LncRNA-MALAT1/miR-125b-5p/PDCD4分子軸參與心力衰竭發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究

賴(lài)紀(jì)英 郭宗文 岳霖琳 沈恩芳 歐陽(yáng)松茂 朱宏泉

（贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，江西 贛州 341000）

慢性心力衰竭是由于各種致病因素引起的心臟舒 張功能障礙或心臟負(fù)荷過(guò)重，導(dǎo)致心泵功能降低的臨床綜合征，是多種心血管疾病發(fā)展到終末階段共同作用的結(jié)果[1]?！吨袊?guó)心血管報(bào)告2018》數(shù)據(jù)結(jié)果表明，我國(guó)心力衰竭患者約450萬(wàn)，每年新發(fā)心力衰竭患者約50萬(wàn)，且隨著人口老齡化的加劇，使得慢性心力衰竭患病率呈上升趨勢(shì)[2]。目前，臨床上對(duì)于慢性心力衰竭竭以藥物治療為主，如醛固酮拮抗劑、利尿劑、伊伐布雷定等，盡管治療方法不斷改進(jìn)，但是患者病死率、再住院率仍較高[3]。因此，積極探究心力衰竭細(xì)胞增殖、侵襲相關(guān)因子及信號(hào)通路，對(duì)于臨床治療心力衰竭、改善患者預(yù)后具有重要意義。LncRNA是近年治療心力衰竭藥物的重要方向，經(jīng)檢索大量文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，LncRNA在心力衰竭發(fā)展中具有調(diào)控作用，但是對(duì)于其機(jī)制研究未見(jiàn)具體實(shí)驗(yàn)報(bào)告[4]。在心力衰竭患者中，LncRNA-MALAT1表達(dá)顯著下調(diào)，能競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-125b-5p，使其解除對(duì)PDCD4的抑制，促進(jìn)PDCD4的表達(dá)，從而抑制炎性反應(yīng)，但該結(jié)論尚未得到證實(shí)[5]。本研究主要探討LncRNAMALAT1/miR-125b-5p/PDCD4分子軸參與心力衰竭發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物材料 購(gòu)置SD大鼠40只，隨機(jī)取大鼠10只為對(duì)照組，剩余大鼠30只大鼠建立心力衰竭動(dòng)物模型，建模成功后設(shè)為觀察組；并將觀察組隨機(jī)分為模型組、空載組和MALAT1沉默組各10只。40只SD大鼠，雌雄隨機(jī)，體質(zhì)量180～220 g，平均（200.00±20.00）g。動(dòng)物合格證號(hào)SCXX-2015-0021，所選動(dòng)物均購(gòu)置于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；將購(gòu)置的大鼠于動(dòng)物房7 d適應(yīng)性喂養(yǎng)，安靜環(huán)境飼養(yǎng)，室溫（22±2）℃，12 h交替光照，自由飲水。

1.2 儀器與設(shè)備 HE染色試劑盒及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒，購(gòu)自于美國(guó)Roche公司；胎牛血清（FBS），購(gòu)自于美國(guó)Hyclone公司；siRNA合成，購(gòu)自于上海吉瑪基因生物技術(shù)有限公司；超凈工作臺(tái)，購(gòu)自于蘇州凈化設(shè)備有限公司；倒置顯微鏡，購(gòu)自于日本Olympus公司；Bio-rad Real-Time QRT-QRT-PCR擴(kuò)增儀，購(gòu)自于美國(guó)Bio-rad公司；電泳裝置，型號(hào)DYCP-31BM，購(gòu)自于北京市六一儀器廠；凝膠成像及分析系統(tǒng)，型號(hào)LabWorks TM，購(gòu)自于美國(guó)UVP公司；離心機(jī)，型號(hào)5415D，購(gòu)自于德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 心力衰竭動(dòng)物模型建立 30只采用結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支造成心肌梗死后形成心肌梗死模型，具體方法如下。取參與建模的SD大鼠，常規(guī)采用濃度為5%水合氯醛（6 mL/kg）腹腔注射麻醉，待麻醉生效后，大鼠保持仰臥位固位于鼠板上，并于大鼠左側(cè)第三肋和第四肋間進(jìn)行開(kāi)胸，充分顯露并將心臟擠出。在肺動(dòng)脈圓錐和左心耳尖之間、距離左心耳下緣2 mm部位，常規(guī)采用5-0結(jié)扎線(xiàn)快速結(jié)扎，在操作完畢后，立即將心臟恢復(fù)原位，采用2-0縫合線(xiàn)進(jìn)行縫合。建模5周后，對(duì)SD大鼠進(jìn)行超聲心功能檢測(cè)，以左室射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）＜50.0%為建模成功。于第14日取材組織并完成心功能測(cè)定，采用HE染色檢測(cè)其病理學(xué)變化[6]。

1.3.2 心力衰竭大鼠處理方法 ①慢病毒注射。攜帶慢病毒轉(zhuǎn)染干擾LncRNA-MALAT1序列（LVshMALAT1）及其空載（LV-Control），購(gòu)自于吉?jiǎng)P基因。于建模前2周，利用離體定位儀，由微量加樣器將慢病毒注入SD大鼠右側(cè)連個(gè)位點(diǎn)。其中，位點(diǎn)1：A-P 1.0 mm，M-L-2.0 mm，D-V-1.2 mm；位點(diǎn)2：A-P-3.0 mm、M-L-1.5 mm、D-V-1.2 mm；每個(gè)位點(diǎn)2.5 μL；注射病毒的速度為0.5μL/mL，拔針前原位停留5 min。②實(shí)驗(yàn)分組。利用慢病毒轉(zhuǎn)染干擾LncRNA-MALAT1序列（LV-shMALAT1）及其空載（LV-Control）；觀察治療大鼠的干預(yù)效果[7]。

1.3.3 檢測(cè)方法 采用實(shí)時(shí)熒光PCR法和Western Blot檢測(cè)LncRNA MALAT1、miR-125b-5p和PDCD4表達(dá)水平。①實(shí)時(shí)熒光PCR法。常規(guī)采用miRNeasy Mini試劑盒提取組織總miRNA，通過(guò)TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒形成cDNA，通過(guò)TaqMan miRNA分析試劑盒完成miRNA測(cè)定。通過(guò)比較循環(huán)閾值并以U6作為內(nèi)參，計(jì)算LncRNA MALAT1、miR-125b-5p和PDCD4 miRNA相對(duì)表達(dá)水平；采用RNeasy Mini試劑盒提取心肌組織總RNA。BestarTM qPCR試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；設(shè)定反應(yīng)條件：37 ℃下15 min、98 ℃下下5 min，然后借助BestarTM qPCR預(yù)混液完成qPCT實(shí)驗(yàn)。設(shè)定反應(yīng)條件：95 ℃下2 min、94 ℃下20 s、58 ℃下20 s、72 ℃下20 s，連續(xù)完成40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃下完成4 min延伸。待上述操作完畢后，借助Agilent Stratagene Mx 3000P序列完成實(shí)時(shí)熒光PCR分析，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算LncRNA MALAT1、miR-125b-5p和PDCD4相對(duì)表達(dá)量[8]。②Western Blot檢測(cè)。采用含有PMSF的RIPA裂解液，完成心肌組織中總蛋白的提取，冰上完成30 min孵育，10 min離心，速度8 000 r/min，溫度為4 ℃，取上層清液。BCA試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度，取50 μg蛋白，將其溶于2×SDS上樣緩沖液中煮沸，常規(guī)完成SDS-PAGE凝膠電泳，采用濕轉(zhuǎn)發(fā)將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5%脫脂奶粉于室溫下完成1 h封閉，將PVDF膜與稀釋的一抗、GAPDH作為內(nèi)參，在4 ℃下孵育過(guò)夜，TBST連續(xù)完成3次洗滌，將膜與HRP標(biāo)記的二抗山羊抗兔IgG H&L（HRP）孵育，經(jīng)TBST漂洗后，置于干凈的玻璃平板上。根據(jù)ECL熒光檢測(cè)試劑盒中說(shuō)明書(shū)完成。待上述操作完畢后，借助Bio-R心力衰竭圖像分析系統(tǒng)照相，采用Quantity One V4.6.2軟件進(jìn)行分析，以相應(yīng)的蛋白條帶的灰度值表示相對(duì)蛋白含量[9]。

1.4 觀察指標(biāo) ①心功能測(cè)定。各組大鼠處理完畢后，采用超聲心動(dòng)圖測(cè)定大鼠EF和左室短軸縮短率。②HE染色。觀察組與對(duì)照組大鼠以斷頸方式處死，取心肌組織，經(jīng)石蠟包埋后制備4μm切片，并完成HE染色[10]。③LncRNA MALAT1、miR-125b-5p和PDCD4表達(dá)水平。記錄各組大鼠干預(yù)后LncRNA MALAT1、miR-125b-5p和PDCD4表達(dá)水平。④炎性因子。大鼠處理完畢后，以斷頸方式處死，取尾末梢血3 mL，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定炎性因子腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）和白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）[11]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 26.0軟件處理，計(jì)量資料采用表示，組間比較行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用n（%）表示，組間比較行χ2檢驗(yàn)；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心功能及組織變化比較 觀察組建模完畢后EF及左室短軸縮短率低于對(duì)照組（P＜0.05）；觀察組中MALAT1沉默組EF及左室短軸縮短率高于模型組、空載組（P＜0.05）；模型組及空載組EF及左室短軸縮短率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組心功能水平比較（）

表1 各組心功能水平比較（）

注：a與模型組比較，P＜0.05；b與空載組比較，P＜0.05；c與MALAT1沉默組比較，P＜0.05。

2.2 各組HE染色結(jié)果比較 HE染色結(jié)果表明，模型組和空載組心肌纖維斷裂，細(xì)胞核紊亂、肥大、間隙增寬、染色加深；MALAT1沉默組心肌纖維斷裂有所改善，細(xì)胞排列相對(duì)整齊，見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠HE染色結(jié)果

2.3 各組大鼠LncRNA MALAT1、miR-125b-5p和PDCD4表達(dá)水平比較 實(shí)時(shí)熒光PCR法和Western Blot法結(jié)果表明，模型組與空載組LncRNA MALAT1、miR-125b-5p和PDCD4 mRNA及蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；MALAT1沉默組LncRNA MALAT1 mRNA、miR-125b-5p及蛋白表達(dá)低于模型組與空載組（P＜0.05）；PDCD4 mRNA及蛋白表達(dá)高于模型組與空載組（P＜0.05）。見(jiàn)表2和圖2。

圖2 各組大鼠相關(guān)蛋白水平

表2 各組大鼠LncRNA MALAT1、miR-125b-5p和PDCD4 mRNA比較（-x±s）

2.4 各組大鼠炎性因子比較 模型組與空載組炎性因子TNF-α和IL-1β水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；MALAT1沉默組炎性因子TNF-α和IL-1β水平低于模型組與空載組（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠炎性因子比較（）

表3 各組大鼠炎性因子比較（）

注：a與模型組比較，P＜0.05；b與空載組比較，P＜0.05。

3 討論

目前，全球醫(yī)學(xué)界對(duì)于心力衰竭的防治工作越發(fā)重視，探索心力衰竭發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制，尋找心力衰竭診療新模式成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。因此，針對(duì)心力衰竭的預(yù)防、早期診斷及治療成為研究的重點(diǎn)，而無(wú)創(chuàng)性診療方法或分子靶標(biāo)亟待被發(fā)現(xiàn)。PDCD4是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵誘導(dǎo)因子，當(dāng)PDCD4被miRNA抑制后，心力衰竭患者心肌細(xì)胞凋亡降低，凋亡引起的心肌細(xì)胞丟失不但會(huì)影響心臟收縮功能，參與心力衰竭的發(fā)生及發(fā)展，亦可直接影響電信號(hào)的傳遞，導(dǎo)致心律失常。PDCD4與p53均為調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白，miR-125b-5p能通過(guò)靶向抑制p53蛋白的表達(dá)，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡，從而預(yù)防急性心肌梗死的發(fā)生[12]。本研究中，觀察組EF及左室短軸縮短率低于對(duì)照組（P＜0.05）；MALAT1沉默組EF及左室短軸縮短率高于模型組及空載組（P＜0.05）；HE染色結(jié)果表明，模型組和空載組心肌纖維斷裂，細(xì)胞核紊亂、肥大、間隙增寬、染色加深；MALAT1沉默組心肌纖維斷裂有所改善，細(xì)胞排列相對(duì)整齊，從本研究結(jié)果看出，LncRNA-MALAT1/miR-125b-5p/PDCD4分子軸能直接參與心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展。抑制PDCD4的表達(dá)能抑制心肌細(xì)胞凋亡，并緩解缺氧/復(fù)氧引起的心臟損傷，可顯著促進(jìn)心力衰竭所引起的炎性反應(yīng)。因此，以此為靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)心力衰竭的治療藥物具有廣泛的價(jià)值[13]。

miRNA是當(dāng)前神經(jīng)損失疾病中的熱點(diǎn)之一，作為一類(lèi)高度保守且于炎性反應(yīng)相關(guān)的重要的調(diào)控因子，主要作用于靶基因'3-UTR區(qū)，能抑制靶基因翻譯，亦可引起靶基因的降解。因此，靶基因的mRNA編碼區(qū)以及蛋白翻譯過(guò)程中均受到miRNA的調(diào)控。miRNA在心力衰竭的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用，能調(diào)控宿主免疫反應(yīng)，如miR-125b-5p、miR-155等，均能參與免疫和炎性反應(yīng)[14]。特異性的miRNA通過(guò)靶向mRNA調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)，有望成為心力衰竭良好的替代方案。本研究中MALAT1沉默組LncRNA MALAT1 mRNA、miR-125b-5p及蛋白表達(dá)低于模型組與空載組（P＜0.05）；PDCD4 mRNA及蛋白表達(dá)高于模型組與空載組（P＜0.05）；模型組與空載組炎性因子TNF-α和IL-1β水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；MALAT1沉默組炎性因子TNF-α和IL-1β水平低于模型組與空載組（P＜0.05）。從本研究結(jié)果可以看出，在心力衰竭大鼠中，能競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-125b-5p，提高PDCD4表達(dá)水平，從而抑制機(jī)體內(nèi)的炎性反應(yīng)。LncRNA能作為一種競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA，并以“海綿”吸附的方式通過(guò)共同的miRNA反應(yīng)元件，相互競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合共同的miRNA，從而解除miRNA對(duì)靶基因mRNA的作用[15]。LncRNA為長(zhǎng)度＞200個(gè)核苷酸非編碼RNA，能通過(guò)在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后及表觀遺傳水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)。而miR-125b-5p能靶向調(diào)控PDCD4參與心力衰竭病理進(jìn)程，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-125b-5p靶向調(diào)控PDCD4促進(jìn)心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展，可為精準(zhǔn)研發(fā)治療心力衰竭的治療藥物提供科學(xué)依據(jù)，具有重要的實(shí)際意義。

綜上所述，心力衰竭大鼠中LncRNA-MALAT1表達(dá)顯著下調(diào)，能競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-125b-5p，使其解除對(duì)PDCD4的抑制，促進(jìn)PDCD4表達(dá)，從而抑制炎性反應(yīng)，為心力衰竭治療提供新的思路。