成診斷，并且對(duì)于低菌量樣本的檢測(cè)具有較高的靈敏度[3-4]。為進(jìn)一步探討比較結(jié)核分枝桿菌分子生物檢測(cè)與常規(guī)痰涂片檢驗(yàn)結(jié)核菌的價(jià)值，本文回顧分析2020 年1 月—2022 年12 月期間宣城市人民醫(yī)院收治的248 例疑似結(jié)核患者的臨床資料，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析本院收治的248 例疑似結(jié)核患者的臨床資料，所有患者均進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌分子生物檢測(cè)與常規(guī)痰涂片檢驗(yàn)，其中，男199 例，女49 例，年齡16～87 歲，平均（61.05±16.20）歲。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①疑似結(jié)核的患者；②伴有疑似結(jié)核病癥狀；③未服用相關(guān)藥物；④可正常交流，無(wú)意識(shí)障礙。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重肺部疾病者；②重要臟器功能障礙者；③精神疾病者；④中途退出者。

1.3 方法

所有患者均進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌分子生物檢測(cè)和常規(guī)痰涂片檢驗(yàn)，以羅氏固體培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，

1.3.1 常規(guī)痰涂片 在患者入院的當(dāng)天，使用廣口痰杯收集患者的痰液標(biāo)本3 mL，然后嚴(yán)格根據(jù)操作規(guī)定進(jìn)行檢測(cè)。①先使用接種環(huán)挑取適當(dāng)?shù)奶狄簶?biāo)本，然后制作成一個(gè)厚膜涂片，規(guī)格在15×20 mm，待其自然干燥后，使用火焰對(duì)其進(jìn)行固定。②選擇染色材料，以石碳酸復(fù)紅染液進(jìn)行染色，并使用3%鹽酸溶液對(duì)其進(jìn)行脫色處理。③使用呂氏美藍(lán)液對(duì)其再次進(jìn)行染色，時(shí)間約為30 s，涂片復(fù)染時(shí)間2 min。④確定樣本無(wú)誤可用后使用抗酸染色鏡檢結(jié)果，并對(duì)其進(jìn)行分級(jí)觀察，判定其結(jié)果陰陽(yáng)性。

1.3.2 結(jié)核分枝桿菌分子生物檢測(cè) 以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）結(jié)核分枝桿菌DNA 檢測(cè)，取適當(dāng)痰液標(biāo)本，將其加入適當(dāng)?shù)润w積的液化液，充分震蕩混合后，于37℃環(huán)境下將其液化半小時(shí)。①清洗階段。先抽取1 mL 的液化后樣本，置入潔凈的離心管內(nèi)，對(duì)其進(jìn)行離心處理，時(shí)間5 min，轉(zhuǎn)速12 000 r/min，離心半徑10 cm，清除上層清液，加入1 mL 的生理鹽水，再次渦旋震蕩并進(jìn)行再次離心處理，轉(zhuǎn)速，半徑及時(shí)間同上，然后再次清除上層清液。②提取階段。此階段中將60 μl 的和旋提取液加入離心管內(nèi)，充分渦旋震蕩混合，將其轉(zhuǎn)入核酸提取的試管中，使用核酸快速提取設(shè)備，充分進(jìn)行震蕩5 min，采用恒溫為95℃的水，對(duì)其核酸提取管進(jìn)行5 min 水浴，取出后并第三次進(jìn)行離心處理60 s，獲得核酸，抽取2 μl 樣本對(duì)其擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，并詳細(xì)記錄結(jié)果。放置在熒光定量PCR 儀上運(yùn)行程度，PCR 擴(kuò)增參數(shù)：反應(yīng)罐在93℃下保溫2 min，先93℃ 45s→55℃ 1 min 循環(huán)10 次，再次按93℃ 30 s→55℃ 45 s 循環(huán)30 次，而熒光檢測(cè)需在第二次循環(huán)55℃ 45 s 時(shí)完成。最后根據(jù)說(shuō)明書(shū)對(duì)其結(jié)果進(jìn)行判斷。

1.3.3 結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng) ①取患者的痰液樣本，1 mL，并使用氫氧化鈉（40 g/L）對(duì)其進(jìn)行處理；②將其接種到酸性羅氏培養(yǎng)基中，于37℃下孵育，每間隔一周時(shí)間對(duì)其進(jìn)行觀察1 次，查看菌株生長(zhǎng)的情況，共持續(xù)觀察4 周，期間如果出現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)即可判定為陽(yáng)性，相反即判定為陰性。

1.4 觀察指標(biāo)

以羅氏固體培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)比分析兩種檢查方式的陽(yáng)性檢出率，計(jì)算其診斷效能，包括靈敏度，特異性及準(zhǔn)確率，其中，靈敏度=真陽(yáng)性例數(shù)/（真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100%，特異性=真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù)）×100%；準(zhǔn)確率=（真陽(yáng)性例數(shù)+真陰性例數(shù)）/總例數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 28.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用(±s表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)（n）和率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

結(jié)核分枝桿菌分子生物檢測(cè)的陽(yáng)性檢出率（35.89%）高于常規(guī)痰涂片（33.06%）；結(jié)核分枝桿菌分子生物檢測(cè)的靈敏度94.19%、特異度95.06%高于常規(guī)痰涂片，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而兩種檢測(cè)方法的準(zhǔn)確率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1、表2。

表1 兩種檢測(cè)方式陽(yáng)性檢出率、檢測(cè)的診斷結(jié)果（n）

表2 兩種檢測(cè)方式靈敏度、特異性及準(zhǔn)確率比較（%）

3 討論

結(jié)核病是一種由結(jié)核分枝桿菌感染引起的慢性傳染病，主要影響年輕人群。一旦感染，結(jié)核菌會(huì)進(jìn)入人體并潛伏一段時(shí)間，通常為4～8 周，稱為潛伏期。在潛伏期內(nèi)，感染者通常沒(méi)有任何癥狀，但仍然具有傳染性[5-7]。結(jié)核菌主要侵犯肺部，占據(jù)了所有結(jié)核病患者中的80%～90%[8-9]。肺結(jié)核是最常見(jiàn)的類(lèi)型，其病原菌通過(guò)空氣中的飛沫傳播，例如咳嗽或打噴嚏時(shí)，結(jié)核菌會(huì)釋放到空氣中，并被他人吸入感染。感染后，結(jié)核菌會(huì)侵入肺部組織并引發(fā)炎癥反應(yīng)。盡管肺部是結(jié)核病最常見(jiàn)的部位，但結(jié)核分枝桿菌也可以侵犯其他器官和組織，如淋巴結(jié)、腎臟、骨骼、腦膜等。這些病例雖然相對(duì)較少，但對(duì)患者的健康狀況和治療有著重要的影響[10]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的《2022 年全球結(jié)核病報(bào)告》，2021 年全球新增1 060 萬(wàn)結(jié)核病患者。而我國(guó)的新發(fā)結(jié)核病患者占全球的8.9%，在30 個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家中，其發(fā)病率排名第28 位。說(shuō)明我國(guó)在結(jié)核病的流行和控制方面面臨著重要挑戰(zhàn)[11-12]。我國(guó)是世界上結(jié)核病負(fù)擔(dān)最重的國(guó)家之一，結(jié)核病耐藥形式也非常嚴(yán)峻。耐藥結(jié)核病是指對(duì)常規(guī)抗結(jié)核藥物產(chǎn)生耐藥性的結(jié)核病形式，包括多藥耐藥結(jié)核?。▽?duì)兩種最常用的抗結(jié)核藥物耐藥）和極耐藥結(jié)核病（對(duì)更多種抗結(jié)核藥物耐藥）。這種形式的結(jié)核病對(duì)治療和控制提出了巨大挑戰(zhàn)，需要更加精準(zhǔn)和個(gè)體化的治療方案。在這種情況下，早期的結(jié)核病診斷顯得尤為重要。早期診斷能夠迅速確定結(jié)核病患者，并及時(shí)開(kāi)始治療，從而減少病情的惡化和傳播[13-14]。通過(guò)采用先進(jìn)的診斷技術(shù)，如分子生物學(xué)檢測(cè)方法，可以更準(zhǔn)確地檢測(cè)結(jié)核菌感染，加速診斷過(guò)程，幫助醫(yī)療機(jī)構(gòu)和專(zhuān)業(yè)人員更好地應(yīng)對(duì)結(jié)核病的挑戰(zhàn)。

目前，對(duì)于結(jié)核病的診斷包括實(shí)驗(yàn)室檢查、影像學(xué)檢查和臨床表現(xiàn)三大類(lèi)。在實(shí)驗(yàn)室檢查方面，主要方法包括細(xì)菌學(xué)檢查、分子生物學(xué)檢查、病理學(xué)檢查和免疫學(xué)檢查等。其中，細(xì)菌學(xué)檢查是結(jié)核病常用的實(shí)驗(yàn)室診斷方法之一，主要包括分枝桿菌涂片檢查和分枝桿菌分離培養(yǎng)。分枝桿菌涂片檢查通過(guò)觀察痰液或其他臨床標(biāo)本中的分枝桿菌形態(tài)特征來(lái)進(jìn)行初步診斷。分枝桿菌分離培養(yǎng)則是通過(guò)將臨床標(biāo)本接種到特定培養(yǎng)基上，培養(yǎng)并鑒定分枝桿菌的生長(zhǎng)，是結(jié)核病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”[15-16]。然而，由于分枝桿菌的生長(zhǎng)速度較慢，這種方法需要較長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)獲得結(jié)果，不符合臨床迅速診斷的需求。為了滿足快速準(zhǔn)確診斷的需求，分子生物學(xué)診斷技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。分子生物學(xué)檢查方法利用了對(duì)結(jié)核分枝桿菌DNA 的擴(kuò)增和檢測(cè)，例如PCR 能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)結(jié)核菌的存在。這種方法的優(yōu)勢(shì)在于其高靈敏度和特異性，尤其對(duì)于低菌量樣本的檢測(cè)更為敏感。通過(guò)分子生物學(xué)檢查，可以在較短的時(shí)間內(nèi)獲得結(jié)核病的診斷結(jié)果，有助于早期治療和控制疾病傳播[17]。

作為一種核酸擴(kuò)增技術(shù)，PCR 利用DNA 聚合酶和核苷酸底物的作用，以一段特定的DNA 序列為模板，在適當(dāng)?shù)臏囟葪l件下，通過(guò)循環(huán)擴(kuò)增過(guò)程將目標(biāo)DNA 擴(kuò)增至足夠數(shù)量。這種擴(kuò)增后的DNA 可以用于結(jié)構(gòu)和功能分析，例如測(cè)序、鑒定、定量和突變檢測(cè)等。PCR 的快速和高特異性使其在臨床診斷中具有重要意義，尤其是在細(xì)菌性傳染病的快速診斷方面。PCR 可以通過(guò)特定引物和探針的設(shè)計(jì)，針對(duì)病原微生物的特定基因或序列進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)。由于其高度特異性，可以快速、準(zhǔn)確地鑒定目標(biāo)微生物的存在，有助于快速確診并采取相應(yīng)的治療措施[18]。此外，PCR 技術(shù)還具有靈敏度較高的優(yōu)勢(shì)。其能夠在非常低的目標(biāo)DNA 濃度下進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)，因此即使是微生物數(shù)量很少的樣本，也能夠有效檢測(cè)到。這對(duì)于早期感染或低菌量感染的診斷非常重要，可以提高疾病的檢出率和準(zhǔn)確性。雖然PCR 在結(jié)核分枝桿菌DNA 檢測(cè)中具有許多優(yōu)勢(shì)，但在應(yīng)用過(guò)程中也需要注意其局限性和潛在的誤診風(fēng)險(xiǎn)。

而常規(guī)痰涂片是一種直接的顯微鏡檢查方法，用于觀察痰液樣本中是否存在結(jié)核分枝桿菌的酸酒精染色陰性桿菌形態(tài)。該方法相對(duì)簡(jiǎn)單，操作方便，是結(jié)核病最常用的初篩檢查方法之一。其優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低廉，并且可以提供快速的初步篩查結(jié)果。然而，其也存在一些局限性。①常規(guī)痰涂片的敏感性相對(duì)較低，對(duì)于低菌量的樣本或非典型結(jié)核菌株可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果。②該方法無(wú)法區(qū)分結(jié)核菌的活動(dòng)性和非活動(dòng)性，無(wú)法提供關(guān)于感染程度和病情嚴(yán)重程度的定量信息。因此，對(duì)于懷疑結(jié)核病的患者，通常需要結(jié)合其他的實(shí)驗(yàn)室檢查方法，如分子生物學(xué)檢測(cè)（如PCR）和分枝桿菌培養(yǎng)等，以提高診斷的準(zhǔn)確性和敏感性。常規(guī)痰涂片作為一種快速初篩方法仍然具有重要的臨床意義，特別是在資源有限的環(huán)境下，可以用來(lái)快速篩查結(jié)核病病例，進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè)和診斷。

本文結(jié)果顯示，結(jié)核分枝桿菌分子生物檢測(cè)的陽(yáng)性檢出率高于常規(guī)痰涂片，結(jié)核分枝桿菌分子生物檢測(cè)的靈敏度94.19%、特異度95.06%高于常規(guī)痰涂片，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），這與劉原園等[19]的研究中，分子生物檢測(cè)組陽(yáng)性檢出率高于常規(guī)痰涂片，靈敏度93.78%、特異度96.35%高于常規(guī)痰涂片的結(jié)果一致，由此可知，PCR 在檢測(cè)結(jié)核病方面具有更高的準(zhǔn)確性和敏感性，能夠更可靠地檢測(cè)到結(jié)核分枝桿菌的存在。PCR 的特異度略低于痰涂片，意味著在某些情況下可能會(huì)出現(xiàn)PCR 的假陽(yáng)性結(jié)果。這可能是由于PCR 方法對(duì)結(jié)核分枝桿菌的高敏感性，使其在一些非活動(dòng)性或低菌量感染的情況下也能夠檢測(cè)到[20]。

綜上所述，結(jié)核分枝桿菌分子生物檢測(cè)結(jié)核菌其檢出率高，且進(jìn)一步提高其診斷效能，一致性良好，可為疑似結(jié)核的患者提供明確診斷，對(duì)后續(xù)疾病治療及控制提供重要參考。