外源誘導(dǎo)尾葉桉非培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的激活*

王亞聰 王 迪 田紅雨 王照玉 史曉夢 冉隆賢,2

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院 保定 071000；2. 河北省林木種質(zhì)資源與森林保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 保定 071000）

桉樹（Eucalyptusspp.）為桃金娘科（Myrtaceae）桉屬（Eucalyptus）、杯果木屬（Angophora）和傘房屬（Corymbia）植物的統(tǒng)稱，具有速生、適應(yīng)性和抗逆性強(qiáng)、用途廣等特點(diǎn)，是我國華南地區(qū)營造速生豐產(chǎn)林的主要樹種之一。桉樹原產(chǎn)于澳大利亞、印度尼西亞及其附近島嶼，其引種栽培范圍遍及世界5大洲120多個國家和地區(qū)（王楚彪等，2021）。目前，全球桉樹人工林種植面積超過2 500萬hm2，占世界人工林面積的15%，我國桉樹種植總面積546萬hm2，居世界第3位（彭杏冰等，2021；任世奇等，2021），年產(chǎn)木材5 000萬m3以上，為增加森林資源、緩解我國木材供需矛盾發(fā)揮了重要作用（Wanget al.，2019；竹萬寬等，2020；陳潔純等，2021）。

微生物是地球上多樣性最豐富的生物類群，99%以上的微生物處于存活但非培養(yǎng)（viable but nonculturable，VBNC）狀態(tài)，這種狀態(tài)是非芽孢形成菌抵御不良環(huán)境的生存機(jī)制，在現(xiàn)有技術(shù)條件下難以分離培養(yǎng)（賀紀(jì)正等，2013；Pintoet al，2015；張碩等，2018），但在條件適宜時菌體可以復(fù)蘇，能夠恢復(fù)其在培養(yǎng)基上生長繁殖的能力（Ayrapetyanet al，2018；闞玉敏等，2020）。植物根、莖、葉、花、果實(shí)和種子等組織和器官中普遍存在內(nèi)生細(xì)菌，這些內(nèi)生細(xì)菌同其他環(huán)境中的微生物一樣，因難以模擬其生長繁殖的原位條件大多不能進(jìn)行純培養(yǎng)（孫磊等，2006；王躍強(qiáng)等，2006）。田紅雨（2020）應(yīng)用顯微鏡觀察和高通量測序技術(shù)在赤桉（E. camaldulensis）、尾葉桉（E. urophylla）和粗皮桉（E. pellita）實(shí)生組培苗中均發(fā)現(xiàn)大量非培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的存在，且優(yōu)勢菌屬較相似，分別為假單胞菌屬（Pseudomonas）和鞘脂菌屬（Sphingobium）細(xì)菌。Podolich等（2009）將熒光假單胞桿菌（P. fluorescens）接種馬鈴薯（Solanum tuberosum）組培苗，使非培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌甲基營養(yǎng)菌（Methylobacteriumsp. ）恢復(fù)到可培養(yǎng)狀態(tài)。還有研究發(fā)現(xiàn)，在培育植物組培苗的過程中，隨著繼代次數(shù)增加，也可出現(xiàn)可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌。Thomas等（2008）對香蕉（Musa paradisiaca）莖尖培養(yǎng)繼代后不可培養(yǎng)內(nèi)生菌逐漸恢復(fù)活性變成可培養(yǎng)狀態(tài)。申紅妙等（2010）發(fā)現(xiàn)尾葉桉組培苗中有存活但不可培養(yǎng)的內(nèi)生細(xì)菌，但組培苗繼代培養(yǎng)至第8代后能夠分離到可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌。宋艷祥等（2011）利用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）CN030菌株與桉樹組培苗共培養(yǎng)，分離出至少6種優(yōu)勢的非培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌。

桉樹青枯病在廣東、廣西和海南等?。▍^(qū)）發(fā)生嚴(yán)重，重病區(qū)植株死亡率高達(dá)98%，一般流行區(qū)死亡率也達(dá)30%～50%（張民興等，1996），給桉樹生產(chǎn)造成極大威脅，成為桉樹行業(yè)亟待解決的問題（Zhouet al.，2011）。Ran等（2005a）研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用菌液蘸根法熒光假單胞桿菌 WCS417r對桉樹青枯病具有顯著防治效果，惡臭假單胞桿菌（P. putida）WCS358r對桉樹青枯病具有較好防治作用，但其嗜鐵素缺失突變體完全失去防治效果，而熒光假單胞桿菌WCS374r沒有防治作用；Ran等（2005b）對這些菌株進(jìn)行誘導(dǎo)抗病性研究得出，WCS358r和WCS374r能夠誘導(dǎo)桉樹抵御青枯病，WCS358r產(chǎn)生的嗜鐵素缺失突變體沒有誘導(dǎo)效果，說明嗜鐵素是WCS358r菌株誘導(dǎo)桉樹抗青枯病的關(guān)鍵因子，而WCS374r的嗜鐵素缺失突變體仍具有誘導(dǎo)抗病活性。鑒于此，本研究在利用上述3種細(xì)菌對桉樹青枯病進(jìn)行生物防治和誘導(dǎo)抗病性研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究這些細(xì)菌對桉樹非培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的激活作用，以期為應(yīng)用內(nèi)生細(xì)菌防治桉樹青枯病提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 桉樹種子 尾葉桉種子，廣東省雷州林業(yè)局提供，用于培養(yǎng)無菌實(shí)生苗。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑 尾葉桉無菌實(shí)生苗培養(yǎng)選用1/2 MS培養(yǎng)基；細(xì)菌培養(yǎng)選用KB培養(yǎng)基。

1.1.3 供試菌株 外源菌株惡臭假單胞桿菌WCS358r和熒光假單胞桿菌WCS374r及其嗜鐵素缺失突變體JM218和Mut2，熒光假單胞桿菌WCS417r及其脂多糖缺失突變體WCS417OA-(B4)，均由荷蘭烏特勒支大學(xué)提供。

1.2 尾葉桉無菌實(shí)生苗的培養(yǎng)

挑選健康飽滿的尾葉桉種子，在超凈工作臺上依次用75%乙醇消毒30 s、0.1% HgCl2消毒2 min后，用無菌水沖洗3～4次，播種到1/2 MS培養(yǎng)基上，置于25 ℃光暗交替的環(huán)境中培養(yǎng)，成苗后對桉樹苗進(jìn)行繼代培養(yǎng)，獲得多株同源同代尾葉桉實(shí)生苗。

1.3 菌懸液與細(xì)菌代謝液的制備

外源菌WCS358r、WCS374r和WCS417r在KB培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)1～2天后，用無菌水將WCS358r配制成103、105、107、108和109CFU·mL-1的菌懸液，將WCS374r、WCS417r配制成108CFU·mL-1的菌懸液，備用。同樣方法將上述3種外源菌的突變體JM218、Mut2和WCS417OA-(B4)用無菌水分別配制成108CFU·mL-1的菌懸液，備用。

1.4 桉樹非培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的激活

1.4.1 3種外源菌及其突變體與同源同代桉樹實(shí)生苗共培養(yǎng) 選取長勢基本相同的同源同代桉樹實(shí)生苗21株。取篩過的河沙12 g于西林瓶中，再將西林瓶置于300 mL組培瓶內(nèi)，間隔24 h進(jìn)行2次高溫高壓滅菌，每次滅菌時間1 h。在無菌條件下將桉樹實(shí)生苗移栽至裝有無菌河沙的西林瓶內(nèi)，每瓶1株，處理組分別澆淋4 mL濃度108CFU·mL-1的外源菌或其突變體的菌懸液，對照組澆淋等量無菌水。最后，在組培瓶中加入適量無菌水用于保濕，置于12 h光暗交替的25 ℃環(huán)境中培養(yǎng)。

1.4.2 WCS358r與尾葉桉種子實(shí)生苗共培養(yǎng) 采用上述同樣方法對過篩河沙進(jìn)行稱重、裝瓶和滅菌處理，備用。選取由尾葉桉種子無菌萌發(fā)的實(shí)生苗4株，編號。無菌條件下將桉樹苗分別移栽至裝有無菌河沙的西林瓶內(nèi)，每瓶1株，并依照苗號做好標(biāo)記，分別澆淋4 mL濃度108CFU·mL-1的WCS358r菌懸液，對照組澆淋等量無菌水。同樣向組培瓶中加入適量無菌水并封口后，置于25 ℃、12 h光暗交替環(huán)境中培養(yǎng)。

1.4.3 不同濃度WCS358r與同源同代桉樹苗共培養(yǎng) 選取長勢基本相同的同源同代尾葉桉實(shí)生苗15株。稱取12 g過篩河沙，按照上述同樣方法進(jìn)行裝瓶和滅菌，備用。在無菌條件下將選取的桉樹實(shí)生苗分別移栽至裝有無菌河沙的西林瓶內(nèi)，每處理3株，分別澆淋4 mL濃度103、105、107和109CFU·mL-1的WCS358r菌懸液，對照組澆淋等量無菌水。組培瓶中加入適量無菌水并封口后，置于25 ℃、12 h光暗交替環(huán)境中培養(yǎng)。

1.5 桉樹非培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的分離與純化

1.5.1 非培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的分離 外源菌與桉樹苗共培養(yǎng)21 天后，在無菌條件下用無菌水將桉樹苗根部河沙沖洗干凈，并將其分成根、莖、葉3部分，分別稱量并記錄。根、莖、葉分別采用上述方法進(jìn)行表面消毒，取最后1次沖洗液200 μL涂平板，檢測消毒效果。各部位的桉樹苗材料分別在3個無菌研缽內(nèi)加入1 mL無菌水研磨成漿，稀釋100倍后，取研磨液200 μL涂平板，置于28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。對照組桉樹苗也按同樣處理方式，分離非培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌。

1.5.2 非培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的純化 研磨液培養(yǎng)3～7 天后，先依據(jù)長出細(xì)菌的表面顏色和形態(tài)特征進(jìn)行初步分類并編號，再將編號后的細(xì)菌轉(zhuǎn)接至新的KB培養(yǎng)基內(nèi)，28 ℃下純化培養(yǎng)。為避免丟失一些生長較慢的內(nèi)生細(xì)菌，初始分離的培養(yǎng)皿放回培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)、觀察。

1.6 激活內(nèi)生細(xì)菌的鑒定

1.6.1 抗利福平檢測 所接種的外源菌及其突變體均為經(jīng)過抗利福平篩選的細(xì)菌，能夠在含150 μg·mL-1利福平的培養(yǎng)基上正常生長，因此通過抗利福平試驗(yàn)，可依據(jù)細(xì)菌生長情況判定從桉樹植株中分離出來的細(xì)菌是否為接種后定殖的外源菌。無菌條件下，在融化的KB培養(yǎng)基中加入無菌利福平母液，搖勻，使利福平在培養(yǎng)基中的濃度為150 μg·mL-1，倒入培養(yǎng)皿內(nèi)，待其冷卻凝固后，用滅菌牙簽按順序點(diǎn)接標(biāo)記好的內(nèi)生細(xì)菌菌落于培養(yǎng)基上，并對應(yīng)標(biāo)號，置于28 ℃下培養(yǎng)，24 h后觀察點(diǎn)接菌落的生長情況，并以未加利福平的KB培養(yǎng)基作為對照。

1.6.2 革蘭氏染色反應(yīng) 在超凈工作臺內(nèi)，用滅菌吸管滴1～2滴3%KOH溶液于干凈的載玻片上，再用接種環(huán)挑取待測細(xì)菌單菌落到KOH溶液中并順時針攪拌。如果攪拌液稀薄呈粥樣，不能拉絲則該細(xì)菌為革蘭氏陽性菌；如果攪拌液黏稠，拉出細(xì)絲則為革蘭氏陰性菌（Suslowet al.，1982）。

1.7 被激活內(nèi)生細(xì)菌的分子鑒定

1.7.1 細(xì)菌總DNA提取 將純化的內(nèi)生細(xì)菌再重新培養(yǎng)1～2 天，培養(yǎng)條件同上。參照DNA提取試劑盒說明書分別提取各菌體DNA，取上清液作為DNA模板，備用。

1.7.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng) 參照PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA試劑盒說明書，采用50 μL 擴(kuò)增體系，對目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。獲得目的條帶后，對DNA瓊脂糖進(jìn)行切膠純化。

1.7.3 DNA測序 切膠回收目的片段，以SEQForward、SEQInternal和SEQReverse為引物進(jìn)行DNA測序。將所測基因序列在NCBI上與已知序列進(jìn)行BLAST比對，選取相似度較高的序列，使用Mega5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定外源菌激活獲得的非培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的分類地位。

1.8 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2016軟件整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用SPSS 22.0軟件的單因素方差分析統(tǒng)計各處理平均值的差異，并用Duncan多重比較對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，計算并繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外源菌及其突變體對桉樹苗內(nèi)生細(xì)菌的激活

3種外源菌及其突變體對同源同代桉樹苗進(jìn)行激活處理后，從WCS358r處理的桉樹苗中共分離純化出3種內(nèi)生細(xì)菌，經(jīng)抗利福平試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其中1種優(yōu)勢菌株為接種后定殖在桉樹體內(nèi)的外源菌WCS358r，其主要定殖在桉樹苗根部，平均定殖量達(dá)6.76×106CFU·g-1（表1），另外2種內(nèi)生細(xì)菌為被激活的非培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌，經(jīng)染色鑒定均為革蘭氏陽性菌株，分別編號5和6（表2）；從WCS417r處理的桉樹苗中只分離出1種內(nèi)生細(xì)菌，經(jīng)抗利福平試驗(yàn)鑒定為接種后定殖在桉樹體內(nèi)的外源菌WCS417r，其在桉樹根和莖部的定殖量顯著高于葉部（P＜0.05）（圖1）；而接種外源菌WCS374r及其突變體Mut2、WCS358r的嗜鐵素缺少突變體菌株JM218和WCS417r的脂多糖缺失突變體菌株WCS417OA-(B4)后，桉樹苗中均未發(fā)現(xiàn)接種的外源菌，且也未分離出其他細(xì)菌，與對照組的桉樹苗相同。

圖1 WCS417r在桉樹各部位的定殖情況Fig. 1 The colonization of WCS417r in E. urophylla

表1 WCS358r在桉樹體內(nèi)的定殖情況（對數(shù)值）Tab. 1 The colonization of WCS358r in E. urophylla(lg CFU·g-1, fresh weight)

表2 WCS358r激活桉樹內(nèi)生細(xì)菌情況（對數(shù)值）①Tab. 2 Resuscitation of uncultured endophytic bacteria by WCS358r in E. urophylla (lg CFU·g-1, fresh weight)

2.2 外源菌WCS358r對尾葉桉不同種子實(shí)生苗內(nèi)生細(xì)菌的激活

外源菌WCS358r能成功定殖在桉樹實(shí)生苗根、莖部位，定殖量表現(xiàn)為根＞莖（表3），而其激活的桉樹非培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌主要分布在莖部和葉部，其中苗1中分離出2種桉樹非培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌，編號為1和2；苗2中分離出2種桉樹非培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌，編號3和4；苗4中分離出1種桉樹非培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌，編號為8（表4）。經(jīng)染色鑒定以上激活出的非培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌，均為革蘭氏陽性菌株。其他處理后的桉樹苗與對照組桉樹苗均未分離到內(nèi)生細(xì)菌。

表3 WCS358r在不同桉樹實(shí)生苗內(nèi)的定殖情況（對數(shù)值）Tab. 3 The colonization of WCS358r in different E. urophylla seedlings (lg CFU·g-1, fresh weight)

表4 WCS358r激活不同桉樹實(shí)生苗內(nèi)生細(xì)菌情況（對數(shù)值）①Tab. 4 Resuscitation of uncultured endophytic bacteria by WCS358r in different E. urophylla seedlings(lg CFU·g-1, fresh weight)

2.3 不同濃度WCS358r對桉樹非培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的激活

由表5可知，濃度105和107CFU·mL-1的WCS358r處理同源同代桉樹苗后，只在桉樹苗根部分離出1種細(xì)菌，經(jīng)抗利福平試驗(yàn)鑒定為外源菌WCS358r；濃度為109CFU·mL-1時，從桉樹苗中分離出3種細(xì)菌，其中1種細(xì)菌經(jīng)鑒定為外源菌WCS358r，另外2種細(xì)菌為非培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌，編號為5和7（表6），為革蘭氏陽性菌；外源菌濃度為103CFU·mL-1時與對照組均未分離得到內(nèi)生細(xì)菌。

表5 不同濃度WCS358r在桉樹苗內(nèi)定殖情況（對數(shù)值）Tab. 5 The colonization of different suspension of WCS358r in E. urophylla (lg CFU·g-1, fresh weight)

表6 WCS358r濃度為109 CFU·mL-1對桉樹內(nèi)生細(xì)菌的激活情況（對數(shù)值）①Tab. 6 Resuscitation of uncultured endophytic bacteria in E.urophylla by WCS358r at a population density of 109 CFU·mL-1(lg CFU·g-1, fresh weight)

2.4 被激活內(nèi)生細(xì)菌的初步鑒定

2.4.1 抗利福平檢測 從處理后的桉樹體內(nèi)分離到接種的外源菌株WCS417r和WCS358r，其均可在含150 μL·mL-1利福平的KB培養(yǎng)基上正常生長。從植株中分離出的其余8種細(xì)菌對利福平?jīng)]有抗性，且顏色和形態(tài)與接種的外源菌也有明顯差異，可判斷為激活的非培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌，其在不含利福平的KB培養(yǎng)基上的培養(yǎng)狀態(tài)和生長特征如表7和圖2所示。

圖2 被激活內(nèi)生細(xì)菌的菌落形態(tài)Fig. 2 The colony morphology of resuscitated endophytic bacteria in E. urophylla1—8號代表被激活的內(nèi)生細(xì)菌菌株。No.1-8 indicate resuscitated endophytic bacterial strains.

表7 尾葉桉中被激活內(nèi)生細(xì)菌的主要特征Tab. 7 The main characteristics of endophytic bacteria of E. urophylla

2.4.2 革蘭氏染色反應(yīng) 被激活的1～8號非培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌，全部為革蘭氏陽性細(xì)菌。

2.5 被激活內(nèi)生細(xì)菌的分子鑒定

對8種內(nèi)生細(xì)菌分別提取并擴(kuò)增DNA后，進(jìn)行16S rDNA菌種鑒定。將測序結(jié)果與NCBI菌種數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，并用Mega5.0軟件進(jìn)行分析后構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3），初步確定被激活細(xì)菌的分類地位：1號與鏈霉菌屬5種菌的同源性均達(dá)100%；2號與短小芽孢桿菌的同源性達(dá)100%；3號與蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌達(dá)100%的同源性；4號與枯草芽孢桿菌、龍舌蘭芽孢桿菌和漠海威芽孢桿菌親緣關(guān)系比較近，均達(dá)99%的同源性；5、6和8號與解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌親緣關(guān)系比較近；7號與枯草芽孢桿菌和龍舌蘭芽孢桿菌親緣關(guān)系比較近。

圖3 被激活內(nèi)生細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位Fig. 3 The phylogenetic tree of resuscitated endophytic bacteria1—8號代表被激活的內(nèi)生細(xì)菌菌株。No.1-8 indicate resuscitated endophytic bacterial strains.

3 討論

3.1 影響桉樹非培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌激活能力的因素

在同源同代桉樹苗中接種WCS358r、WCS374r和WCS417r 3種不同外源菌后，其在桉樹體內(nèi)的定殖能力及對植物非培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的激活能力均有差異。在桉樹根、莖和葉中均檢測到大量外源菌株WCS417r，只在根和莖中檢測到外源菌株WCS358r，WCS374r未成功定殖于桉樹任何部位，外源菌株的定殖能力表現(xiàn)為WCS417r＞W(wǎng)CS358r＞W(wǎng)CS374r。Ran等（2005a）選用這3種菌株以蘸根方式進(jìn)行桉樹青枯病防治試驗(yàn)，WCS417r的防治效果顯著，WCS358r具有一定生防效果，而WCS374r沒有生防效果，與本試驗(yàn)的定殖情況具有相似特性，推測生防菌對桉樹青枯病的防治效果可能與其定殖能力有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，WCS358r的嗜鐵素缺失突變體JM218未能在同源同代桉樹苗中激活出非培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌，失去野生型菌株原有的激活能力，WCS417r的脂多糖缺失突變體菌株WCS417OA-(B4)不能定殖于桉樹體內(nèi)，失去野生型菌株原有的定殖能力，這表明細(xì)菌的脂多糖基因會影響細(xì)菌的定殖能力，而嗜鐵素基因會影響細(xì)菌對桉樹非培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的激活能力。

3.2 可被激活的桉樹非培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌

從桉樹實(shí)生組培苗中激活出的非培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌大多數(shù)為芽孢桿菌（Bacillus），少數(shù)為鏈霉菌屬（Streptomyces）。目前諸多報道證實(shí)芽孢桿菌廣泛存在于許多植物體內(nèi)，且占比較高，包含枯草芽孢桿菌（B. subtilis）、蠟樣芽孢桿菌（B. cereus）和短小芽孢桿菌（B. pumilus）等多種芽孢桿菌（Rangelet al.，2022；Vendanet al.，2010；葛慈斌等，2015；Goulartet al.，2019；龔國利等，2020），因此，使用外源激活菌從桉樹體內(nèi)激活出非培養(yǎng)內(nèi)生芽孢桿菌較多可能與其在桉樹內(nèi)的存在數(shù)量有關(guān)，但仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。芽孢桿菌是目前生產(chǎn)上開發(fā)和應(yīng)用最為成熟的生防菌之一，但除芽孢桿菌外，本研究中還激活出鏈霉菌，有研究表明鏈霉菌在植物病害的生物防治上也具有廣闊應(yīng)用前景（Kanget al., 2022；Pereiraet al.,2022）。楊鳳環(huán)（2008）研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生鏈霉菌CN122對桉樹青枯病菌具有明顯防治效果，但應(yīng)用內(nèi)生鏈霉菌防治桉樹青枯病還需進(jìn)一步探究。

本研究使用外源菌從桉樹組培苗中激活出來的非培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌全部為革蘭氏陽性菌，宋艷祥（2011）用枯草芽孢桿菌CN030激活桉樹組培苗也出現(xiàn)同樣情況。目前對于VBNC態(tài)細(xì)菌恢復(fù)培養(yǎng)能力的機(jī)制尚不明確，因此對于本研究中出現(xiàn)的這種現(xiàn)象還無法解釋。已知復(fù)蘇促進(jìn)因子（resuscitation promoting factor，Rpf）能夠促進(jìn)休眠菌的復(fù)蘇（Wanget al., 2022），有學(xué)者認(rèn)為Rpf廣泛存在于厚壁菌門的革蘭氏陽性細(xì)菌中，參與肽聚糖合成等過程，有的革蘭氏陽性細(xì)菌中甚至含有5個Rpf基因，在部分革蘭氏陰性菌中也發(fā)現(xiàn)類似于Rpf的蛋白質(zhì)，利于細(xì)菌的復(fù)蘇（張曉華等，2020）。另外，本研究選用的3種外源激活菌均為革蘭氏陰性菌，在之后的研究中可以同時對比革蘭氏陽性菌和陰性菌的激活試驗(yàn)結(jié)果，以深入探究固有內(nèi)生細(xì)菌的激活規(guī)律。

目前，對VBNC態(tài)的細(xì)菌進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)的研究報道很多（Panutdapornet al.，2006；Suet al.，2015；張艷軍等，2020），如有些研究探究吐溫對VBNC菌的復(fù)蘇作用（田聰?shù)龋?013；Zenget al.，2013；蔣麗芬，2017），今后的研究也可探索更多不同的復(fù)蘇刺激因子對桉樹非培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的激活作用，為挖掘更多的潛在微生物資源和應(yīng)用桉樹內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行青枯病防治提供參考。

4 結(jié)論

外源菌的種類、濃度及桉樹種子均會影響桉樹非培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的激活情況，被激活的非培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌全部為革蘭氏陽性菌，且主要為芽孢桿菌。嗜鐵素是惡臭假單胞桿菌WCS358r激活桉樹非培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的關(guān)鍵因子，脂多糖是影響熒光假單胞桿菌WCS417r定殖的關(guān)鍵因子。