噬菌體在細(xì)菌性疾病治療中的研究進(jìn)展

程曉薇，田 偉，李相安

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海都學(xué)院，山東 萊陽 265200）

1929年，弗萊明對于青霉素的發(fā)現(xiàn)為細(xì)菌病的治療帶來了曙光?？股刈园l(fā)現(xiàn)以來，作為預(yù)防和治療細(xì)菌疾病的藥物以及飼料添加劑被廣泛應(yīng)用，但由于對抗生素的使用缺乏管制，藥物大量濫用，致使大量細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，并且伴隨著其耐藥譜的不斷擴(kuò)大，抗生素的治療效果顯著降低，同時(shí)出現(xiàn)多重耐藥菌甚至超級(jí)細(xì)菌[1]。

目前，人們正在尋找新的替代抗生素的療法，例如基因藥物、中藥添加劑、益生菌等[2-4]。近年來噬菌體作為能感染細(xì)菌的特定病毒被廣泛研究，其廣泛存在于自然界環(huán)境和生物體中，對維持自然界微生物的動(dòng)態(tài)平衡起著重要作用。與抗生素相比，噬菌體制劑以不良反應(yīng)小、不易產(chǎn)生抗藥性、安全性高、無殘留且成本低等優(yōu)勢而備受關(guān)注。近年來國內(nèi)外學(xué)者陸續(xù)發(fā)表一些關(guān)于噬菌體治療技術(shù)的研究成果，在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)以及人類的疾病中均有較好的治療效果。近日，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）和美國農(nóng)業(yè)部有機(jī)認(rèn)證（USDA）批準(zhǔn)了噬菌體Phageguard-E作為對抗大腸桿菌O157食品加工助劑的公認(rèn)安全級(jí)產(chǎn)品（GRAS）認(rèn)證，為今后在噬菌體治療細(xì)菌性疾病的研究中奠定了良好的基礎(chǔ)。

1 噬菌體與家畜細(xì)菌性疾病

2013-2017年，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疾病診斷中心對9961個(gè)豬場的47175份樣本進(jìn)行細(xì)菌分離，檢測結(jié)果顯示，每年均有上千份樣本存在細(xì)菌感染，以副豬嗜血桿菌和鏈球菌檢出率較高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)大腸桿菌和沙門氏菌在近幾年的檢出率也是越來越高[5]。在牛場由巴氏桿菌、鏈球菌、葡萄球菌、大腸桿菌及沙門氏菌等引起的運(yùn)輸熱、乳房炎、腹瀉等也成為影響?zhàn)B牛業(yè)發(fā)展的重要疾病。胡東方等[6]就山東各地70余個(gè)牛場117份奶樣進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室分離鑒定和藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明，牛病常見致病菌的多重耐藥現(xiàn)象較為普遍，僅有少數(shù)幾種藥物如頭孢類及喹諾酮類藥物能夠發(fā)揮有效抗菌作用?？梢姡诩倚蠹?xì)菌病方面的治療，還是缺乏相應(yīng)的治療手段。杜春林[7]對貴州省副豬嗜血桿菌的研究中發(fā)現(xiàn)，副豬嗜血桿菌慢性感染仔豬，可引起仔豬日增重、料肉比和采食量等生長性能評價(jià)指標(biāo)顯著降低。韓博等人[8]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，致病性細(xì)菌是奶牛乳房炎發(fā)病的一個(gè)主要因素，而每年奶牛乳房炎給全球奶牛產(chǎn)業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)350億美元，其中印度乳業(yè)每年損失6億歐元，澳大利亞乳品行業(yè)每年因乳房炎影響乳品質(zhì)量而產(chǎn)生的損失超過1.3億美元。細(xì)菌病的發(fā)生嚴(yán)重制約著家畜養(yǎng)殖業(yè)的生產(chǎn)。

Wall S K等[9]人實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，給3～4周齡的仔豬接種腸炎型鼠傷寒沙門氏菌血清，通過灌胃給予5 mL 109pfu/mL的噬菌體后，與未給予噬菌體治療的仔豬相比，在回腸、扁桃體、盲腸處的沙門菌量減少99%～99.9%。李隴平等人[10]利用噬菌體治療由金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎疾病，通過乳頭藥浴試驗(yàn)觀察，使用效價(jià)在105pfu/mL的噬菌體治療后，奶牛乳區(qū)發(fā)病率和乳頭發(fā)病率各降低了1.97%和3.33%，對預(yù)防奶牛乳房炎的發(fā)生有著顯著作用。Smith H W針對由大腸桿菌引起的犢牛腹瀉研發(fā)的噬菌體，通過口服飼喂出生6～12 h的犢牛，發(fā)現(xiàn)效價(jià)僅105pfu/mL的噬菌體便可有效降低由大腸桿菌引發(fā)的犢牛腹瀉。使用102pfu/mL的噬菌體噴灑在未清潔的牛舍中就能達(dá)到很好的預(yù)防效果[11-12]。目前，噬菌體在控制家畜的細(xì)菌性疾病方面，由于家畜復(fù)雜的消化系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)還有許多工作有待去研究和探索，但是在生物技術(shù)引領(lǐng)未來經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展的今天，這些問題會(huì)逐一被解決。

2 噬菌體與家禽細(xì)菌性疾病

我國家禽行業(yè)飼養(yǎng)量、禽蛋產(chǎn)量和消費(fèi)均居世界第一，禽肉產(chǎn)量僅次于美國[13]。但隨著集約化養(yǎng)殖模式的推廣，家禽傳染病也日趨頻發(fā)。細(xì)菌病繼發(fā)病毒感染，嚴(yán)重制約著我國養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。禽大腸桿菌病造成家禽敗血癥、肉芽腫、氣囊炎、腹膜炎、輸卵管炎等全身或局部感染；產(chǎn)氣莢膜梭菌造成的禽壞死性腸炎，每年給全球養(yǎng)禽業(yè)造成約20億美元的損失[14]；禽沙門氏菌在公共衛(wèi)生影響方面也是顯著的[15]。

美國Huff教授[16]研究發(fā)現(xiàn)，將0.1 mL含有6×105cfu/mL大腸桿菌培養(yǎng)物注射到7日齡雛雞體內(nèi)，死亡率為48%，使用劑量為108pfu/mL、104pfu/mL噬菌體干預(yù)治療后，死亡率降低到7%和10%。實(shí)驗(yàn)證明使用一定劑量的噬菌體可以有效治療細(xì)菌性疾病，替代抗生素的作用。Miller等[17]就噬菌體對產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的禽壞死性腸炎的治療效果研究顯示，噬菌體混合制劑INT-401（5株環(huán)境中分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌噬菌體混合）能使肉雞壞死性腸炎發(fā)病死亡率降低92%，且效果優(yōu)于產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素疫苗。青島農(nóng)業(yè)大學(xué)任慧英等[18]分離得到的禽沙門氏菌噬菌體vB-SpuS-Spp4，對不同來源的29株雞白痢沙門氏菌的裂解率為100%，對44株其他雞源沙門氏菌的裂解率可達(dá)68.2%。vB-SpuS-Spp4作為一株烈性噬菌體，效價(jià)高、裂解普廣，對雞白痢沙門氏菌具有很好的治療作用。與家畜相比，禽類的消化道較短，肌胃特有的物理消化方式可能使其體內(nèi)的噬菌體活性不易受到影響，在應(yīng)用方面更具優(yōu)勢。2013年2月，由美國Intralytix公司研發(fā)的針對沙門菌的噬菌體制SalmoFreshTM被美國FDA認(rèn)定為公認(rèn)GRAS產(chǎn)品，并獲批準(zhǔn)上市，為噬菌體在中國的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

3 噬菌體與水產(chǎn)細(xì)菌疾病

隨著社會(huì)的發(fā)展，人們生活水平不斷提高，飲食需求也逐漸向多樣化、多元化方向發(fā)展。水產(chǎn)品憑借其優(yōu)質(zhì)的蛋白與豐富的礦物元素等優(yōu)點(diǎn)備受人類的青睞。人類在享受社會(huì)發(fā)展帶來的利益的同時(shí)，又不斷擔(dān)心著食品安全造成的未知后果。近年來，我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，但與此同時(shí)帶來的水質(zhì)污染，嚴(yán)重影響著水產(chǎn)動(dòng)物的健康。因此，疾病控制應(yīng)與水質(zhì)凈化緊密聯(lián)系在一起。單純使用藥物進(jìn)行疾病的控制，一方面會(huì)造成水質(zhì)污染以及耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生，另一方面也耗費(fèi)大量藥品和人工，施藥不均還會(huì)影響了動(dòng)物的生長和繁殖，在經(jīng)濟(jì)上給漁業(yè)造成損失。噬菌體廣泛存在于自然界及生物體內(nèi)，利用噬菌體治療技術(shù)，不僅可以起到治療疾病的作用，也可以起到對水質(zhì)的改善，不失為一種兩全其美的辦法。

副溶血弧菌廣泛存在于海水，易富集在貝類體內(nèi)，是已被證實(shí)的導(dǎo)致包括鮑、文蛤及牡蠣在內(nèi)的多種貝類患病或死亡的病原菌[19]。胡蝶等[20]通過制備副溶血弧菌噬菌體微膠囊，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組比對照組減少了96%的細(xì)菌，且在水體中的宿主菌也減少了72%。哈維氏弧菌是一種可引起對蝦發(fā)光病及魚類潰瘍病的一種細(xì)菌，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失。Karunasagar等[21]利用噬菌體Viha10和Viha8治療對蝦發(fā)光病，通過注射噬菌體的對蝦存活率分別為88%和86%，而注射氧四環(huán)素和卡那霉素的對蝦存活率為68%和65%，顯然該噬菌體治療效果優(yōu)于抗生素。Park等人[22]研究了單一噬菌體與噬菌體混合液在治療香魚變形假單胞菌方面的研究，研究結(jié)果顯示，混合液造成的死亡率比單一噬菌體給藥死亡率降低50%，證明在實(shí)際應(yīng)用中，噬菌體雞尾酒療法無疑是一種較好的選擇。

4 噬菌體在人類細(xì)菌疾病中的研究

在前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果較滿意的情況下，噬菌體治療也逐漸向人類發(fā)展。在美國進(jìn)行的安全性試驗(yàn)結(jié)果表明，將高濃度的噬菌體應(yīng)用于人的鼻腔黏膜、口腔、皮下和靜脈，在人體上試驗(yàn)了12年，最終發(fā)現(xiàn)只有輕微的副反應(yīng)[23]。

科羅拉多大學(xué)Anschutz醫(yī)學(xué)院研究人員在Nature Microbiology發(fā)表文章，揭示噬菌體與炎癥性腸?。↖BD）之間的關(guān)系。Breck Duerkop博士發(fā)現(xiàn)微生物菌群對維持腸道健康至關(guān)重要，這些生物組成的變化可能會(huì)引起機(jī)體炎癥反應(yīng)。炎癥性腸病患者腸黏膜表面的噬菌體數(shù)量和豐度頗高，這表明噬菌體可能在IBD中起著某種未知的作用。后期他們希望采用噬菌體療法來促進(jìn)益生菌的生長，治療炎癥性腸炎[24]。

5 噬菌體在治療細(xì)菌性疾病方面的優(yōu)缺點(diǎn)

噬菌體是一類裂解殺滅細(xì)菌的生物因子，有嚴(yán)格的宿主特異性，相較于傳統(tǒng)抗生素具有更高效和更專一的殺菌能力。它不會(huì)破壞宿主體內(nèi)正常菌群，能夠提高腸道有益菌的比例，且噬菌體殺菌后能夠自然排出體外，不會(huì)造成藥物殘留，被人類認(rèn)為是一種潛在的理想抗生素替代品。噬菌體廣泛存在于自然界及生物體內(nèi)，據(jù)估計(jì)地球噬菌體的數(shù)量高達(dá)1031個(gè)，易分離，治療副作用較小，研發(fā)所需的時(shí)間短。通過一定工藝研究噬菌體與細(xì)菌的比例、最適培養(yǎng)基、發(fā)酵參數(shù)等，利用噬菌體發(fā)酵技術(shù)，約4 h，噬菌體便可增殖到107pfu/mL。所以，利用發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)噬菌體產(chǎn)品，成本低、耗時(shí)短，噬菌體效價(jià)高，已成為生產(chǎn)噬菌體的一種主要技術(shù)手段。

噬菌體在應(yīng)用過程中產(chǎn)生抗性菌的突變頻率明顯低于抗生素產(chǎn)生抗性菌的突變頻率。噬菌體的治療效率較高，可在感染部位增殖，并且增殖很快，只需少量的噬菌體就可以完成大量殺滅細(xì)菌的工作，適用于人類醫(yī)藥、植物健康、動(dòng)物健康、食品安全、飼料添加劑等領(lǐng)域。2006年FDA批準(zhǔn)李斯特菌噬菌體雞尾酒；2007年比利時(shí)布魯塞爾批準(zhǔn)噬菌體治療；2014年歐盟簽訂用噬菌體治療人類細(xì)菌感染跨國臨床研究計(jì)劃；2015年噬菌體納入俄羅斯聯(lián)邦國家藥典十三版。目前市面上的產(chǎn)品有青島諾安百特生產(chǎn)的諾安梭清，應(yīng)用于產(chǎn)氣莢膜梭菌的感染；漿炎清應(yīng)用于鴨疫里默氏桿菌的感染；諾安弧克、諾安弧凈系列應(yīng)用于水產(chǎn)弧菌的感染；菲吉樂科公司已完成針對防治禽類飼養(yǎng)及屠宰加工過程中出現(xiàn)的細(xì)菌性感染的噬菌體制劑產(chǎn)品；針對豬飼養(yǎng)過程中的痢疾、子宮內(nèi)膜炎等細(xì)菌性病害及環(huán)境消毒的噬菌體制劑產(chǎn)品；針對牛飼養(yǎng)過程中的乳房炎、子宮內(nèi)膜炎及環(huán)境消毒的噬菌體制劑產(chǎn)品；針對南美白對蝦早死綜合癥（EMS）的噬菌體制劑的研發(fā)。此外，動(dòng)物健康、食品安全、環(huán)境治理以及農(nóng)作物健康方向的產(chǎn)品正在研發(fā)。

噬菌體在治療疾病時(shí)，也會(huì)產(chǎn)生一些不良因素。馬曉麗等人[25]發(fā)現(xiàn)活性噬菌體的數(shù)量在注射入血后的數(shù)量隨時(shí)間驟降，5 min后剩余約50%，15 min時(shí)已減少至不到20%。該研究組認(rèn)為，血清中存在的某些免疫因子可能是導(dǎo)致噬菌體失活的主要因素，且很可能是由IgM介導(dǎo)的補(bǔ)體所引發(fā)；溫和噬菌體不具有裂解細(xì)菌的作用，而是將其基因組整合到宿主菌的基因組上，有可能會(huì)使宿主菌獲得毒力因子；噬菌體的藥物動(dòng)力學(xué)特征復(fù)雜，因而在給藥的時(shí)間以及劑量方面不易把握；噬菌體本身攜帶毒力因子且裂解細(xì)菌時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生內(nèi)毒素等有害物質(zhì)。

6 展望

任何事物都有兩面性，在利大于弊的同時(shí)，如何避免減少不利因素的產(chǎn)生，是科研工作者一直追求的方向。針對其不利因素的產(chǎn)生，科研工作者已研究出一系列解決辦法。針對噬菌體產(chǎn)生的毒素問題，可以先將其純化，再用來治療；選擇烈性噬菌體用來治療，采用噬菌體混合劑（雞尾酒）療法可拓寬其裂解譜，治療效果更好；利用分子生物學(xué)技術(shù)或基因工程表達(dá)或改造噬菌體，使其具有更好的噬菌能力。

隨著生物技術(shù)的不斷創(chuàng)新，相信會(huì)有更多更好的噬菌體被研發(fā)出來用來治療細(xì)菌疾病。面對細(xì)菌耐藥形勢的日益嚴(yán)峻，高效、安全、低殘留的抗生素替代品—噬菌體制劑將會(huì)走向未來獸藥市場。