中藥余甘子對豬腹瀉病原菌體外抑制作用的研究

曹 冶,謝 晶,康潤敏通信作者,于吉鋒,吳學(xué)婧

1.四川省畜牧科學(xué)研究院,四川 成都 610066 2.動物遺傳育種四川省重點實驗室,四川 成都 610066

0 引言

豬腹瀉病是養(yǎng)豬生產(chǎn)中常見的疾病,癥狀主要表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐、食欲不振,嚴重的會出現(xiàn)脫水癥狀。豬腹瀉病不僅有較高的發(fā)病率,且死亡率高。生豬一旦發(fā)生嚴重的腹瀉,如果預(yù)防不當、治療不及時,會嚴重影響?zhàn)B殖效益。

生豬出現(xiàn)腹瀉疾病主要是生豬自身、病毒和細菌以及三者之間的混合感染引發(fā)。在生產(chǎn)實踐中,豬腹瀉病主要受以下幾種細菌的影響:大腸桿菌、豬霍亂沙門氏菌以及這2種細菌混合感染。目前主要采用疫苗來預(yù)防,已經(jīng)發(fā)病的豬通過抗生素來治療,但長期使用抗生素會帶來嚴重的副作用,且會讓病菌產(chǎn)生耐藥性,導(dǎo)致嚴重的后果[1-2]。因此,尋找新的藥物替代抗生素,防治豬腹瀉病成為廣大畜牧工作者關(guān)注的重點。

我國的中藥已有幾千年的歷史,其主要來源于天然藥材及其加工品,包括植物藥、動物藥、礦物藥及部分化學(xué)、生物制品類藥物,具有溫和、無副作用、不會對病菌產(chǎn)生耐藥性的特點,用中藥來治療豬腹瀉病,是生豬飼養(yǎng)業(yè)發(fā)展的大方向和迫切需求[3]。目前中藥治療豬腹瀉病主要集中于傳統(tǒng)中藥的研究,而對于藏藥研究較少,因此,本研究采用余甘子等藏藥來探討中藥治療豬腹瀉病的作用,以期尋找到更加有效的辦法來防治豬腹瀉病,滿足生豬飼養(yǎng)業(yè)發(fā)展的迫切需求。

1 材料與方法

1.1 材料

中藥余甘子、訶子、螃蟹甲、多刺綠絨蒿購自西南中草藥批發(fā)市場。參試細菌豬霍亂沙門氏菌、大腸桿菌(ETEC)為四川某豬場分離純化而得。

1.2 中藥制備方法

1.3 藥物最低抑菌濃度(MIC)

1.3.1 藥物貯存液制備

根據(jù)提取藥物溶解性等特點確定其濃度,并在4 ℃環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 培養(yǎng)基

豬霍亂沙門氏菌、大腸桿菌(ETEC)使用水解酪蛋白(MH)肉湯,pH為7.2～7.4。

1.3.3 接種物的制備

用接種環(huán)挑活化的形態(tài)相似待檢菌落3～5個,接種于4～5 mL的水解酪蛋白(MH)肉湯中,35 ℃孵育2～6 h。增菌后的對數(shù)生長期菌液用生理鹽水或MH肉湯校正濃度至0.5麥氏比濁標準,含(1～2)×108CFU/mL。用MH肉湯將上述菌懸液進行1：100稀釋后備用。在15 min內(nèi)接種完配制好的接種物,并取1份接種物在非選擇性瓊脂平板上傳代培養(yǎng),以檢查接種物純度。

1.3.4 稀釋抗菌藥物的制備及菌液接種

取無菌試管(13 mm×100 mm)9支,排成一排,除第1管加入1.5 mL MH肉湯外,其余每管加入MH肉湯1 mL,在第1管加入抗菌藥物原液0.5 mL混勻,然后吸取1 mL至第2管,混勻后再吸取1 mL至第3管,如此連續(xù)倍比稀釋至第8管,并從第8管中吸取1 mL棄去,第9管為不含藥物的生長對照。然后在每管內(nèi)加入上述制備好的接種物各1 mL,使每管最終菌液濃度約為5×105CFU/mL。

1.3.5 孵育

將接種好的稀釋管塞好塞子,置35 ℃普通空氣孵箱中孵育20 h;嗜血桿菌和鏈球菌在普通空氣孵箱中孵育24 h。

1.3.6 最低抑菌濃度(MIC)的測定

在讀取和報告所測試菌株的最低抑菌濃度前,檢查生長對照管的細菌生長情況是否良好,同時還要檢查接種物的傳代培養(yǎng)情況以確定其是否污染,質(zhì)控菌株的最低抑菌濃度值是否處于質(zhì)控范圍。以肉眼觀察,藥物最低濃度管無細菌生長者,即為受試菌的最低抑菌濃度[4-5]。

1.4 其他藥物與余甘子相互作用效果評價

采用分數(shù)抑菌濃度指數(shù)[6-7](fractional inhibitory concentration index,FICI)表示,即聯(lián)合用藥時該藥物的分數(shù)MIC值除以單獨用藥時藥物MIC值的商,表示為:FICI=聯(lián)合時分數(shù)MIC/單獨時MIC。

FICI<1為協(xié)同作用,FICI = 1為相加作用,1 2為拮抗作用。

2 結(jié)果

2.1 中藥制備

取余甘子、訶子粉末各100 g,用濾紙包好后,放入索氏抽提器中,加入中性去離子水索氏提取4～6 h,提取物用蒸發(fā)皿蒸干水分,分別得到深棕色的余甘子水提取物10.5 g、訶子水提取物10 g。余甘子水提取收率為10.5%,訶子水提取收率為10%。

稱取螃蟹甲、多刺綠絨蒿粉末各100 g,用濾紙包好后,放入索氏抽提器中,加入無水乙醇索氏提取6 h,提取物用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸干溶劑,得到深棕色的螃蟹甲醇提取物11 g、暗綠色的多刺綠絨蒿醇提取物10 g,螃蟹甲醇提取物收率為11%,多刺綠絨蒿醇提取物收率為10%。

2.2 最低抑菌濃度

根據(jù)余甘子水提取物的溶解性等特點,將余甘子水提取物用水稀釋至30.331 g/L,作為本次參試的藥物貯存液。

選用豬腹瀉病常見細菌豬霍亂沙門氏菌、大腸桿菌(ETEC)以及二者1：1的混合菌作為余甘子的抑菌試驗待試菌,進行最低抑菌濃度試驗。結(jié)果顯示:余甘子對它們有強烈的抑菌能力,對豬霍亂沙門氏菌,大腸桿菌(ETEC)以及二者1：1的混合菌的最低抑菌濃度均為1.516 5 mg/mL,具體如表1所示。

表1 參試藥物對豬腹瀉病常見細菌的最低抑菌濃度 單位:mg/mL

2.3 其他中藥對余甘子抑菌能力的協(xié)同作用

為了驗證其他中藥對余甘子抑菌能力的協(xié)同作用,根據(jù)它們的溶解性等特點,將訶子水提取物用水稀釋至60.645 g/L,螃蟹甲醇提取物用5%吐溫80水溶液稀釋至52.391 g/L,多刺綠絨蒿醇提取物用5%吐溫80水溶液稀釋至57.411 g/L。將這些溶液作為本次參試的藥物貯存液。選用豬腹瀉病常見細菌豬霍亂沙門氏菌、大腸桿菌(ETEC)以及二者1：1的混合菌作為余甘子和其他協(xié)同中藥的抑菌試驗待試菌,進行最低抑菌濃度試驗。

結(jié)果顯示:當余甘子/訶子/多刺綠絨蒿按1：3：1混合時,對豬霍亂沙門氏菌的最低抑菌濃度為0.060 7/0.363 9/0.103 3 mg/mL;對大腸桿菌(ETEC)的最低抑菌濃度為0.242 6/1.455 5/0.413 3 mg/mL;對二者1：1的混合菌的最低抑菌濃度為0.121 3/0.727 7/0.206 7 mg/mL。

當余甘子/訶子/螃蟹甲按1：3：1混合時,對豬霍亂沙門氏菌的最低抑菌濃度為0.242 6/1.455 5/0.471 5 mg/mL;對大腸桿菌(ETEC)的最低抑菌濃度為0.242 6/1.455 5/0.471 5 mg/mL;對二者1：1的混合菌的最低抑菌濃度為0.121 3/0.727 7/0.235 8 mg/mL。

當余甘子/訶子/螃蟹甲按1：2：1混合時,對豬霍亂沙門氏菌的最低抑菌濃度為0.189 6/0.758 1/0.322 9 mg/mL;對大腸桿菌(ETEC)的最低抑菌濃度為0.379 1/1.516 1/0.645 8 mg/mL;對二者1：1的混合菌的最低抑菌濃度為0.379 1/1.516 1/0.645 8 mg/mL。

當余甘子/訶子按1：2混合時,對豬霍亂沙門氏菌的最低抑菌濃度為0.337 0/1.347 7 mg/mL;對大腸桿菌(ETEC)的最低抑菌濃度為0.674 0/2.695 3 mg/mL;對二者1：1的混合菌的最低抑菌濃度為0.337 0/1.347 7 mg/mL。

當余甘子/訶子按1：1混合時,對豬霍亂沙門氏菌的最低抑菌濃度為0.758 3/1.516 1 mg/mL;對大腸桿菌(ETEC)的最低抑菌濃度為1.516 5/3.032 2 mg/mL;對二者1：1的混合菌的最低抑菌濃度為3.033 1/6.064 5 mg/mL。

當余甘子/多刺綠絨蒿按2：1混合時,對豬霍亂沙門氏菌的最低抑菌濃度為1.348 0/1.148 1 mg/mL;對大腸桿菌(ETEC)的最低抑菌濃度為1.348 0/1.148 1 mg/mL;對二者1：1的混合菌的最低抑菌濃度為2.696 1/2.296 3 mg/mL。

當余甘子/多刺綠絨蒿按1：1混合時,對豬霍亂沙門氏菌的最低抑菌濃度為6.066 2/10.333 3 mg/mL;對大腸桿菌(ETEC)的最低抑菌濃度為3.033 1/5.166 7 mg/mL。具體如表1所示。

為考察這些藥物對余甘子的相互作用,將這些數(shù)據(jù)進行抑菌分數(shù)濃度指數(shù)計算(見表2),結(jié)果發(fā)現(xiàn):當余甘子/訶子/多刺綠絨蒿和余甘子/訶子/螃蟹甲按1：3：1混合時,余甘子的分數(shù)抑菌濃度指數(shù)均小于1,說明這種組合的藥物對余甘子抑制豬腹瀉病原菌有協(xié)同作用。

表2 其他中藥與余甘子對豬腹瀉病常見細菌的抑菌指數(shù)

當余甘子/訶子/多刺綠絨蒿按1：2：1混合時,余甘子對豬霍亂沙門氏菌的分數(shù)抑菌濃度指數(shù)小于1,對大腸桿菌(ETEC)和二者1：1混合菌的分數(shù)抑菌濃度指數(shù)等于1,說明這種組合的藥物對余甘子抑制豬霍亂沙門氏菌有協(xié)同作用,對余甘子抑制大腸桿菌(ETEC)和二者1：1混合菌有相加作用。

當余甘子/訶子按1：2混合時,余甘子對豬霍亂沙門氏菌以及二者1：1混合菌的分數(shù)抑菌濃度指數(shù)小于1,對大腸桿菌(ETEC)的分數(shù)抑菌濃度指數(shù)大于1且小于2,說明此濃度組合下,訶子對余甘子抑制豬霍亂沙門氏菌以及二者1：1混合菌有協(xié)同作用,對余甘子抑制大腸桿菌(ETEC)無作用。

當余甘子/訶子按1：1混合時,余甘子對豬霍亂沙門氏菌的分數(shù)抑菌濃度指數(shù)等于1,對大腸桿菌(ETEC)和二者1：1混合菌的分數(shù)抑菌濃度指數(shù)大于1。說明該濃度組合下,訶子對余甘子抑制豬霍亂沙門氏菌有相加作用,對余甘子抑制大腸桿菌(ETEC)無作用,對二者1：1混合菌會產(chǎn)生拮抗作用。

當余甘子/多刺綠絨蒿按2：1和1：1混合時,余甘子對參試菌的分數(shù)抑菌濃度指數(shù)均大于1,特別是余甘子/多刺綠絨蒿按2：1混合時對1：1混合菌以及余甘子/多刺綠絨蒿按1：1混合對豬霍亂沙門氏菌和大腸桿菌(ETEC)的分數(shù)抑菌濃度指數(shù)均大于2。說明多刺綠絨蒿單獨對余甘子抑制豬腹瀉病常見細菌無作用甚至是拮抗作用。

綜上所述,訶子、螃蟹甲、多刺綠絨蒿與余甘子的多種藥物組合也有較強的抑菌作用,大部分能協(xié)同余甘子抑制豬腹瀉病常見細菌。這些發(fā)現(xiàn)對中藥防治豬腹瀉病打下堅實基礎(chǔ)。

3 討論

余甘子為大戟科葉下珠屬植物余甘子(PhyllanthusemblicaL.)的干燥成熟果實,具有清熱涼血、消食健胃和生津止咳的功效。現(xiàn)有研究證實70%乙醇提取物有較強的抑菌作用,抑菌活性強弱為:嗜熱脂肪芽孢桿菌>變形桿菌>金黃色葡萄球菌>大腸桿菌>枯草芽抱桿菌[8-9]。本次研究發(fā)現(xiàn),其水提取物同樣有較強的抑菌作用,其殺滅豬霍亂沙門氏菌、大腸桿菌(ETEC)以及二者1：1混合菌的活性相當。

訶子具有廣泛的抗微生物活性,對常見的人體致病菌均有抑制作用,對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌都有高度敏感性[10-11]。螃蟹甲為唇形科糙蘇屬植物螃蟹甲(PhlomisyounghusbandiiMukerjee)的干燥塊根,螃蟹甲干燥塊根水、乙醇提取物對耐亞胺培南銅綠假單胞菌具有明顯抗菌作用[12],其他未見報道。多刺綠絨蒿(MeconopsishorridulaHook.f.etThoms.)是罌粟科高山植物之一,主要分布在喜馬拉雅山脈地區(qū),具有接骨、活血化瘀、止痛的作用,為治頭創(chuàng)傷最有療效的藥物,藏醫(yī)多用于治療頭傷、骨折、跌打損傷等[13-14],但對細菌的抑制能力未見報道。本次研究發(fā)現(xiàn),余甘子的水提取物,螃蟹甲、多刺綠絨蒿乙醇提取物對豬腹瀉病常見細菌有較強的抑制作用。

4 結(jié)論

余甘子與螃蟹甲、多刺綠絨蒿、訶子多種藥物組合也有較強的抑菌作用,大多數(shù)能協(xié)同余甘子抑制豬腹瀉病病常見細菌。而不同的濃度組合,導(dǎo)致的藥物相互作用差距較大。余甘子/訶子/多刺綠絨蒿(1：3：1)和余甘子/訶子/多刺綠絨蒿(1：2：1),前者后兩種藥物能協(xié)同促進余甘子抑菌,而后者后2種藥物對余甘子抑制大腸桿菌(ETEC)和二者1：1混合菌有相加作用。余甘子/訶子(1：2)和余甘子/訶子(1：1),前者訶子對余甘子抑制豬霍亂沙門氏菌和1：1混合菌有協(xié)同作用,而后者訶子僅對余甘子抑制豬霍亂沙門氏菌有相加作用。這可能是由于這些藥物均對這些細菌有較強的抑制作用,而訶子/多刺綠絨蒿中的某些成分可能有助于提升余甘子的抑菌作用,其促進作用與藥物濃度有相關(guān)關(guān)系。