miR-652-5p 在肝細(xì)胞癌患者血清中的表達(dá)水平及臨床意義

徐海燕 蒙積麗 符韶曲 李菲菲

肝細(xì)胞癌（HCC）是一種惡性程度較高的消化系統(tǒng)腫瘤，盡管近年來HCC 的診斷和治療取得了較大突破，但HCC 患者的生存率仍較低[1]。miRNA是一類長(zhǎng)度為20～25 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，其通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及遷移，在HCC 的發(fā)生和進(jìn)展中起著重要作用[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)miR-652 在HCC 患者腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，其過度表達(dá)促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞增殖，可為HCC 的診斷及治療提供參考[4]。甲胎蛋白（AFP）是目前臨床上已被廣泛應(yīng)用于HCC 診斷的腫瘤標(biāo)志物，在HCC 的輔助診斷和療效監(jiān)測(cè)方面具有重要意義[5]。異常凝血酶原-Ⅱ（PIVKA-Ⅱ）是一種主要由肝細(xì)胞合成的前體蛋白，其表達(dá)水平升高與肝細(xì)胞病變有關(guān)，在HCC 的早期診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)方面具有較好的應(yīng)用前景[6]。目前關(guān)于miR-652-5p 聯(lián)合AFP 及PIVKA-Ⅱ在HCC 診斷中的應(yīng)用價(jià)值尚未明確。本研究檢測(cè)了HCC 患者的血清miR-652-5p、AFP 和PIVKA-Ⅱ表達(dá)水平，并分析3 項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)對(duì)HCC 的診斷價(jià)值，旨在為HCC 的診療提供參考依據(jù)。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2019 年1 月至2022 年3 月東方市人民醫(yī)院和海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院收治的105 例HCC患者和60 例肝硬化患者，分別設(shè)為HCC 組和肝硬化組。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）HCC 的診斷符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2019 年版）》[7]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，肝硬化的診斷符合《肝硬化診治指南》[8]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）均為HBV 感染者；（3）入組前均未曾接受HCC 相關(guān)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他肝炎、惡性腫瘤及免疫系統(tǒng)疾病者；（2）臨床資料不完整；（3）近1 個(gè)月內(nèi)曾服用激素、免疫抑制劑等。HCC 組中男性68 例，女性37 例，年齡42～79 歲，平均年齡為（56.93±8.42）歲；肝硬化組中男性39 例，女性21 例，年齡40 ～78 歲，平均年齡為（56.70±8.53）歲。另選取50 名同期于該院進(jìn)行體檢的健康志愿者設(shè)為對(duì)照組，其中男性30 名，女性20 名，年齡42～76 歲，平均年齡為 （57.15±7.84）歲。所有受試者均知情同意并簽署同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 臨床資料收集

收集所有受試者的臨床基線資料，包括性別、年齡、吸煙史（連續(xù)或累計(jì)吸煙≥6 個(gè)月）、飲酒史（連續(xù)或累計(jì)飲酒≥12 個(gè)月）、血小板計(jì)數(shù)（PLT）、ALT、AST 和總膽紅素（TBil）等。105 例HCC 患者中，TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期67 例，Ⅲ～Ⅳ期38 例；高分化28 例，中分化43 例，低分化34 例；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移26 例，有門靜脈癌栓20 例。

1.3 血清miR-652-5p、AFP 和PIVKA-Ⅱ的表達(dá)水平檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)各組的血清miR-652-5p 表達(dá)水平。HCC 組和肝硬化組于入院次日采集空腹肘靜脈血5 mL，對(duì)照組在體檢時(shí)采集空腹肘靜脈血5 mL，3 500 r/min 離心10 min，分離血清。使用ABI 7500 型PCR 儀檢測(cè)miR-652-5p表達(dá)水平，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；之后94 ℃變性15 s，55 ℃退火 30 s，70 ℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)。以U6 作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算miR-652-5p 的相對(duì)表達(dá)量。另使用羅氏Cobas e601型全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光分析儀及配套試劑盒[購(gòu)自羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司]測(cè)定血清AFP 和PIVKA-Ⅱ表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用SNK-q檢驗(yàn)，2 組間比較采用成組t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用ROC 曲線分析血清miR-652-5p、AFP 和PIVKA-Ⅱ表達(dá)水平對(duì)HCC 的診斷價(jià)值。采用Pearson 相關(guān)系數(shù)法分析HCC 患者的血清miR-652-5p 表達(dá)水平與血清AFP 和PIVKA-Ⅱ表達(dá)水平的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組臨床基線資料比較

HCC 組和肝硬化組血清ALT、AST 和TBil 水平均顯著高于對(duì)照組，且肝硬化組的TBil 水平顯著高于HCC 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.001）。3 組的性別、年齡、吸煙史、飲酒史和PLT 水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見表2。

2.2 各組血清miR-652-5p、AFP 和PIVKA-Ⅱ的表達(dá)水平比較

HCC 組的血清miR-652-5p、AFP 和PIVKA-Ⅱ表達(dá)水平均顯著高于肝硬化組和對(duì)照組，且肝硬化組的血清miR-652-5p 和AFP 表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.001）。見表3。

表3 各組血清miR-652-5p、AFP 和PIVKA-Ⅱ的表達(dá)水平比較

2.3 血清miR-652-5p 表達(dá)水平與HCC 患者臨床病理特征的關(guān)系

結(jié)果顯示，TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化、有門靜脈癌栓和有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的HCC 患者的血清miR-652-5p 表達(dá)水平分別高于Ⅰ～Ⅱ期、中～高分化、無門靜脈癌栓和無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的HCC 患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.001）。見表4。

表4 血清miR-652-5p 表達(dá)水平與HCC 患者臨床病理特征的關(guān)系

2.4 血清miR-652-5p、AFP 和PIVKA-Ⅱ?qū)CC 的診斷價(jià)值

ROC 曲線分析結(jié)果顯示，血清miR-652-5p、AFP 和PIVKA-Ⅱ表達(dá)水平診斷HCC 的最佳截?cái)嘀捣謩e為2.25、143.62 ng/mL 和177.15 mAU/mL。3 項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)診斷HCC 的AUC 均大于miR-652-5p（Z＝6.127，P＝0.000）、AFP（Z＝7.713，P＝0.000） 和PIVKA-Ⅱ（Z＝6.548，P＝0.000） 單項(xiàng)檢測(cè)， 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.001），且聯(lián)合檢測(cè)的準(zhǔn)確度最高（92.26%）。此外，與血清AFP 和PIVKA-Ⅱ比較，血清miR-652-5p 診斷HCC 的敏感度和特異度均較高。見表5 和圖1。

圖1 血清miR-652-5p、AFP 和PIVKA-Ⅱ診斷HCC 的ROC 曲線

表5 血清miR-652-5p、AFP 和PIVKA-Ⅱ?qū)CC 的診斷價(jià)值

2.5 HCC 患者血清miR-652-5p 表達(dá)水平與AFP 和PIVKA-Ⅱ表達(dá)水平的相關(guān)性

Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，HCC 患者的血清miR-652-5p 表達(dá)水平與血清AFP 和PIVKA-Ⅱ表達(dá)水平均呈正相關(guān)（r＝0.774，P＜0.001；r＝0.825，P＜0.001）。見圖2。

圖2 血清miR-652-5p 表達(dá)水平與血清AFP 和PIVKA-Ⅱ表達(dá)水平的相關(guān)性分析 A miR-652-5p 與AFP B miR-652-5p 與PIVKA-Ⅱ

3 討論

HCC 是一種常見的惡性腫瘤，血清學(xué)標(biāo)志物對(duì)于HCC 的早期診斷具有重要價(jià)值[8]。AFP 是常用的腫瘤標(biāo)志物，但其診斷HCC 的敏感度不高，容易造成漏診，存在一定的局限性。PIVKA-Ⅱ是一種新型腫瘤標(biāo)志物，其診斷HCC 的敏感度較高，可作為AFP 陰性患者的輔助檢測(cè)指標(biāo)[9]。以往研究表明，PIVKA-Ⅱ可通過誘導(dǎo)HCC 細(xì)胞增殖、分化及血管生成而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，可作為HCC 早期篩查及預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物[10]。miRNA 與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等有關(guān)，在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要作用[11]。越來越多研究表明，miRNA 異常表達(dá)與HCC 的發(fā)生和預(yù)后有關(guān)，可為HCC 的診斷、預(yù)后預(yù)測(cè)和靶向治療提供幫助[12-13]。miR-652-5p 具有高度穩(wěn)定性且在血液中循環(huán)，研究表明其在食管鱗癌患者中異常表達(dá)，可通過調(diào)節(jié)不同靶基因影響腫瘤進(jìn)展，在腫瘤的診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)中具有重要價(jià)值[14]。

本研究結(jié)果顯示，HCC 組的血清miR-652-5p、AFP 和PIVKA-Ⅱ表達(dá)水平均顯著高于肝硬化組和對(duì)照組，這提示miR-652-5p 具有促癌作用，其高表達(dá)可能促進(jìn)HCC 發(fā)生。王雪容等[15]的研究表明，miR-652 可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲參與HCC 病程進(jìn)展，可作為HCC 潛在的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物。本研究還發(fā)現(xiàn)，TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化、有門靜脈癌栓和有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的HCC 患者的血清miR-652-5p 表達(dá)水平分別高于Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、無門靜脈癌栓和無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者，這提示miR-652-5p 可能促進(jìn)了HCC 的進(jìn)展。Peng 等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 在HCC 組織中異常表達(dá)，其參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及凋亡過程，在HCC 的發(fā)生和進(jìn)展中起著重要作用，并可用于臨床診斷早期HCC。

Ziogas 等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 在HCC 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中發(fā)揮著促進(jìn)作用，在HCC的診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)中具有較好的應(yīng)用前景。以往研究表明AFP、PIVKA-Ⅱ與HCC 的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)，但AFP 單獨(dú)診斷HCC 的效能較低，而AFP與PIVKA-Ⅱ聯(lián)合檢測(cè)可提高對(duì)HCC 的診斷效能（AUC 為0.854）[18]。另有研究表明，HCC 患者的血清PIVKA-Ⅱ和AFP 表達(dá)水平均顯著高于良性肝病組和健康對(duì)照組，2 項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)診斷HCC 的敏感度和特異度均較高，對(duì)診斷早期HCC 具有重要的臨床意義[19]。本研究結(jié)果顯示，血清miR-652-5p 診斷HCC 的敏感度和特異度均較高，且其與血清AFP及PIVKA-Ⅱ聯(lián)合檢測(cè)診斷HCC 的AUC 較大，這提示3 項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)對(duì)HCC 的診斷價(jià)值較高。本研究還發(fā)現(xiàn)，HCC 患者的血清miR-652-5p 表達(dá)水平與血清AFP 及PIVKA-Ⅱ表達(dá)水平均呈正相關(guān)。

綜上所述，HCC 患者的血清miR-652-5p 表達(dá)上調(diào)，其參與了HCC 的發(fā)生和進(jìn)展過程。血清miR-652-5p 與血清AFP 及PIVKA-Ⅱ聯(lián)合檢測(cè)有助于提高HCC 診斷的準(zhǔn)確度，有潛力作為診斷HCC的生物標(biāo)志物組合檢測(cè)方案。本研究的樣本量較小，可能使結(jié)果產(chǎn)生偏倚，有待今后擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證本研究結(jié)論。