IL-8、sPD-1、PTX3、miR-132在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中的表達(dá)及臨床意義

許春嬌

（江西省贛州市會昌縣人民醫(yī)院，江西 贛州 342600）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種自身性免疫疾病，以侵蝕全身關(guān)節(jié)為主要特征，病理基礎(chǔ)主要為滑膜炎，疾病發(fā)作初期關(guān)節(jié)表現(xiàn)為晨僵、腫脹、疼痛，疾病發(fā)作終末期可發(fā)生關(guān)節(jié)畸形，并導(dǎo)致喪失關(guān)節(jié)正常功能[1]。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎在全球的患病率為0.2%～1%，在我國的患病率為0.28%～0.41%，患病人群近500萬，男女患病比例為1：4，其中80%為女性患者，可發(fā)生于任何年齡階段[2]。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病因至今尚未完全闡明，可能與自身免疫、遺傳、吸煙、微生物感染有關(guān)[3]。我國大部分患者對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的認(rèn)知水平較低，且基層地區(qū)缺乏有效診治方法，加之類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎癥狀不典型，常與骨性關(guān)節(jié)炎、滑膜腱鞘炎等混淆，導(dǎo)致臨床診斷延誤，治療不當(dāng)?shù)惹闆r[4]。因此，尋找有效的治療靶點是臨工作者迫切需要解決的問題。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎為慢性炎癥疾病，細(xì)胞因子分泌異常影響類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8）會參與到免疫反應(yīng)、炎性反應(yīng)、免疫損傷中，對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎會產(chǎn)生影響。血清可溶程序性死亡分子-1（soluble PD-1，sPD-1）為協(xié)同刺激分子，血液循環(huán)和免疫應(yīng)答會受到影響，在判斷自身免疫性疾病中參考價值高[5]。正五聚素蛋白-3（ortho pentameric protein-3，PTX3）與免疫疾病的發(fā)生相關(guān)，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病中呈高表達(dá)狀態(tài)。微小核糖核酸-132（microRNA-132，miR-132）會影響免疫細(xì)胞成熟階段和穩(wěn)定維持，與該疾病的發(fā)生關(guān)系密切。通過對相關(guān)指標(biāo)分析，評估類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的情況，判斷嚴(yán)重程度，為疾病的診治提供相應(yīng)的依據(jù)，有助于改善患者預(yù)后[6]。本研究旨在分析類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者IL-8、sPD-1、PTX3、miR-132的表達(dá)意義。

1 對象與方法

1.1 一般資料 研究起止時間2022年12月至2023年12月。A組100例：男56例，女44例；年齡30～72歲，平均（47.52±5.36）歲。B組50例：男26例，女24例；年齡33～71歲，平均（47.25±5.43）歲。對照組50例：男27例，女23例；年齡36～70歲，平均（47.28±5.41）歲。組間一般資料對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。納入標(biāo)準(zhǔn)：A組經(jīng)過相關(guān)檢查確診類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；所選對象和家屬知情研究內(nèi)容；配合程度高。排除標(biāo)準(zhǔn)：精神類疾??；感染及惡性腫瘤；嚴(yán)重心、肝、腎等臟器疾病。全部研究對象均知情并同意且簽署知情同意書。我院倫理委員會已批準(zhǔn)本研究。

1.2 方法 采集靜脈血5 mL，以3 000 r/min的速度離心10 min，取上清液檢測。①IL-8檢測：采用上海紀(jì)寧IL-6檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）檢測，將試劑盒取出后放置到室溫，設(shè)置待測標(biāo)本和陰性對照組及標(biāo)準(zhǔn)品，洗板3次加入100 μL酶標(biāo)志物，在37 ℃溫育1 h后甩棄液體，再加入洗滌液，靜置30 s后甩棄液體，重復(fù)5次，拍干，加入顯色劑A和顯色劑B各50 μL，混勻后在37 ℃避光顯色10 min，加入終止液50 μL，混勻后在450 nm下測定各孔吸光度數(shù)值。②sPD-1檢測：采用九邦生物人sPD-1 elisa檢測試劑盒檢測sPD-1，將試劑盒取出后平衡到室溫，取出板條帶，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣品孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL；待測樣品孔先加待測樣品10 μL，再加樣品稀釋液40 μL，隨后標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔中每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體100 μL，再用封板膜封住反應(yīng)孔，放置37 ℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min，棄去液體，吸水紙上拍干，再每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩棄洗滌液，吸水紙上拍干，重復(fù)洗板5次，每孔各加入底物A和底物B50 μL，放置37 ℃避光孵育15 min，每孔各加入終止液50 μL，溫育15 min內(nèi)，在酶標(biāo)分析儀450 nm波長處測定各孔吸光度值。③PTX3檢測：采用莼試生物人五聚素3酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測PTX3，將試劑盒取出后平衡放置到室溫，拿出板條，設(shè)置空白孔和標(biāo)準(zhǔn)孔及待測樣品孔，在酶標(biāo)包被上的標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μL、待測樣品孔加入樣品稀釋液40 μL，再加入待測樣品10 μL，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，輕晃搖勻，用封板膜封住反應(yīng)孔，放入37 ℃水浴鍋或恒溫箱溫育30 min，將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋30倍后備用，撕去封板膜，棄掉液體，甩干，每個孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，重復(fù)5次后拍干，每孔加入顯示劑A和顯示劑B各50 μL，放置37 ℃避光孵育15 min，每孔加入終止液各50 μL，溫育時間15 min內(nèi)，在酶標(biāo)分析儀450 nm波長處測定各孔吸光度值。④miR-132檢測：采用Trizol reagent RNA提取試劑盒（美國Invitrogen公司）對血清樣品總RNA進(jìn)行提取，采用7500型熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀（美國ABI公司）應(yīng)用實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法對血清miR-132相對表達(dá)量進(jìn)行檢測，以U6為內(nèi)參，RNA催化合成采用cDNA：PrimerScriptTM RT試劑盒，RNA擴增采用SYBR Premix Ex TaqTM qRT-PCR試劑盒，miR-132正向引物：5'ACGTCGTGTAGCTTATAAGACTG3'，反向引物：5'ACTGCTTGTTCTACACACTCTG3'，反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s預(yù)變性，95 ℃ 5 s 變性，58 ℃ 30 s 退火，72 ℃ 30 s延伸，來回進(jìn)行40個循環(huán)，每個標(biāo)本重復(fù)做3個孔位。反應(yīng)完成后進(jìn)行溶解曲線分析（15 s 95 ℃，1 min 60 ℃，15 s 95 ℃，15 s 60 ℃），每個反應(yīng)體系中熒光信號達(dá)到所設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即為Ct值，以U6為內(nèi)B組，采用2-ΔΔCt法計算PBMC中miRNA的相對表達(dá)水平其中ΔCt=Ct目的基因-CtU6，ΔΔCt=ΔCt實驗組標(biāo)本-ΔCt對照組標(biāo)本。

1.3 觀察指標(biāo) 比較IL-8、sPD-1、PTX3、miR-132。比較A組活動期、緩解期IL-8、sPD-1、PTX3、miR-132。比較輕度、中度、重度患者IL-8、sPD-1、PTX3、miR-132。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)由SPSS 20.0軟件分析，計量資料采用表述，組間比較行t檢驗；計數(shù)資料采用n（%）表述，組間比較行χ2檢驗；P＜0.05則表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)指標(biāo) A組IL-8、sPD-1、PTX3、miR-132高于B組、對照組（P＜0.05）。見表1。

表1 3組血清學(xué)指標(biāo)比較（）

表1 3組血清學(xué)指標(biāo)比較（）

2.2 A組血清學(xué)指標(biāo) 活動期IL-8、sPD-1、PTX3、miR-132高于緩解期（P＜0.05）。見表2。

表2 A組血清學(xué)指標(biāo)比較（）

表2 A組血清學(xué)指標(biāo)比較（）

2.3 輕度、中度、重度患者的血清學(xué)指標(biāo) 輕度、中度、重度患者IL-8、sPD-1、PTX3、miR-132差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 輕度和中度及重度患者的血清學(xué)指標(biāo)比較（）

表3 輕度和中度及重度患者的血清學(xué)指標(biāo)比較（）

3 討論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是臨床常見的自身免疫疾病，在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率為0.2%～1.0%，在我國的患病率為0.28%～0.41%，近年來有持續(xù)增加的趨勢，可發(fā)生在任何年齡階段[7]。侵蝕性關(guān)節(jié)炎為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病特點，滑膜炎為基礎(chǔ)，癥狀表現(xiàn)腫脹、疼痛、關(guān)節(jié)畸形等，出現(xiàn)不同程度功能障礙，還會出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎癥和全身炎性反應(yīng)等嚴(yán)重情況，顯著降低身體健康水平和生活質(zhì)量，對患者的負(fù)面?zhèn)Ψ浅Ｃ黠@[8]。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生原因尚不清晰，與多諸多因素相關(guān)，包括免疫功能、遺傳、吸煙、感染等，對癥治療為基本原則，大部分患者無法根治，為此要尋找更為有效的靶點進(jìn)行治療，以提升療效[9]。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是關(guān)節(jié)進(jìn)展損傷，功能障礙比較明顯，復(fù)發(fā)多變，在發(fā)病過程中，多細(xì)胞因子都會參與，對T、B細(xì)胞活化、分化會產(chǎn)生影響，生成抗體，對免疫功能會產(chǎn)生嚴(yán)重影響，導(dǎo)致類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和進(jìn)展[10]。IL-8是前炎性細(xì)胞因子一種，參與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎免疫反應(yīng)、炎性反應(yīng)、免疫損傷，對T細(xì)胞能產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，增加炎性因子的生成，同時可對IL-12產(chǎn)生影響，激活中性粒細(xì)胞，導(dǎo)致類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[11]。對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者來說，IL-8升高比較明顯，其水平升高說明致殘率提升，炎性反應(yīng)的發(fā)生風(fēng)險也會增加。IL-8是常見趨化因子，IL-8和重組蛋白受到細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶的影響，轉(zhuǎn)導(dǎo)分子調(diào)控類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中成纖維樣滑膜細(xì)胞，會導(dǎo)致類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎出現(xiàn)[12]。sPD-1是血清可溶性PD-1，CD28一員，在免疫性疾病發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，繼而參與到血液循環(huán)、免疫表達(dá)中。2號染色體的sPD-1基因會出現(xiàn)變化，對感染、腫瘤、免疫病等影響非常明顯。sPD-1是協(xié)同刺激分子，在機體內(nèi)的正常表達(dá)非常少，不參與到血液循環(huán)中，且對免疫應(yīng)答有調(diào)節(jié)能力，實現(xiàn)糾正免疫失衡的目的。sPD-1對促炎癥T細(xì)胞反應(yīng)能產(chǎn)生抑制，減輕免疫疾病對機體損傷，而類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者sPD-1水平比較高，與晨僵時間關(guān)系比較密切，與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病也有關(guān)，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者，sPD-1為高水平，為正相關(guān)[13]。PTX3是正五聚素蛋白-3，與免疫性疾病的出現(xiàn)、發(fā)展關(guān)系密切，來源平滑肌細(xì)胞、天然免疫細(xì)胞，是腫瘤壞死因子刺激基因，對IL-1、TNF-α的信號會產(chǎn)生影響。PTX3會受到干擾素-γ、IL-10的影響，干擾素-γ對樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞等PTX3產(chǎn)生影響，IL-10能提升脂多糖依賴性表達(dá)能力。PTX3是對炎癥過程能產(chǎn)生調(diào)節(jié)，對免疫、血管完整性、自身免疫等都會產(chǎn)生影響。PTX3有助于清除凋亡細(xì)胞，對自身抗原進(jìn)行調(diào)節(jié)，對細(xì)胞因子、先天性抵抗力會產(chǎn)生影響。骨性關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中PTX3表達(dá)水平提升明顯，故PTX3是比較理想的診斷標(biāo)志物[14]。miR-132在免疫細(xì)胞成熟的各環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，維持和調(diào)節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)，與免疫性疾病之間關(guān)系密切，在免疫細(xì)胞成熟多環(huán)節(jié)和免疫維持影響比較明顯。miRNA會對蛋白α調(diào)控巨噬細(xì)胞起到影響作用，增強細(xì)胞浸潤、吞噬的能力，加速促炎細(xì)胞因子分泌，使更多細(xì)胞因子參與到類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生及發(fā)展過程中。miR-132是長度22bp的小分子RNA，影響類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的易感性。骨性關(guān)節(jié)炎患者的miR-132和健康人群差異較大，miR-132在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎為高表達(dá)，參與到類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中，是診斷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的主要參考指標(biāo)[15]。

綜上所述，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者檢測IL-8、sPD-1、PTX3、miR-132的意義明確，對其分析能判斷疾病的情況，確定嚴(yán)重程度，結(jié)合相關(guān)信息制訂治療方案。