血液透析液中碳酸氫根檢測方法的優(yōu)化與改進

葉曉燕 陳華燕 黃麒諭 何曉帆 許朝生 梁澤鑫

血液透析A 濃縮物主要含有氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、冰醋酸或醋酸鈉（或其他替代物）；B 濃縮物主要含有碳酸氫鈉，部分還含有氯化鈉。臨床透析時通過含醋酸鹽和碳酸氫鹽的透析液來達到堿的跨膜轉(zhuǎn)運［1］，碳酸氫根離子作為衡量人體酸堿平衡的重要指標，其濃度的檢測有重要意義。目前碳酸氫根的常見檢測方法主要有離子色譜法和滴定法［2］。研究表明，抑制型離子色譜法檢測碳酸氫根時，峰型不佳，精密度差，離子色譜法不適合測定碳酸氫根［3］。

現(xiàn)行行業(yè)標準YY 0598-2015《血液透析液及相關(guān)治療濃縮物》［4］中規(guī)定，檢測碳酸氫根濃度的檢驗液為A 液、B 液和透析用水按照比例進行混合后的透析液，采用鹽酸滴定法或電位滴定法測定。以醋酸配方為例，血液透析濃縮物配制成透析液時，A 液中含有的冰醋酸和B 液中的碳酸氫鹽以1∶1 的當量發(fā)生反應(yīng)生成醋酸鈉，在實際的檢測中發(fā)現(xiàn)，采用鹽酸直接滴定法測定透析液中碳酸氫根的含量時，由于醋酸鈉的干擾［5］，無法對透析液中的碳酸氫根含量進行準確定量，難以對血液透析濃縮物的質(zhì)量進行監(jiān)控，該方法需要進一步優(yōu)化完善［5］。

本文通過建立返滴定法，依據(jù)《中華人民共和國藥典（四部）》（2020 年版）通用技術(shù)要求9101 分析方法驗證指導(dǎo)原則［6］，考察返滴定法檢測透析液中碳酸氫根含量的專屬性、精密度、穩(wěn)定性以及回收率，同時與鹽酸滴定法進行回收率試驗對比，以證明返滴定法不受干擾，且穩(wěn)定性及準確性滿足檢測透析液中碳酸氫根的要求，為透析液中碳酸氫根含量的檢測提供更加準確、可靠的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑

鹽酸滴定法回收率試驗試劑包括：①實驗用水，所有實驗用水均為純化水；②鹽酸滴定液；③甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑，按藥典指示劑項下配制。

返滴定法試驗（包括專屬性、精密度、穩(wěn)定性、回收率試驗）試劑包括：①實驗用水，所有實驗用水均為純化水；②鹽酸滴定液；③氫氧化鈉滴定液；④酚酞指示劑，按藥典指示劑項下配制。

1.2 透析液的配制

精密量取血液透析濃縮液或由干粉配制成的濃縮液，按使用說明的比例用實驗用水稀釋成透析液。由于透析液配制后，溫度的變化或劇烈的攪拌都易導(dǎo)致其中碳酸氫根的分解、pH 變化，時間長了還會產(chǎn)生碳酸鈣和碳酸鎂沉淀，因此碳酸氫根檢測的樣品需即配即用。

1.3 試驗方法和反應(yīng)機理

1.3.1 鹽酸滴定法的試驗方法

按標準規(guī)定的碳酸氫根檢測方法，精密量取檢驗液100 mL，加入甲基紅-溴甲酚綠混合指示液10 滴，用鹽酸滴定液（0.5 mol/L）滴定至溶液由綠色轉(zhuǎn)變?yōu)樽霞t色，煮沸2 min，冷卻至室溫，繼續(xù)滴定至溶液由綠色轉(zhuǎn)變?yōu)榘底仙?，消耗鹽酸體積為VHCl，同時作空白測試。鹽酸滴定法計算公式如下：

1.3.2 返滴定法的試驗方法

以透析液為檢驗液，精密量取檢驗液100 mL，精密加入0.5 mol/L 鹽酸滴定液10 mL，加熱煮沸1 分鐘，冷卻至室溫，加入酚酞指示劑1 滴，用0.2 mol/L 氫氧化鈉滴定液滴定至溶液由無色轉(zhuǎn)變?yōu)榉奂t色，消耗滴定液VNaOHmL。同時做空白測試（不加鹽酸），取與檢驗液相同體積的透析用水100 mL，同法煮沸冷卻至室溫，加入酚酞指示劑1 滴，用氫氧化鈉滴定液滴定至溶液由無色轉(zhuǎn)變?yōu)榉奂t色，消耗滴定液V0mL。計算公式如下：

1.3.3 返滴定法的反應(yīng)機理

①血液透析濃縮物配制成透析液時，A 液中的冰醋酸和B 液中的碳酸氫鹽以1∶1 的當量發(fā)生以下的化學(xué)反應(yīng)生成醋酸鈉：

②滴定時，取100 mL 透析液，加入過量的鹽酸滴定液10 mL，將碳酸氫鹽全部中和掉，再將醋酸鹽置換成醋酸：

③公式（2）中碳酸氫鈉消耗鹽酸的體積為V2，公式（3）中醋酸鈉消耗鹽酸的體積為V3，此時溶液中還有（10 mL-V2-V3）×CHCl的鹽酸。煮沸溶液除去溶液中的CO2，冷卻，加入酚酞指示劑后用氫氧化鈉滴定液滴定。氫氧化鈉首先與溶液中剩余的鹽酸反應(yīng)，反應(yīng)過程如下：

④繼續(xù)滴定使NaOH 與公式（3）中生成的HAc 反應(yīng)生成NaAc，直到酚酞變?yōu)榉奂t色（HAc反應(yīng)完全），反應(yīng)過程如下：

此部分消耗NaOH 的物質(zhì)的量（mol）與公式（3）中消耗HCl 的物質(zhì)的量相等（結(jié)合公式（3）、公式（5）：CNaOHV5=CHClV3），因此：

公式（5）中NaOH 消耗掉的體積

NaOH 的總消耗量（V4+V5）為：

則化學(xué)反應(yīng)（2）中碳酸氫鈉消耗掉的鹽酸體積V2為：

⑤根據(jù)化學(xué)反應(yīng)（2）中，V2×CHCl=×Vsample，同時做空白測試（不加鹽酸），則碳酸氫根濃度為：

2 結(jié)果

2.1 專屬性試驗

配制32 mmol/L 的碳酸氫鈉溶液及碳酸氫鈉標示值為32 mmol/L 的透析液，用返滴定法分別檢測碳酸氫鈉溶液和透析液中的碳酸氫根含量，比較檢測結(jié)果的差異。見表1。檢測結(jié)果可見：采用返滴定法檢測時，理論值為32 mmol/L 的碳酸氫鈉溶液和透析液的碳酸氫根檢測結(jié)果相對偏差為0.31%。

2.2 精密度試驗

重復(fù)性試驗采用返滴定法分別測定多種典型配方透析液中的碳酸氫根含量，平行測定6 次，計算相對標準偏差RSD 值，結(jié)果顯示，不同配方不同配制比例透析液的碳酸氫根檢測結(jié)果重復(fù)性RSD（%）值分別為0.10、0.17、0.11、0.10、0.14。重復(fù)性試驗結(jié)果見表2。中間精密度試驗選取配方1 透析液，不同檢驗員在不同時間和不同試驗條件下，用不同滴定管進行中間精密度試驗，結(jié)果顯示中間精密度RSD（%）值為0.06。中間精密度試驗結(jié)果見表3。

表2 重復(fù)性試驗結(jié)果Table 2 Repeatability test results

表3 中間精密度試驗結(jié)果Table 3 Results of intermediate precision test

2.3 穩(wěn)定性試驗

選取配方1 透析液，連續(xù)3 天使用同一套透析濃縮物配制透析液，并采用返滴定法進行檢測，穩(wěn)定性結(jié)果RSD（%）=0.05。穩(wěn)定性試驗結(jié)果見表4。

表4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 4 Stability test results

2.4 回收率試驗

選取配方1（原料為雙醋酸鈉，醋酸根標示量：6.0 mmol/L）和配方5（原料為枸櫞酸鈉，枸櫞酸根標示量：1.0 mmol/L）透析液樣品，分別配制成3 個不同濃度的透析液，所含碳酸氫根濃度為其標示量（32.0 mmol/L）的80%、100%、120%的透析液，分別用返滴定法和鹽酸滴定法進行檢測，計算其回收率。

采用返滴定法檢測，80%、100%、120%醋酸配方透析液平均回收率（%）分別為101.19、100.70、100.86；采用鹽酸滴定法檢測，80%、100%、120%醋酸配方透析液回收率（%）分別為106.10、105.47、103.84。醋酸配方透析液回收率結(jié)果見表5。

表5 回收率試驗結(jié)果（醋酸配方）Table 5 Recovery test results（Acetic acid formula）

采用返滴定法檢測，80%、100%、120%枸櫞酸配方透析液回收率（%）分別為100.20、100.06、99.93；采用鹽酸滴定法檢測，80%、100%、120%枸櫞酸配方透析液平均回收率（%）分別為102.25、101.77、101.62。枸櫞酸配方透析液回收率結(jié)果見表6。

表6 回收率試驗結(jié)果（枸櫞酸配方）Table 6 Recovery test results（Citric acid formula）

3 討論

從專屬性試驗結(jié)果可見，采用返滴定法檢測，透析液中的其他離子對待測碳酸氫根無干擾。從精密度試驗結(jié)果可見，重復(fù)性RSD 為0.10%～0.17%，日間精密度RSD 為0.06%，穩(wěn)定性RSD 為0.05%，表明返滴定法重現(xiàn)性好。

從兩種檢測方法的回收率對比試驗可見：①現(xiàn)行行業(yè)標準YY 0598-2015 中規(guī)定的鹽酸滴定法檢測枸櫞酸配方透析液（枸櫞酸根標示量：1.0 mmol/L）的回收率效果較好，而鹽酸滴定法檢測醋酸配方透析液（醋酸根標示量：6.0 mmol/L）中碳酸氫根含量的回收率效果較差，80%和100%的回收率超過了5%的允差范圍，準確度低；②采用返滴定法測定醋酸配方和枸櫞酸配方透析液，碳酸氫根含量檢測的回收率均接近100%，準確度高，符合《中國藥典（四部）》（2020年版）通用技術(shù)要求9101 分析方法驗證指導(dǎo)原則的要求；③造成結(jié)果偏差的原因可能與透析液中弱酸含量的高低有關(guān)。采用鹽酸滴定法時，由于部分鹽酸滴定液與透析液中的醋酸鈉反應(yīng)，透析液中醋酸根含量越高，采用鹽酸滴定法檢測透析液中碳酸氫根含量的準確度越低。而返滴定法則不受該因素的影響，能夠準確地檢測出透析液中碳酸氫根消耗滴定液的量，得出的檢測結(jié)果準確、可靠。

通過對返滴定法進行了專屬性、穩(wěn)定性、精密度和回收率試驗方法驗證，試驗結(jié)果表明該方法具有專屬性強、穩(wěn)定性好、精密度和準確度高的特點，能夠準確、穩(wěn)定地檢測出透析液中碳酸氫根的含量，適用于含醋酸鈉、冰醋酸或枸櫞酸的血液透析液中碳酸氫根含量的檢測。