牛支原體病的診斷和防控措施

王鵬達(dá)

遼寧省凌源市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,遼寧 凌源 122500

0 引言

隨著國(guó)內(nèi)消費(fèi)者膳食結(jié)構(gòu)和消費(fèi)習(xí)慣的改變,牛肉、牛奶及其相關(guān)產(chǎn)品逐漸成為餐桌上必不可少的美食之一,在對(duì)其產(chǎn)品需求量不斷增加的同時(shí),一定程度上促進(jìn)了養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展壯大。但是在養(yǎng)殖過(guò)程中,廣大養(yǎng)殖戶也面臨一定的挑戰(zhàn),尤其是在牛只疫病方面,由支原體導(dǎo)致的呼吸道疾病就是常見(jiàn)的疫病之一。因此,做好牛支原體病的專(zhuān)業(yè)診斷、預(yù)防以及患病后的治療工作不僅能夠保證牛只的健康以及正常的生長(zhǎng)發(fā)育速度,還可以有效預(yù)防公共衛(wèi)生事故的發(fā)生?？茖W(xué)準(zhǔn)確地診斷是及時(shí)治療和科學(xué)預(yù)防的基礎(chǔ),在養(yǎng)殖過(guò)程中一定要使用先進(jìn)科學(xué)的診斷方式對(duì)此病作出判斷,采取及時(shí)的治療,并通過(guò)做好日常飼養(yǎng)管理工作來(lái)有效預(yù)防牛只發(fā)病,降低養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)損失,保障養(yǎng)殖效益。

1 病原

作為引起牛呼吸道疾病的重要病原之一,牛支原體不具備細(xì)胞壁,且是目前發(fā)現(xiàn)的能在無(wú)活細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行繁衍的最小的原核細(xì)胞。絲狀支原體絲狀亞種SC型、牛支原體、牛眼支原體、牛鼻支原體以及特異支原體等均屬于目前常見(jiàn)的引起牛只患病的支原體類(lèi)型。與其他支原體相比,對(duì)環(huán)境的抵抗力較強(qiáng),在避光的環(huán)境中可存活數(shù)周甚至數(shù)月,但是當(dāng)溫度達(dá)20 ℃時(shí)存活時(shí)間不超2周,當(dāng)溫度超過(guò)70 ℃時(shí)1 min 內(nèi)即可失活。

2 發(fā)病機(jī)理與傳播途徑

牛只感染后,支原體通過(guò)黏附在宿主細(xì)胞上而造成膜融合進(jìn)而進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi),入侵宿主細(xì)胞后能夠逃避宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答,與宿主細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)部分物質(zhì)的過(guò)程中造成宿主細(xì)胞功能的損傷以及破壞細(xì)胞完整性,并與其他病原微生物產(chǎn)生協(xié)同作用在宿主體內(nèi)繁殖,隨后牛只會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)癥狀。

呼吸道是此病的主要傳播途徑,還可通過(guò)乳汁和生殖道接觸進(jìn)行傳播。各年齡階段的肉牛、奶牛均可感染此病,但肉牛的易感性高于奶牛,且犢牛的易感性最強(qiáng)?；疾∨Ｖ灰约皫Ь呐Ｖ皇莻鞑ゴ瞬〉膫魅驹?。該病一年四季均可發(fā)生,且與養(yǎng)殖過(guò)程中的飼養(yǎng)管理因素密切相關(guān)。

3 臨床癥狀

患病牛只在臨床上表現(xiàn)為:精神萎靡、食欲不振,體溫升高達(dá)42 ℃,咳嗽嚴(yán)重且氣喘,鼻液膿性或者清亮,伴隨腹瀉且糞便中混有血液。部分患病牛只會(huì)出現(xiàn)跛行和關(guān)節(jié)腫脹甚至關(guān)節(jié)軟組織部位出現(xiàn)干酪樣的壞死,牛只不能正常行走而多跪地;部分患病牛出現(xiàn)結(jié)膜紅腫、眼部分泌物呈黏膿性或者漿液性、典型結(jié)膜炎;部分患病牛會(huì)出現(xiàn)乳房腫脹,分泌呈水樣的稀薄乳汁且其中夾雜著絮狀的沉淀;部分患病牛會(huì)出現(xiàn)中耳炎等。犢?；疾『蟮乃劳雎蔬_(dá)50%及以上[1]。

4 診斷方法

4.1 病原學(xué)診斷

此診斷方法是較為傳統(tǒng)經(jīng)典的診斷技術(shù),主要是采用微生物培養(yǎng)并在顯微鏡下觀察的方式進(jìn)行。首先需要在無(wú)菌條件下將采集的患病牛只的組織病料放在恒溫37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,以觀察有無(wú)病原菌的生長(zhǎng),48 h后可看到白色、針尖大小的菌落出現(xiàn)在培養(yǎng)基中;然后將其接種在鮮血瓊脂培養(yǎng)基,并將培養(yǎng)基放置在特定的條件下進(jìn)行培養(yǎng),可以觀察到油煎蛋型的菌落長(zhǎng)出,則說(shuō)明牛只感染了支原體;接著用姬姆薩染液和革蘭氏染色對(duì)從培養(yǎng)基中挑出的單個(gè)菌落進(jìn)行染色,同時(shí)使用光學(xué)顯微鏡對(duì)菌落形態(tài)進(jìn)行觀察,若在視野中觀察到了桿狀、球狀、不規(guī)則的菌體,則牛只可以確診為感染了支原體[2]。

4.2 免疫學(xué)診斷

常用的免疫學(xué)診斷方法包括免疫組化和印跡。這2種方法具有較強(qiáng)的特異性和敏感度,但是由于對(duì)采樣時(shí)的要求較高,且檢測(cè)時(shí)需要專(zhuān)業(yè)的切片設(shè)備及相關(guān)的抗體,故在基層養(yǎng)殖中應(yīng)用較少。其檢測(cè)原理是利用抗原抗體的特異性結(jié)合以及特殊的組織化學(xué)顯色反應(yīng)進(jìn)行的。

4.3 血清學(xué)診斷

常見(jiàn)的血清學(xué)診斷方法包括酶聯(lián)免疫吸附和膠體金方法。酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方式具有敏感性高、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)單快速、可進(jìn)行大批檢測(cè)的優(yōu)勢(shì),同時(shí)也能對(duì)乳品血清、血漿中的支原體進(jìn)行檢測(cè)。膠體金此檢測(cè)方式也具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)速度較快等優(yōu)勢(shì),且檢測(cè)效價(jià)可達(dá)1：106,在使用此技術(shù)的過(guò)程中不需要復(fù)雜昂貴的設(shè)備和專(zhuān)業(yè)的試驗(yàn)人員,故更適用于基層檢測(cè),其原理是使用示蹤物即膠體金,在抗原抗體結(jié)合過(guò)程中進(jìn)行免疫標(biāo)記。田可昕 等[3]建立了牛支原體抗體膠體金免疫層析法,牛支原體MilA基因重組蛋白、山羊抗家兔IgG分別為T(mén)線、C線,膠體金溶液用金黃色葡萄球菌蛋白A標(biāo)記,從而建立關(guān)于牛支原體抗體膠體金免疫層析試紙條,結(jié)果顯示此方法的檢測(cè)結(jié)果與ELISA檢測(cè)結(jié)果的符合率達(dá)到了90%以上。周華倩[4]也做了關(guān)于研制牛支原體抗體檢測(cè)膠體金免疫層析試紙條的相關(guān)試驗(yàn),研制出的試紙條在第14天的時(shí)候即可檢出牛支原體抗體,且與已經(jīng)商品化的試劑盒相比較,符合率均達(dá)90%以上。

4.4 分子生物學(xué)診斷

分子生物學(xué)檢測(cè)具有制作樣品快速、檢測(cè)效率高、檢測(cè)成本合理等優(yōu)勢(shì),故成為目前較為理想的檢測(cè)牛支原體的方式。常用的檢測(cè)牛支原體的分子生物學(xué)方法包括普通PCR、熒光定量PCR、多重PCR、等溫?cái)U(kuò)增等。

4.4.1 普通PCR

普通PCR是根據(jù)目前已經(jīng)具備的牛支原體靶基因(P48、P80、Polc等)而建立起來(lái)的檢測(cè)技術(shù)。包世俊 等[5]以牛支原體脂蛋白P48基因序列為基礎(chǔ),設(shè)計(jì)合成了具有特異性的引物,并為了獲得更好的檢測(cè)結(jié)果而對(duì)擴(kuò)增條件進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果表明,通過(guò)此種方式建立的PCR檢測(cè)技術(shù)能夠擴(kuò)增出牛支原體核酸樣品中的特異性目的片段,而對(duì)其他一些病原微生物(如多殺性巴氏桿菌、變形桿菌、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌等)的核酸樣品不能擴(kuò)增出明顯的條帶,且能夠檢測(cè)出較低濃度的支原體DNA。

4.4.2 熒光定量PCR

熒光定量PCR可以進(jìn)行定量分析,也是應(yīng)用較為廣泛的檢測(cè)方法。翟肖輝 等[6]建立了關(guān)于牛支原體的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),使用靶基因牛支原體P80,設(shè)計(jì)了特異性的引物和探針的同時(shí)優(yōu)化了反應(yīng)體系,之后檢測(cè)了此方法的特異性、敏感性和重復(fù)性,發(fā)現(xiàn)所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的敏感性是普通PCR技術(shù)的104倍,變異系數(shù)小于1%。

4.4.3 多重PCR

多重PCR既能檢測(cè)不同樣品(如牛鼻拭子、牛奶、精液)中同一種病原體(如牛支原體),又能夠檢測(cè)同一樣品中的不同病原體,例如引起牛呼吸道疾病的牛支原體、多殺性巴氏桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌等,具有鑒別診斷、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn),且技術(shù)加樣、運(yùn)行程序均僅需1次即可。楊莉 等[7]建立了三重PCR快速檢測(cè)技術(shù),所檢測(cè)的病原微生物分別為牛支原體、多殺性巴氏桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌,根據(jù)3種已知病原微生物的基因序列分別設(shè)計(jì)了特異性引物,并使單一PCR檢測(cè)方法優(yōu)化后建立了三重PCR技術(shù),最終得到的新建立的三重PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)的特點(diǎn),能夠檢測(cè)同一樣品中3種病原菌,且三重PCR的檢測(cè)結(jié)果與單一PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)果的符合率達(dá)100%,所建立的三重PCR技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)直接出結(jié)果、縮短病原微生物分離培養(yǎng)時(shí)間、快速診斷的目標(biāo)。

5 治療方案

5.1 西藥治療方案

方案1:根據(jù)患病牛只的體質(zhì)量,將青霉素4萬(wàn)IU/kg、鏈霉素3.5萬(wàn)IU/kg這2種藥物混合均勻后以肌內(nèi)注射的方式進(jìn)行治療,2次/d,連用5～7 d即可。

方案2:按照患病牛只體質(zhì)量使用10～25 mg/kg的土霉素對(duì)其進(jìn)行治療,同時(shí)使用0.5～1 L濃度為5%的葡萄糖溶液以靜脈注射的方式進(jìn)行治療,2次/d,連用3 d。

5.2 中藥治療方案

大黃40 g,金銀花、黃連、大青葉、梔子、郁金、浙貝母、知母、板藍(lán)根、葶藶子和黃芩各30 g,白芷、穿心蓮和天花粉各25 g,白礬和白芷各20 g,甘草15 g,分別稱取上述17味中藥后放入砂鍋中,再加入適量的水進(jìn)行煎煮,然后將藥渣去除,等冷卻至室溫后分為3等分,分早中晚3次對(duì)患病牛只進(jìn)行灌服,連用3 d[8]。

6 防控措施

6.1 加強(qiáng)飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)管理的好壞與各種疫病的發(fā)生密切相關(guān),故在日常養(yǎng)殖中加強(qiáng)飼養(yǎng)管理是預(yù)防各種疾病的第1道防線。首先,要做好圈舍的清潔衛(wèi)生與環(huán)境控制,通過(guò)每日清掃糞尿、定期消毒等措施及時(shí)將各種污染物清除,破壞病原微生物適合繁殖的環(huán)境;每日保持良好的通風(fēng)換氣,保證空氣質(zhì)量,避免由空氣造成疫病的傳播;及時(shí)更換牛只所需的墊料,避免墊料發(fā)霉變質(zhì)后導(dǎo)致病原的滋生;夏季安裝風(fēng)扇、冬季使用取暖設(shè)備等措施來(lái)提供溫度適宜的環(huán)境,避免造成牛只的冷熱應(yīng)激。其次,要做好工作人員和進(jìn)出車(chē)輛的管理,對(duì)于廠區(qū)的工作人員,要定期進(jìn)行健康檢查,并要求工作期間統(tǒng)一著裝,進(jìn)入圈舍要進(jìn)行消毒;對(duì)于進(jìn)入廠區(qū)的外來(lái)人員和車(chē)輛,原則上是非必要不入內(nèi),確需進(jìn)入廠區(qū)時(shí)要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的消毒。最后,要對(duì)不同性別、年齡階段的牛只進(jìn)行分群飼養(yǎng),這樣才能夠根據(jù)各階段牛只的生理特點(diǎn)提供營(yíng)養(yǎng)全面的飼料;要保證牛只充足的活動(dòng)空間,進(jìn)而通過(guò)適量的運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)自身的免疫力和抵抗力,預(yù)防疫病的發(fā)生。

6.2 定期免疫接種

免疫接種是預(yù)防各種疾病最直接、最有效的手段之一,甚至是清除牛支原體的最好方式。目前預(yù)防牛支原體的疫苗有滅活疫苗、弱毒活疫苗等。滅活疫苗具有使用較為安全、制備工藝簡(jiǎn)單、免疫原性穩(wěn)定的特點(diǎn),按照2.0 mL/頭劑量將滅活疫苗以牛頸部皮下注射的方式進(jìn)行接種,21 d后再進(jìn)行1次加強(qiáng)接種,免疫效果可持續(xù)6個(gè)月。弱毒活疫苗具有生產(chǎn)成本低廉、無(wú)需多次免疫等特點(diǎn),目前P150作為生產(chǎn)弱毒活疫苗的候選株。

6.3 嚴(yán)格引種程序

廣大養(yǎng)殖場(chǎng)盡量堅(jiān)持自繁自養(yǎng)的基本原則,減少引種,確需引種時(shí)要做好引種的檢疫隔離工作。引種時(shí)要做好以下幾點(diǎn)工作。首先,要確定引種地區(qū)和引入牛只的檔案情況,嚴(yán)禁從疫區(qū)進(jìn)行引種,并在引種前做好牛只的健康檢查以及檔案查閱,包括疫苗接種情況 、使用藥物情況等,確保安全后再進(jìn)行引種。其次,要做好引種前的準(zhǔn)備工作,轉(zhuǎn)運(yùn)車(chē)輛要進(jìn)行嚴(yán)格的消毒并鋪好墊草;確定引種時(shí)的天氣情況,避免溫度過(guò)高或過(guò)低而加重牛只應(yīng)激;盡量縮短牛只運(yùn)輸?shù)木嚯x和時(shí)間,避免在運(yùn)輸途中造成傷亡。最后,要做好引種后的隔離,新引入的牛只需要在廠區(qū)外單獨(dú)飼養(yǎng)1個(gè)月,期間需要進(jìn)行多次檢疫,確保未攜帶病原微生物后再混入原群進(jìn)行統(tǒng)一飼養(yǎng)。

7 結(jié)束語(yǔ)

牛支原體的發(fā)生會(huì)在一定程度上阻礙牛只的生長(zhǎng)發(fā)育,甚至威脅牛只的生命健康,也會(huì)加大養(yǎng)殖戶的疫病防控壓力并增加治療成本。因此,廣大養(yǎng)殖戶要掌握牛支原體的常見(jiàn)診斷方式,一旦發(fā)現(xiàn)可疑病牛就要進(jìn)行準(zhǔn)確診斷,便于后期及時(shí)進(jìn)行針對(duì)性治療。在日常養(yǎng)殖過(guò)程中,廣大養(yǎng)殖戶可以通過(guò)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、定期免疫接種以及嚴(yán)格引種程序等措施來(lái)降低牛支原體的發(fā)生,保障牛只健康,降低養(yǎng)殖戶的損失,增加經(jīng)濟(jì)效益。