唾液腺腺樣囊性癌患者的MAPK、MMP-2和MMP-9 及CD147 表達(dá)和價(jià)值

侯翌杰，何志超，夏苗

1.甘肅醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，甘肅平?jīng)?744000；2.甘肅醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，甘肅平?jīng)?744000

腺樣囊性癌占所有唾液腺惡性腫瘤的21%～24%，具有侵襲性強(qiáng)、惡性程度高、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高等特點(diǎn)，調(diào)查顯示其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率可達(dá)40%，增加死亡風(fēng)險(xiǎn)[1-2]。因此，積極診治唾液腺腺樣囊性癌尤為重要。近年來(lái)，外科手術(shù)聯(lián)合放療方案已成為治療腺樣囊性癌的理想方法，近遠(yuǎn)期效果顯著，存活率高[3-4]。值得注意的是，腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程尤具復(fù)雜性，特別是細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜的降解，參與了腫瘤的繁殖、生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移過(guò)程[5-6]。本研究選取2020 年2 月—2022 年2 月甘肅醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院接診的20 例唾液腺腺樣囊性癌患者為研究對(duì)象，探究絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase, MAPK）、基 質(zhì) 金 屬 蛋 白 酶-2 （matrix metallo proteinase, MMP-2）、微血管密度（microvessel density, MVD）、細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer,CD147）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metallo proteinase, MMP-9）特點(diǎn)及臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇本院接診的20 例唾液腺腺樣囊性癌患者，將手術(shù)切除的腺樣囊性癌組織設(shè)為A 組，包括男12例、女8 例；年齡29～70 歲，平均（43.49±4.25）歲。另外選擇同期健康體檢者20 例為B 組（正常唾液腺組織），包括男14 例、女6 例；年齡31～70 歲，平均（44.15±5.03）歲。兩組基線資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究取得醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，且入組對(duì)象知曉研究并主動(dòng)參與。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：病例資料完整；結(jié)合臨床表現(xiàn)、病理檢查等確診為唾液腺腺樣囊性癌。

排除標(biāo)準(zhǔn)：心理疾患、占位性病變、重要臟器功能衰竭等；術(shù)前接受放療、化療及其他相關(guān)抗腫瘤治療；結(jié)合影像學(xué)檢查確診腺樣囊性癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

1.3 方法

1.3.1 試劑及儀器 SP 免疫組化試劑盒、DAB 顯色試劑盒、鼠抗人CD147 單克隆抗體、鼠抗人MMP-2單克隆抗體、MMP-9 兔抗人多克隆抗體、蘇木精復(fù)染液、磷酸化MAPK（p-JNK、p-P38）等。

1.3.2 免疫組化方法 標(biāo)本經(jīng)甲醛溶液固定、石蠟包埋等處理后，制成切片（厚度4 μm），再進(jìn)行防脫片處理。按照SP 免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)，測(cè)定石蠟標(biāo)本切片內(nèi)MMP-2、MMP-9 的表達(dá)。預(yù)試驗(yàn)，確定合適的一抗稀釋濃度，1:200、1:200、1:150、1:100、1:75。經(jīng)枸櫞緩沖液微波加熱處理，抗原修復(fù)15 min 后進(jìn)行 DAB 顯色。再進(jìn)行蘇木精復(fù)染、脫水、封片。

1.3.3 結(jié)果判定 同一組醫(yī)生進(jìn)行閱片，給出最終結(jié) 論。MMP-2、CD147、MMP-9 蛋 白 在 細(xì) 胞 質(zhì) 及（或）間質(zhì)著色，參考相關(guān)文獻(xiàn)予以評(píng)分，即備好切片，借助400 倍鏡作用，從中采集10 個(gè)視野，至少含有200 個(gè)細(xì)胞，對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行計(jì)算、統(tǒng)計(jì)。判定標(biāo)準(zhǔn)如下：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞：陰性（-）；弱陽(yáng)性（+）:r＜10%；陽(yáng)性（++）:10%≤r＜50%；強(qiáng)陽(yáng)性（+++）：r在50%及以上。陽(yáng)性細(xì)胞率＝[（弱陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)+陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)+強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)）/計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)]×100%。

MVD 的計(jì)算：直徑＞10 個(gè)紅細(xì)胞的血管不進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)方法：在低倍鏡作用下觀察切片，確定高血管密度區(qū)（熱點(diǎn)），再經(jīng)高倍鏡作用，確定被染成棕黃色的血管數(shù)目，并計(jì)數(shù)4 個(gè)高倍鏡視野下血管數(shù)目，取平均值。

1.4 觀察指標(biāo)

比 較A 組 與B 組MMP-2、MMP-9、MVD、CD147、MAPK 及 其c-Jun N-末 端 激 酶（Jun Nterminal kinase，JNK）、馬氏珠母貝絲裂原活化蛋白激酶p38（PmMAPK，p-P38）表達(dá)水平，以及A 組中MMP-2、MMP-9 、MVD 、CD147 及MAPK（p-JNK、p-P38）的相關(guān)性分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以(±s)表示，行t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 A 組與B 組MMP-2、MMP-9、MVD 、CD147及MAPK（p-JNK、p-P38）表達(dá)水平的比較

A 組MMP-2、MMP-9、MVD、CD147 表達(dá)水平高于B 組，MAPK（p-JNK、p-P38）表達(dá)水平低于B 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 A 組與B 組MMP-2、MMP-9、MVD 、CD147 及MAPK（p-JNK、p-P38）表達(dá)水平的比較(±s)

表1 A 組與B 組MMP-2、MMP-9、MVD 、CD147 及MAPK（p-JNK、p-P38）表達(dá)水平的比較(±s)

組別A 組（n=20）B 組（n=20）t 值P 值MMP-2（ng/mL）3.09±0.87 1.31±0.49 7.972＜0.001 MMP-9（ng/mL）8.11±1.75 1.45±0.51 16.340＜0.001 MVD 值（%）20.13±4.40 4.75±1.41 14.886＜0.001 CD147 0.59±0.17 0.15±0.07 10.703＜0.001 MAPK p-JNK 0.67±0.05 1.05±0.07 19.755＜0.001 p-P38 0.31±0.03 0.97±0.05 50.620＜0.001

2.2 A 組 中MMP-2、MMP-9、MVD、CD147 及MAPK（p-JNK、p-P38）的相關(guān)性分析

將p-JNK、p-P38 以陽(yáng)性強(qiáng)度分組，形成p-JNK陰性/陽(yáng)性組，p-P38 陰性/陽(yáng)性組；p-JNK 陽(yáng)性/陰性組中，MMP-9、MVD 水平情況相近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；p-JNK 陽(yáng)性組中，MMP-2、CD147 水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；p-P38 陽(yáng)性/陰性組中，MMP-2、MMP-9、MVD 水平相近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），CD147 水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。經(jīng)Spearman 系數(shù)顯示，p-JNK 與MMP-2、CD147 存在相關(guān)性（P＜0.001），p-P38 與CD147 存在相關(guān)性（P＜0.001），見(jiàn)表3。

表2 p-JNK、p-P38 陰性/陽(yáng)性中MMP-2、MMP-9、MVD 表達(dá)情況(±s)

表2 p-JNK、p-P38 陰性/陽(yáng)性中MMP-2、MMP-9、MVD 表達(dá)情況(±s)

指標(biāo)p-JNK p-P38組別陽(yáng)性（n=14）陰性（n=6）t 值P 值陽(yáng)性（n=18）陰性（n=2）t 值P 值MMP-2（ng/mL）8.41±1.11 4.21±0.51 8.775 0.001 7.15±1.03 6.37±0.89 1.023 0.320 MMP-9（ng/mL）136.41±29.33 135.19±27.61 0.087 0.932 134.37±26.21 133.59±24.41 0.040 0.968 MVD 值（%）2.89±0.49 2.77±0.53 0.490 0.630 2.83±0.45 2.71±0.49 0.356 0.726 CD147 0.71±0.25 0.25±0.11 4.281＜0.001 0.63±0.17 0.23±0.09 3.222 0.005

表3 A 組中MMP-2、MMP-9、MVD、CD147 及MAPK（p-JNK、p-P38）的相關(guān)性分析

3 討論

唾液腺腺樣囊性癌發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，具有生長(zhǎng)緩慢、廣泛侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高、局部復(fù)發(fā)高等特點(diǎn)，可危及生命[7-9]。研究指出，在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中病灶對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)成分、基底膜的降解占據(jù)了重要的地位，尤其是基質(zhì)金屬蛋白酶家族對(duì)細(xì)胞基底膜、細(xì)胞外基質(zhì)的降解作用[10]。目前，MMP-9、MMP-2 被認(rèn)為與腫瘤的侵襲、生長(zhǎng)相關(guān)，前者是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員之一；后者可使基底膜、包繞腫瘤的基質(zhì)降解，促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及血管的生成、毛細(xì)血管的增生[11-12]。CD147 作為一種糖蛋白，既能誘導(dǎo)腫瘤周圍間質(zhì)成纖維細(xì)胞，刺激MMPs 的大量分泌，又能降解細(xì)胞的基質(zhì)、基底膜。MVD 是腫瘤血管新中的敏感性指標(biāo)。正常成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)MVD 呈弱表達(dá)，而增殖血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的MVD 呈過(guò)度表達(dá)。MAPK 是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者。MAPK 信號(hào)通路分布在大多細(xì)胞內(nèi)，類型較多，如P38、JNK 等[13]。MAPK 在激素、細(xì)胞因子等不同細(xì)胞外因子刺激作用下可使細(xì)胞增殖、分化、遷移[14]。目前，MAPK 通路是研究最多的激酶通路，其中細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶ERIC、p38 激酶參與調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，尤其是p38 激酶，能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖。

本研究結(jié)果顯示，A 組MVD、CD147、MMP-2及MMP-9 表達(dá)水平較B 組高，MAPK（p-JNK、p-P38）表達(dá)水平低于B 組，說(shuō)明了MMP-2、MMP-9、MVD、CD147 及MAPK（p-JNK、p-P38）變化參與了唾液腺腺樣囊性癌患者的發(fā)生、發(fā)展。細(xì)胞株中的細(xì)胞外刺激因子可使ERIK 激活，以及調(diào)節(jié)下游目的基因，促進(jìn)MMP-2、MMP-9 的分泌，二者均是唯一可降解IV 型膠原的基質(zhì)蛋白酶5，也可促進(jìn)新生血管的生成，以為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供條件，使腫瘤侵襲進(jìn)、轉(zhuǎn)移。因此，認(rèn)為激活MAPIK 信號(hào)通路，以及上調(diào)MMP-2、MMP-9、CD147、MVD 的高表達(dá)，可加快患者病情進(jìn)展。經(jīng)Spearman 系數(shù)顯 示，經(jīng)Spearman 系 數(shù) 顯 示，A 組 與MMP-2、CD147 存在相關(guān)性（r=0.584、0.687，P＜0.001），p-P38 與CD147 存在相關(guān)性（r=0.650，P＜0.001），與張彬等[15]提出的研究成果相符，p-P38 與MMP-2、MMP-9 表達(dá) 呈 正 相 關(guān)(r=0.824、0.768），p-JNK 與MMP-2、MMP-9 表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.581、0.604)，充分證實(shí)了本研究結(jié)論的真實(shí)性、可靠性，也說(shuō)明了MAPK/ MMPs 通路參與了唾液腺腺樣囊性癌的侵襲、轉(zhuǎn)移復(fù)雜過(guò)程，為此建議以此為治療靶點(diǎn)，選擇合理的治療方法，確保提高臨床療效，延長(zhǎng)患者生存期限。

綜 上 所 述，MMP-2、MMP-9、CD147、MVD 及MAPK（p-JNK、p-P38）在唾液腺腺樣囊性癌患者中呈高表達(dá)，與唾液腺腺樣囊性癌呈正相關(guān)。