男性精子DNA 碎片率與年齡、精液參數(shù)的相關(guān)性研究

徐嵐，胡泉，黃麗麗

咸寧市中心醫(yī)院（湖北科技學院第一附屬醫(yī)院）生殖中心，湖北咸寧 437100

據(jù)研究報道，中國大約有15%的育齡夫婦面臨不孕不育困境[1]。當前，臨床對男性生育力的評估主要依據(jù)WHO 標準通過對精子濃度、精子活力、形態(tài)等指標來判斷，只能反映精液的一般現(xiàn)狀，即使檢測正常也可能被診斷為不育，臨床上需要尋找能預測男性生育能力的檢測方法[2]。當前研究表明，高齡患者體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species, ROS）自由基過度產(chǎn)生會損傷精子DNA，導致精子受精能力下降[3]，因此高齡對男性精子的DNA 完整性可能存在不利影響[4]。而又有研究表明，男性精子頭部DNA 完整性（DNA fragmetation index of sperm, DFI）受損可能會增加其配偶發(fā)生復發(fā)性流產(chǎn)的風險[5]，因此完善精子DNA 碎片的檢測對男性生育力的評估非常重要。本研究回顧性分析2021 年8 月—2022 年8 月在咸寧市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學中心就診的503 例男性患者的精液常規(guī)指標和DFI 指數(shù)，分別按照年齡和DFI 指數(shù)分組，探討不同年齡組、不同DFI 組精液質(zhì)量的差異?，F(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

在獲得患者及其家屬知情并同意的情況下選取在本院生殖醫(yī)學中心就診的503 例男性患者作為研究對象，年齡23～50 歲。此次研究獲得咸寧市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學中心倫理委員會批準。

1.2 納入與排除標準

納入標準：男性身體健康，無睪丸外傷，無家族遺傳性疾病及性功能障礙病史，無不良生活習慣（嗜煙、嗜酒、吸毒等）；無腮腺炎病史；男性體征明顯，睪丸、附睪及輸精管體檢無明顯異常。排除標準：患者無遺傳性疾病家族史、無隱睪、睪丸腫瘤、無精癥、精索靜脈曲張、腮腺炎病史等。

1.3 方法

1.3.1 標本采集 患者在取精前禁欲2～7 d，洗凈雙手手淫法取精，且精液完整取出收集在取精杯內(nèi)，稱重后立即放置于37℃恒溫箱內(nèi)溫育至完全液化后檢驗。

1.3.2 精液常規(guī)檢測 用3 mL 巴斯德吸管上下吹吸使精液完全液化，充分混勻后移液器取10 ul 精液樣本于makler 計數(shù)板加樣池中，然后采用計算機輔助精液分析系統(tǒng)（CASA BEION V4.2）對男性精液參數(shù)進行分析。

1.3.3 精子形態(tài)學檢測 將精液標本制片干燥至少4 h并采用改良巴氏染色法染色，制片完成后將由檢驗人員按照第五版操作手冊[6]正常精子判定標準在100 倍油鏡下篩選至少200 條精子，并計算正常精子形態(tài)百分率，≥4%即為正常。

1.3.4 精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析 將適量精液標本，用緩沖液稀釋成濃度為（1.5～2.0）×106/mL 的100 μl 精子懸液，然后與200 μl 酸處理液混勻30 s，再加入600 μl 吖啶橙染液進行染色，再將標本置于流式細胞儀檢測，每個待檢測精液標本至少檢測1 000 個精子，吖啶橙染液對精子核進行染色，用于評估單鏈和雙鏈DNA 的比例。采用精子DFI 表示精子DNA 損傷的程度，并對研究對象進行分組。目前臨床上用于檢測DNA 損傷的方法主要有：彗星實驗，精子染色體結(jié)構(gòu)檢測（sperm chromatin structure assay, SCSA），精子染色質(zhì)擴散實驗（sperm chromatin diffusion, SCD），TUNEL 檢測以及基于熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization, FISH）技術(shù)等。與其他檢測方法相比SCD 是一種性價比高的檢測方法且已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床。

1.4 觀察指標

根據(jù)WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊》（第5 版）[6]精液各項參數(shù)的參考標準如下：禁欲天數(shù)：2～7 d，精液體積≥1.5 mL，pH:7.2～8.0，精子濃度≥15×106/mL，精子總數(shù)≥39×106個，前向運動精子PR≥32%，總活力PR+NP≥40%，不動精子IM＜60%，正常精子形態(tài)≥4%，精子DNA 碎片指數(shù)（DFI）參考值＜25%。

1.5 統(tǒng)計方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，非正態(tài)分布采用中位數(shù)(四分位間距)[M（P25，P75）]來描述，方差不齊采用多個獨立樣本的非參數(shù)（Kruskal-Wallis H）檢驗法對數(shù)據(jù)進行分析。對于不服從雙變量正態(tài)分布的計量資料進行spearman 秩相關(guān)性分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同程度DFI 組男性精液參數(shù)比較

3 組結(jié)果分析表明，年齡越大，DFI 指數(shù)越高，不動精子占比越高，而精子總活力越低，正常精子形態(tài)率越低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其他參數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2 男性精子DFI 與年齡、精液常規(guī)參數(shù)的相關(guān)分析

精子DFI 與患者年齡、不動精子呈正相關(guān)（P＜0.001）；與精子總活力、精子正常形態(tài)率呈負相關(guān)（P＜0.001）；而其他參數(shù)與精子DNA 碎片不存在相關(guān)性（P＞0.05），見表2。

表2 精子DFI 與年齡、精液參數(shù)的相關(guān)性分析

3 討論

研究表明，高齡、吸煙、生活作息不規(guī)律等不良生活習慣等因素會影響精子產(chǎn)生、降低精子質(zhì)量和損害精子功能，導致精子DNA 受損和男性不育[7]。學者們對男性不育患者的年齡與其精子DFI 相關(guān)性的研究比較多，且一致認為DFI 水平越高，顯示研究對象年齡越大，這類似的結(jié)果也在一些研究中得到證實，例如當男性年齡＞35 歲時精液質(zhì)量開始下降；20～35 歲組精子DNA 碎片率顯著低于36～57歲[8-9]等，本文結(jié)果也證實了這一點。高齡之所以影響男性生育力，其機制可能是高齡男性睪丸結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生異常改變，而精液內(nèi)活性氧自由基濃度升高，同時伴隨體內(nèi)抗氧化能力減弱，繼而造成精子頭部DNA 單鏈或雙鏈出現(xiàn)損傷和斷裂，影響男性生育功能[10]。另外其他精液參數(shù)分析結(jié)果顯示，隨著DFI 水平的增加，精子總活力下降、正常形態(tài)精子率顯著降低，不動精子占比增加；相關(guān)性分析結(jié)果顯示，精子DFI 與患者年齡、不動精子呈正相關(guān)，與精子總活力、精子正常形態(tài)率呈負相關(guān)，而與其他參數(shù)不存在相關(guān)性。因此檢測精子 DFI 可以在一定程度預測受檢者的年齡、精液中的精子活力和精子形態(tài)等情況。研究表明，隨著男性年齡的增大，會導致精液質(zhì)量下降，精子活力降低以及正常形態(tài)精子比例減少[11-12]，這與本研究的結(jié)果一致。而辜秀麗等[13]研究表明精子DFI 與精子活力（r=-0.406，P＜0.001）顯著相關(guān)，DFI 影響精子活力，與本研究結(jié)果“精子DFI 與精子活力（r=-0.365，P＜0.001）具有相關(guān)性”一致。此外，本研究中DFI 與精子濃度卻沒有明顯相關(guān)性，但隨著DFI 水平的增加，精子濃度有下降的趨勢，這可能與樣本選擇有關(guān)。DFI 影響精子活力與精子形態(tài)的機制可能是因為高齡患者精子DNA 損傷程度越高，為精子運動提供能量的線粒體功能缺陷越嚴重，導致精子運動能力下降，同時也會誘導精子細胞發(fā)生凋亡，引起精子形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變[14]。這在Xu S 等[15]研究中有類似報道，男性年齡在40 歲以后精子總活力和精液參數(shù)則開始下降。在另外一篇文獻中也報道DFI≥25%組男性精子總活力、正常精子形態(tài)率明顯低于DFI＜25%組，受精率、可移植胚胎率、優(yōu)胚率、妊娠率均劣于對照組，而流產(chǎn)率高于對照組[16]。其他也有類似報道顯示DFI＞30%的男性配偶受精率不顯著低于DFI≤30%的男性配偶，但其囊胚發(fā)育不良的風險會更高[17]。這表明高DFI 指數(shù)不僅明顯降低精子活力和正常精子形態(tài)，而且導致不動精子占比增加，繼而影響男性配偶受精率，還可能導致囊胚發(fā)育不良，男性的生育能力明顯下降。

綜上所述，男性高齡對精子參數(shù)有顯著影響，因此高齡男性在生育前應(yīng)該進行全面的精液質(zhì)量分析，充分評估男性生育能力，才能更有利于患者治療。在今后的研究中還將探討精子DNA 損傷對輔助生殖技術(shù)后生育結(jié)局的影響，進一步探索精子DFI 在男性不育中的臨床應(yīng)用價值。