超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)分析金銀花中多組分含量

錢桂英 錢云英 吳曉明 金鳳珠

摘要：建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定金銀花中9種主要成分的方法。采用負離子掃描方式，對主要成分進行化學(xué)計量學(xué)分析。色譜分離采用 Thermo Hypersil GOLD 色譜柱，柱溫35 ℃。流動相由甲醇和 0.2% 甲酸水溶液組成，結(jié)合聚類熱圖分析和主成分分析對金銀花進行綜合分析。結(jié)果表明： 9個化合物峰面積與濃度之間具有良好的線性關(guān)系（R2>0.999 1），日內(nèi)精密度（0.96%～2.26%）、日間精密度（0.52%～3.04%）和穩(wěn)定性（0.85%～2.15%）均符合相對標(biāo)準(zhǔn)偏差；回收率在96.77%～101.94%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.48%～4.01%之間；層次聚類分析和主成分分析在內(nèi)的化學(xué)計量學(xué)結(jié)果表明，不同地區(qū)的金銀花活性成分含量存在明顯差異，3-O-咖啡?？鼘幩岷?，5-二咖啡?？鼘幩釣樨暙I最大的化合物。該研究可為進一步開展金銀花有效成分及相關(guān)量效關(guān)系、相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供參考。

關(guān)鍵詞：金銀花；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；化學(xué)計量學(xué)；多成分；含量測定

中圖分類號：R284.1?? 文獻標(biāo)志碼：A?? 文章編號：1002-4026（2023）05-0001-08

Analysis of the contents of active ingredients in Lonicerae japonicae flos based on UPLC-MS/MS combined with chemometrics

QIAN Guiying， QIAN Yunying， WU Xiaoming， JIN Fengzhu*

（Changshu Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine， Changshu 215500， China）

Abstract∶This study aimed to devise a methodology for the simultaneous determination of the contents of nine primary components in Lonicerae japonicae flos through ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）. The chemometric analysis of the nine primary components was performed via negative ion scanning. Further， chromatographic separation was performed on a Thermo Hypersil GOLD column at a temperature of 35 ℃. The mobile phase comprised methanol and water containing 0.2% formic acid， as determined through the cluster thermogram and principal component analyses of Lonicerae japonicae flos. The peak areas with concentrations of nine components exhibited a good linear relationship （R2>0.999 1）， and the intraday （0.96%～2.26%） and interday （0.52%～3.04%） precisions and stability values （0.85%～2.15%） agreed well with relative standard deviation （RSD）. The recovery rate was between 96.77% and 101.94%， and the RSD was between 2.48% and 4.01%. The results of the chemometric， hierarchical cluster， and principal component analyses revealed that there were considerable differences in the contents of the active ingredients of Lonicerae Japonicae Flos from various regions， and 3-O-caffeoylquinic acid and 3，5-dicaffeoylquinic acid were considered as the dominant compounds. UPLC-MS/MS quantitative and chemometric analyses of Lonicerae Japonicae Flos performed herein may provide a reference for the modernization of and innovative research on the effective ingredients of Lonicerae Japonicae Flos and related quantity effect relations as well as the quality control of related products.

Key words∶Lonicerae japonicae flos; UPLC-MS/MS; chemometrics; multicomponent; assay

金銀花是忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb. 的干燥花蕾或帶初開的花，原產(chǎn)于中國，大約1 500 年前，在現(xiàn)今的河南等地大量種植[1]，常用于治療癰腫疔瘡、咽喉麻木、丹毒、血毒毒痢、風(fēng)熱感冒、溫?zé)岬取，F(xiàn)代藥理研究表明，金銀花具有抗炎、抗氧化、保肝、細胞保護、抗菌、抗糖尿病和抗乙型肝炎病毒等活性，化學(xué)成分為黃酮類、環(huán)烯醚萜類、三萜皂苷、生物堿等[2-4]。目前，金銀花種植區(qū)主要集中在山東、山西、河南、河北、湖北、江西、廣東等地，由于地理條件、氣候等原因，每個產(chǎn)地的金銀花主要有效成分的含量存在差異，功效也會有所不同[5-7]。金銀花中發(fā)揮抗菌和抗炎作用的主要成分是黃酮類和酚酸類物質(zhì)，2020版《中國藥典》中還規(guī)定了其指標(biāo)成分為3-O-咖啡?？鼘幩岷湍鞠菟豙8]。因此，有必要以酚酸類和黃酮類物質(zhì)為指標(biāo)，對金銀花進行質(zhì)量控制。目前，高效液相色譜（HPLC）為測定中藥成分含量的常用手段。隨著超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）的出現(xiàn)，其高選擇性、高靈敏度使中藥定量分析技術(shù)更加成熟并得到廣泛應(yīng)用[9-12]。金銀花目前的質(zhì)量控制研究重點在其化學(xué)成分的種類和含量，控制技術(shù)主要有HPLC法、UPLC法、UPLC-MS聯(lián)用、一測多評等；除了在有效成分的含量上控制，有害成分如重金屬和農(nóng)藥殘留等控制標(biāo)準(zhǔn)均有報道[13-14]。在本文中，建立了 UPLC-MS/MS 方法測定來自 10 個不同地區(qū)的金銀花的有效成分含量，在負離子掃描模式下，測定了9種抗菌消炎的主要成分，對 10 批樣品進行了化學(xué)計量學(xué)分析，以期為金銀花的有效成分及相關(guān)量效關(guān)系、相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

UPLC-TSQ QUANTIS三重四極桿質(zhì)譜系統(tǒng)（Thermo Scientific），JA203H型十萬分之一電子天平（常州市幸運電子設(shè)備有限公司），KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器（青島精誠儀器儀表有限公司），DZKW-C型水浴鍋（河南沃林儀器設(shè)備有限公司）。

HPLC級甲醇（Fisher Scientific），HPLC 級甲酸（Sigma），蒸餾水（杭州娃哈哈集團）。所有其他試劑均為分析純。10批次的金銀花信息見表1。所有樣品由南京中醫(yī)藥大學(xué)常熟附屬醫(yī)院主任中藥師金鳳珠鑒定為金銀花正品。3，4-二羥基苯甲酸（批號SH-211102）、5-O-咖啡?？鼘幩幔ㄅ朣H-211021）、3-O-咖啡?？鼘幩幔ㄅ朣H-220321）、4-O-咖啡?？鼘幩幔ㄅ朣H-220122）購自上海源葉生物科技有限公司?？Х人幔ㄅ?10885-201703）、3，5-二咖啡?？鼘幩幔ㄅ?11782-202208）、木犀草苷（批號111720-202111）、蘆?。ㄅ?00080-202012）、4，5-二咖啡?？鼘幩幔ㄅ?11894-202205）、標(biāo)準(zhǔn)品酸和內(nèi)標(biāo)氯霉素（批號130303-202115）購自中國食品藥品檢定研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備

金銀花粉末過60目篩，取粉末0.05 g，加入10 mL甲醇， 35 Hz超聲提取30 min。然后將樣品以5 000 r/min[JP]離心15 min，取上清液，0.22 μm濾膜過濾，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 對照品溶液制備

9種標(biāo)準(zhǔn)品適量溶解于甲醇中制備儲備液（質(zhì)量濃度均為 1.00 mg/mL）。

2.3 分析條件

色譜條件：采用Thermo Hypersil GOLD 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm），柱溫35 ℃。流動相由甲醇（A）和0.2%甲酸水（B）組成。梯度洗脫：0～6 min，90%～83% B；6～7min，83%～60% B；7～12 min，60%～50% B；12～13 min，50%～90% B；13～15 min，90% B。流速為0.3 mL/min，進樣體積為2 μL。

質(zhì)譜條件：所有樣品均在負離子模式下進行分析。分析方法采用多反應(yīng)監(jiān)測的選擇性反應(yīng)模式（MRM）。優(yōu)化參數(shù)設(shè)置如下：鞘氣30 kPa；輔助氣10 kPa；吹氣：0 kPa，離子傳輸管溫度325 ℃，蒸發(fā)器溫度350 ℃，各組分監(jiān)測條件見表2。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性考察

取供試品溶液、混合對照品溶液適量，按2.3項下色譜和質(zhì)譜條件進樣分析，負離子模式下采集數(shù)據(jù)。根據(jù)離子對，樣品與對照品的保留時間，質(zhì)譜信息保持一致，待測成分分離效果良好，無干擾，結(jié)果見圖1。

2.4.2 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對照品母液溶液，用溶劑稀釋至不同濃度后依次進行分析，記錄峰面積，以峰面積 （Y） 為縱坐標(biāo)，進樣濃度 （X） 為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程，結(jié)果見表3。

2.4.3 精密度試驗

取同一份混合對照品溶液，1 d內(nèi)連續(xù)進樣6 次，記錄峰面積，測得日內(nèi)精密度3，4-二羥基苯甲酸、5-O-咖啡?？鼘幩帷?-O-咖啡?？鼘幩?、咖啡酸、4-O-咖啡?？鼘幩?、3，5-二咖啡?？鼘幩?、木犀草苷、蘆丁及4，5-二咖啡?？鼘幩嵯鄬?biāo)準(zhǔn)偏差δRSD分別為1.79%、1.92%、2.13%、0.96%、1.93%、2.26%、1.93%、1.60%、1.92%；每天進樣3次，連續(xù)進樣3 d，測定日間精密度δRSD分別為0.85%、1.10%、2.12%、1.37%、0.52%、0.63%、1.29%、1.66%、3.04%。表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗

取樣品（S1）按2.1項下方法制備供試品溶液，室溫放置，分別于0、2、4、8、12、24 h 進行測定，3，4-二羥基苯甲酸、5-O-咖啡?？鼘幩?、3-O-咖啡酰奎寧酸、咖啡酸、4-O-咖啡?？鼘幩?、3，5-二咖啡?？鼘幩?、木犀草苷、蘆丁及4，5-二咖啡酰奎寧酸峰面積的δRSD分別為0.85%、0.90%、1.32%、0.97%、2.15%、0.98%、0.96%、1.30%、1.74%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗

取樣品（S1），按2.1項下方法平行制備6份供試品溶液，以2.3項下色譜條件進行測定，得3，4-二羥基苯甲酸、5-O-咖啡?？鼘幩?、3-O-咖啡?？鼘幩帷⒖Х人?、4-O-咖啡酰奎寧酸、3，5-二咖啡酰奎寧酸、木犀草苷、蘆丁及4，5-二咖啡?？鼘幩岬钠骄糠謩e為20.12 μg/g（δRSD=2.26%）、2 431.45 μg/g（δRSD=3.21%）、22 146.58 μg/g（δRSD= 2.71%）、34.03 μg/g（δRSD=2.57%）、878.64 μg/g（δRSD=2.62%）、1 347.08 μg/g（δRSD= 2.39%）、68.49 μg/g（δRSD= 2.76%）、69.42 μg/g（δRSD=3.32%）及2 212.44 μg/g（δRSD=2.31%），表明重復(fù)性良好。

2.4.6 加標(biāo)回收率試驗

精密稱取已知含量樣品（S1）0.05 g，共6 份，按100%的量各加入3，4-二羥基苯甲酸、5-O-咖啡酰奎寧酸、3-O-咖啡?？鼘幩帷⒖Х人?、4-O-咖啡酰奎寧酸、3，5-二咖啡?？鼘幩?、木犀草苷、蘆丁及4，5-二咖啡?？鼘幩釋φ掌返幕旌先芤海?.1項下方法制備供試品溶液，按2.4項下色譜條件進行測定，計算加樣回收率，得3，4-二羥基苯甲酸、5-O-咖啡?？鼘幩?、3-O-咖啡?？鼘幩帷⒖Х人?、4-O-咖啡?？鼘幩?、3，5-二咖啡?？鼘幩?、木犀草苷、蘆丁及4，5-二咖啡?？鼘幩崞骄厥章试?6.77%～101.94%，δRSD在2.48%～4.01%（均低于5.0%），表明方法的準(zhǔn)確度符合要求，結(jié)果見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附表1。

2.5 樣品含量測定

取10批樣品，按2.1項下方法制備供試品溶液，按2.3項下條件進行分析，計算含量，結(jié)果見表4。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

以9個化合物為指標(biāo)成分進行聚類分析和熱圖分析，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示10批次樣品被分成許多簇，說明即使是同一種中藥，其含量在不同產(chǎn)地之間也存在較大差異。在熱圖中，可以觀察到3-O-咖啡酰奎寧酸和3，5-二咖啡酰奎寧酸是樣品的主要成分。

主成分分析如圖3所示，S7和S9樣品與其他批次樣品存在顯著差異，這與定量分析中S7類黃酮含量較高和S9酚酸含量較高的結(jié)果一致。此外，3-O-咖啡?？鼘幩岬呢暙I率為97%，3，5-二咖啡?？鼘幩岬呢暙I率為2%，3-O-咖啡?？鼘幩岷?，5-二咖啡?？鼘幩岬睦塾嬝暙I率達到99%，表明3-O-咖啡?？鼘幩岷?，5-二咖啡?？鼘幩崾墙疸y花的主要成分，此結(jié)果與熱圖的結(jié)果一致。

3 討論與結(jié)論

為了獲得高質(zhì)量分數(shù)的樣品溶液，我們進行了提取優(yōu)化試驗。首先，研究了9種化合物在不同溶劑中的提取效率，以最大限度地提高化合物的質(zhì)量分數(shù)。用4種不同比例的甲醇溶液（甲醇體積分數(shù)分別為100%、85%、70%、50%）和4種不同比例的乙醇溶液（乙醇體積分數(shù)分別為100%、85%、70%、50%）超聲提取60 min。發(fā)現(xiàn)100%甲醇作為溶劑時，9種成分的提取效率最好。其次，為了獲得更好的提取效果，考察了提取時間對9種化合物提取效率的影響，進行超聲提取30、45、60、90 min，發(fā)現(xiàn)提取時間對結(jié)果沒有顯著差異，因此，選擇30 min的最短提取時間。此外，我們選擇了 Thermo Hypersil GOLD 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）和 Waters Acquity UHPLC HSS T3 色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）。在相同柱溫、流動相和梯度洗脫條件下，Thermo Hypersil GOLD 色譜柱具有更好的分離效果、更好的峰形和更短的保留時間。因此，我們選擇了 Thermo Hypersil GOLD 色譜柱進行分離。

在本研究中，建立了一種 UPLC-MS/MS 方法，用于快速同時測定金銀花中的 9 種化合物。經(jīng)驗證該方法具有良好的精密度、準(zhǔn)確度、重復(fù)性和穩(wěn)定性。以9個化合物為指標(biāo)成分進行聚類分析和熱圖分析，結(jié)果顯示10批次樣品被分成許多簇，說明即使是同一種中藥，其含量在不同產(chǎn)地之間也存在較大差異。在熱圖中，可以觀察到3-O-咖啡酰奎寧酸和3，5-二咖啡?？鼘幩崾菢悠返闹饕煞帧；瘜W(xué)計量學(xué)結(jié)果表明，金銀花的區(qū)域差異很大，9種化合物中3-O-咖啡?？鼘幩岷?，5-二咖啡?？鼘幩岬睦塾嬝暙I率達到99%。綜上所述，UPLC-MS/MS結(jié)合化學(xué)計量學(xué)是一種簡單有效的控制金銀花品質(zhì)的方法，該研究為金銀花的可持續(xù)發(fā)展奠定了理論基礎(chǔ)，為中藥的綜合開發(fā)利用提供了技術(shù)思路。

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