CDK5RAP1 通過Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路調(diào)控結(jié)直腸癌發(fā)生和進(jìn)展的研究

蔣漫琦 何師茜 楊 洪 周曉倩

結(jié)直腸癌（CRC）是消化道常見惡性腫瘤，CRC 患者的早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期，從而增加了臨床治療的難度[1]。因此，亟需探索新的靶點(diǎn)以提高CRC 的療效。多條信號(hào)通路失調(diào)在CRC 的發(fā)生和進(jìn)展中起著重要作用。Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-Catenin）信號(hào)過度激活可促進(jìn)CRC 的發(fā)生和進(jìn)展[2]。研究表明可通過抑制Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路以抑制CRC 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[3]。周期素依賴性激酶5 激活結(jié)合蛋白1（CDK5RAP1）與細(xì)菌MiaB 蛋白同源，是一種自由基S-腺苷蛋氨酸（SAM）酶[4]。CDK5RAP1與細(xì)胞凋亡間的關(guān)系已得到證實(shí)，研究發(fā)現(xiàn)CDK5RAP1 缺乏可以通過活性氧/c-Jun N 末端激酶（ROS/JNK）信號(hào)通路誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的周期停滯和凋亡[5]。目前鮮有CDK5RAP1 在CRC 發(fā)生和進(jìn)展中作用的相關(guān)研究報(bào)道，本課題組的前期研究結(jié)果顯示，CRC 組織中CDK5RAP1 的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，推測(cè)其可能參與了CRC 發(fā)生和進(jìn)展的調(diào)控。本研究探討了CDK5RAP1 通過Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路對(duì)CRC 發(fā)生和進(jìn)展的影響及機(jī)制，以期為CRC 患者的臨床治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2020 年6 月至2022 年9 月在貴陽市第一人民醫(yī)院被首診為CRC 的72 例患者的CRC 組織和癌旁組織（距腫瘤組織邊緣＞3 cm）。所有患者在術(shù)前均未接受化學(xué)治療、放射治療或其他抗腫瘤治療。將手術(shù)切除組織分成2 份，1 份組織用于實(shí)時(shí)熒光定量RCR 法檢測(cè)，另1 份用4%多聚甲醛溶液固定后用于免疫組織化學(xué)染色分析。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入選者均簽署知情同意書。

本研究采用的人CRC 細(xì)胞系HCT-116、SW480、HT29、SW620、Caco-2 及人正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞系NCM460 均購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫。18 只4～5 周齡BALB/C 裸鼠，雌雄各半，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，本研究獲得醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

CCK-8 試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Wnt 激活劑HLY78 購自美國(guó)MCE 公司；Matrigel 基質(zhì)膠購自美國(guó)BD 公司；TRIzol 試劑購自杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司；Aurum Total RNA Mini Kit 試劑盒和iScript? cDNA Synthesis Kit試劑盒均購自美國(guó)BIO-RAD 公司；Lipofectamine?3000 轉(zhuǎn)染試劑購自美國(guó)Invitrogen 公司；β-Catenin、Axin1、c-Myc、CD133、CD44、SOX2、β-actin 一抗和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔（ab288151）二抗均購自英國(guó)Abcam 公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

所有細(xì)胞均在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于5% CO2、37 °C 細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組

將各CRC 細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種至6 孔板，待細(xì)胞密度為60%～70% 時(shí)，使用Lipofectamine?3000 轉(zhuǎn)染試劑分別將si-NC 和si-CDK5RAP1 轉(zhuǎn)染至HCT-116 細(xì)胞中，分別將pc-NC和pc-CDK5RAP1 轉(zhuǎn)染至SW480 細(xì)胞中，再培養(yǎng)48 h 以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將SW480 細(xì)胞分為SW480-CON 組（正常培養(yǎng)細(xì)胞）、SW480-pc-NC 組（陰性對(duì)照細(xì)胞，轉(zhuǎn)染CDK5RAP1 過表達(dá)質(zhì)粒pc-NC）、SW480-pc-CDK5RAP1 組（過表達(dá)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染CDK5RAP1 過表達(dá)質(zhì)粒pc-CDK5RAP1）和SW480-HLY78 組（SW480-pc-CDK5RAP1+20 μmol/L Wnt激活劑HLY78）[6]，將HCT-116 細(xì)胞分為HCT-116-CON 組（正常培養(yǎng)）、HCT-116-si-NC 組（陰性對(duì)照細(xì)胞，轉(zhuǎn)染CDK5RAP1 siRNA si-NC）、HCT-116-si-CDK5RAP1 組（低表達(dá)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染CDK5RAP1 siRNA si-CDK5RAP1）和HCT-116-HLY78 組（HCT-116-si-CDK5RAP1+20 μmol/L HLY78）[6]。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)組織和細(xì)胞中CDK5RAP1 的表達(dá)情況

使用Trizol 試劑提取組織和CRC 細(xì)胞中的總RNA，測(cè)定其濃度，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算目標(biāo)基因CDK5RAP1 的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)組織中CDK5RAP1的表達(dá)情況

將組織固定、脫水、石蠟包埋、切片（5 μm 厚），將組織切片經(jīng)TRIS 緩沖鹽溶液預(yù)孵育后，用10%山羊血清封閉，與CDK5RAP1 一抗在4 ℃下孵育過夜，再與二抗在室溫下持續(xù)孵育2 h，DAB 顯色后行蘇木精復(fù)染，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 CCK-8 法檢測(cè)CRC 細(xì)胞增殖情況

將各組CRC 細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的密度接種至96 孔板培養(yǎng)48 h，棄上清，每孔加入含10 μL CCK-8 的完全培養(yǎng)液100 μL，37 ℃下孵育2 h，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)495 nm 處的吸光度（OD），并計(jì)算細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白孔（不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液）調(diào)零。細(xì)胞存活率＝（OD實(shí)驗(yàn)-OD空白）/（OD對(duì)照-OD空白）×100%，其中OD實(shí)驗(yàn)為基因過表達(dá)組或基因敲低組細(xì)胞的OD 值，OD對(duì)照為CON 組細(xì)胞的OD 值，OD空白為空白孔的OD 值。

1.8 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CRC 細(xì)胞的克隆情況

將各組CRC 細(xì)胞接種至6 孔板（500 個(gè)/孔），37 ℃下培養(yǎng)14 d 后，用4%多聚甲醛溶液固定30 min，用0.5%結(jié)晶紫染色，水洗，干燥，肉眼計(jì)數(shù)克隆的細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞克隆率＝細(xì)胞克隆數(shù)/細(xì)胞接種數(shù)×100%。

1.9 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CRC 細(xì)胞的侵襲能力

使用基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸各組CRC 細(xì)胞，使其密度調(diào)整為5×105個(gè)/mL。Transwell 小室預(yù)涂有稀釋后的Matrigel 基質(zhì)膠（預(yù)冷基礎(chǔ)培養(yǎng)液以1 ∶3 體積比稀釋）。將200 μL 細(xì)胞液加入上室，下室加入500 μL 完全培養(yǎng)基，在37 ℃下孵育48 h 后，用4%多聚甲醛溶液固定下室細(xì)胞10 min，用0.1%結(jié)晶紫染色30 min。在顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞侵襲數(shù)量，結(jié)果取平均值。

1.10 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CRC 細(xì)胞的遷移能力

將各組CRC 細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種至6 孔板，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用10 μL 移液槍槍頭豎直向上劃痕，在顯微鏡下拍照并記錄0 h、48 h 細(xì)胞劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞劃痕愈合率。劃痕愈合率＝（0 h 細(xì)胞劃痕寬度-48 h劃痕寬度）/0 h 細(xì)胞劃痕寬度×100%。

1.11 腫瘤細(xì)胞成球試驗(yàn)

在各組細(xì)胞中加入成球培養(yǎng)基，在低黏附的6 孔板中培養(yǎng)10 d，在顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野觀察細(xì)胞成球情況并拍照，使用Image J 軟件計(jì)數(shù)直徑≥75 μm 的腫瘤球數(shù)量，并計(jì)算成球率。成球率＝腫瘤球數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%，腫瘤細(xì)胞成球率取5 個(gè)視野的平均值。

1.12 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)組織和細(xì)胞中蛋白的表達(dá)情況

CRC 組織、癌旁組織和各組細(xì)胞使用RIPA裂解液提取總蛋白，使用BCA 法檢測(cè)濃度。蛋白質(zhì)變性后使用10% SDS-PAGE 分離總蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，加入β-Catenin、Axin1、c-Myc、CD133、CD44、SOX2 和β-actin 一抗，在4 ℃下孵育過夜，用HRP 偶聯(lián)的二抗孵育2 h，洗滌，使用ECL 液顯色，使用Image J 軟件對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行定量分析。

1.13 裸鼠體內(nèi)移植瘤實(shí)驗(yàn)

將18 只裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、si-NC 組和si-CDK5RAP1 組，每組6 只。分別向各組裸鼠右前肢腋下注射對(duì)應(yīng)的HCT-116 細(xì)胞懸液，每只注射4×106個(gè)細(xì)胞，5 周后以頸椎脫臼法處死裸鼠，剝離腫瘤組織并稱重觀察。

1.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)數(shù)資料以例（%）表示。2 組間數(shù)據(jù)比較采用SNK-q檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRC 組織和癌旁組織中CDK5RAP1 的表達(dá)情況

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)結(jié)果顯示，CRC 組織中CDK5RAP1 的表達(dá)水平較癌旁組織顯著升高（P＜0.05）；免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，CRC 組織中CDK5RAP1 陽性表達(dá)率較癌旁組織顯著升高（P＜0.05）。見表2、圖1。

表2 CRC 組織和癌旁組織中CDK5RAP1 的表達(dá)情況

2.2 各細(xì)胞中CDK5RAP1 的表達(dá)水平

如表3 所示，與NCM460 細(xì)胞相比，HCT-116、SW480、HT29、SW620、Caco-2 細(xì)胞中CDK5RAP1的表達(dá)水平均顯著升高（P均＜0.05）， 并且CDK5RAP1 在HCT-116 細(xì)胞中表達(dá)水平最高，在SW480 細(xì)胞中表達(dá)水平最低，故分別采用HCT-116細(xì)胞和SW480 細(xì)胞構(gòu)建CDK5RAP1 基因敲低和過表達(dá)的慢病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。

表3 各細(xì)胞中CDK5RAP1 的表達(dá)水平

2.3 各組CRC 細(xì)胞中CDK5RAP1 的表達(dá)水平

如表4 所示，SW480-pc-CDK5RAP1 組細(xì)胞中CDK5RAP1 的表達(dá)水平較SW480-CON 組和SW480-pc-NC 組細(xì)胞均顯著升高（P均＜0.05），SW480-HLY78 組 與SW480-pc-CDK5RAP1 組 細(xì) 胞中CDK5RAP1 的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。如表5 所示，HCT-116-si-CDK5RAP1 組細(xì)胞中CDK5RAP1 的表達(dá)水平較HCT-116-CON 組和HCT-116-si-NC 組細(xì)胞均顯著降低（P均＜0.05），HCT-116-HLY78 組與HCT-116-si-CDK5RAP1 組細(xì)胞中CDK5RAP1 的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 各組 SW480 細(xì)胞中CDK5RAP1 的表達(dá)水平

表5 各組HCT-116 細(xì)胞中CDK5RAP1 的表達(dá)水平

2.4 各組CRC 細(xì)胞的增殖和克隆情況

4SW480-pc-CDK5RAP1 組細(xì)胞存活率和克隆率較SW480-CON 組和SW480-pc-NC 組細(xì)胞均顯著升高（P均＜0.05），SW480-HLY78 組細(xì)胞存活率和克隆率較SW480-pc-CDK5RAP1 組細(xì)胞均顯著升高（P均＜0.05），見表6、圖2。HCT-116-si-CDK5RAP1 組細(xì)胞存活率和克隆率較HCT-116-CON 組和HCT-116-si-NC 組細(xì)胞均顯著降低（P均＜0.05），HCT-116-HLY78 組細(xì)胞存活率和克隆率較HCT-116-si-CDK5RAP1 組細(xì)胞均顯著升高（P均＜0.05），見表7、圖3。

圖2 各組 SW480 細(xì)胞的克隆情況 A SW480-CON 組 B SW480-pc-NC 組 C SW480-pc-CDK5RAP1 組 D SW480-HLY78 組

圖3 各組HCT-116 細(xì)胞的克隆情況 A HCT-116-CON 組 B HCT-116-si-NC 組 C HCT-116-si-CDK5RAP1 組 D HCT-116-HLY78 組

表6 各組 SW480 細(xì)胞的增殖和克隆情況

表7 各組HCT-116 細(xì)胞的增殖和克隆情況

2.5 各組CRC 細(xì)胞的遷移和侵襲情況

SW480-pc-CDK5RAP1 組的細(xì)胞劃痕愈合率和細(xì)胞侵襲數(shù)量較SW480-CON 組和SW480-pc-NC 組均顯著升高（P均＜0.05），SW480-HLY78 組的細(xì)胞劃痕愈合率和細(xì)胞侵襲數(shù)量較SW480-pc-CDK5RAP1 組均顯著升高（P均＜0.05），見表8、圖4 和圖5。HCT-116-si-CDK5RAP1 組的細(xì)胞劃痕愈合率和細(xì)胞侵襲數(shù)量較HCT-116-CON 組和HCT-116-si-NC 組均顯著降低（P均＜0.05），HCT-116-HLY78 組的細(xì)胞劃痕愈合率和細(xì)胞侵襲數(shù)量較HCT-116-si-CDK5RAP1 組均顯著升高（P均＜0.05），見表9、圖6 和圖7。

圖4 各組SW480 細(xì)胞的遷移情況 ×100 A 遷移0 h B 遷移48 h

圖5 各組SW480 細(xì)胞的侵襲情況 ×400 A SW480-CON 組 B SW480-pc-NC 組 C SW480-pc-CDK5RAP1 組 D SW480-HLY78 組

圖6 各組HCT-116 細(xì)胞的遷移情況 ×100 A 遷移0 h B 遷移48 h

圖7 各組HCT-116 細(xì)胞的侵襲情況 ×400 A HCT-116-CON 組 B HCT-116-si-NC 組 C HCT-116-si-CDK5RAP1 組 D HCT-116-HLY78 組

表8 各組SW480 細(xì)胞的遷移和侵襲情況

2.6 各組CRC 細(xì)胞的腫瘤球形成情況

SW480-pc-CDK5RAP1 組細(xì)胞的成球率較SW480-CON 組和SW480-pc-NC 組均顯著升高（P均＜0.05），SW480-HLY78 組細(xì)胞的成球率較SW480-pc-CDK5RAP1 組顯著升高（P＜0.05），見表10、圖8。HCT-116-si-CDK5RAP1 組細(xì)胞的成球率較HCT-116-CON 組和HCT-116-si-NC 組均顯著降低（P均＜0.05），HCT-116-HLY78 組細(xì)胞的成球率較HCT-116-si-CDK5RAP1 組顯著升高（P＜0.05），見表11、圖9。

圖8 各組SW480 細(xì)胞的腫瘤球形成情況 ×100 A SW480-CON 組 B SW480-pc-NC 組 C SW480-pc-CDK5RAP1 組 D SW480-HLY78 組

圖9 各組HCT-116 細(xì)胞的腫瘤球形成情況 ×100 A HCT-116-CON 組 B HCT-116-si-NC 組 C HCT-116-si-CDK5RAP1 組D HCT-116-HLY78 組

表10 各組SW480 細(xì)胞的腫瘤球形成情況

表11 各組HCT-116 細(xì)胞的腫瘤球形成情況

2.7 各組CRC 細(xì)胞中蛋白的表達(dá)水平

與SW480-CON 組和SW480-pc-NC 組相比，SW480-pc-CDK5RAP1 組細(xì)胞中β-Catenin、c-Myc、CD133、CD44、SOX2 蛋白的表達(dá)水平均顯著升高，Axin1 蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P均＜0.05）；與SW480-pc-CDK5RAP1 組相比，SW480-HLY78 組細(xì) 胞 中β-Catenin、c-Myc、CD133、CD44、SOX2蛋白表達(dá)水平均顯著升高，Axin1 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P均＜0.05）；見表12、圖10。與HCT-116-CON 組 和HCT-116-si-NC 組 比，HCT-116-si-CDK5RAP1 組細(xì)胞中β-Catenin、c-Myc、CD133、CD44、SOX2 蛋白表達(dá)水平均顯著降低，Axin1 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P均＜0.05）；與HCT-116-si-CDK5RAP1 組相比，HCT-116-HLY78 組細(xì)胞中β-Catenin、c-Myc、CD133、CD44、SOX2 蛋白表達(dá)水平均顯著升高，Axin1 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P均＜0.05）；見表13、圖11。

圖10 各組SW480 細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平

圖11 各組HCT-116 細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平

表12 各組SW480 細(xì)胞中蛋白的表達(dá)水平

表13 各組HCT-116 細(xì)胞中蛋白的表達(dá)水平

2.8 敲低CDK5RAP1 基因表達(dá)對(duì)裸鼠移植瘤的影響

如表14、圖12 所示，si-CDK5RAP1 組裸鼠移植瘤的質(zhì)量較CON 組和si-NC 組均顯著降低（P均＜0.05），體積也均顯著縮小。

圖12 各組裸鼠移植瘤的體積

表14 各組裸鼠移植瘤的質(zhì)量

3 討論

CRC 是全球常見消化道惡性腫瘤之一，盡管臨床診斷和綜合治療顯著延長(zhǎng)了部分患者的生存期，但CRC 轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后仍較差[7-8]。目前靶向治療已成為CRC 轉(zhuǎn)移患者的治療方法之一，尋找新的靶點(diǎn)對(duì)于改善CRC 患者的治療結(jié)果非常重要。CDK5 是一種脯氨酸介導(dǎo)的絲氨酸/蘇氨酸激酶，研究發(fā)現(xiàn)CDK5 在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，而CDK5 表達(dá)上調(diào)則可抑制胃癌發(fā)生[9]。此外，許多研究報(bào)道CDK5 還與前列腺癌、甲狀腺髓樣癌、肝細(xì)胞癌、肺癌及CRC 均有相關(guān)性[10]。CDK5RAP1是CDK5 的內(nèi)源性抑制劑，CDK5RAP1 過表達(dá)可顯著抑制CDK5 的活性[11]。Yamamoto 等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，DK5RAP1 可以維持膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞（GIC）的自我更新能力、未分化狀態(tài)及致瘤潛力。本研究結(jié)果顯示，CRC 組織中CDK5RAP1 的表達(dá)水平較癌旁組織顯著升高，各CRC 細(xì)胞中CDK5RAP1 的表達(dá)水平也均顯著高于正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞，且CDK5RAP1 在HCT-116 細(xì)胞中表達(dá)水平最高，在SW480 細(xì)胞中表達(dá)水平最低，表明CDK5RAP1在CRC 組織和細(xì)胞中呈高表達(dá)。為進(jìn)一步探索CDK5RAP1 在CRC 中的作用，本研究選用HCT-116細(xì)胞和SW480 細(xì)胞分別構(gòu)建了CDK5RAP1 基因敲低和過表達(dá)的慢病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，結(jié)果顯示CDK5RAP1 基因過表達(dá)時(shí)，SW480 細(xì)胞的存活率、細(xì)胞克隆率、細(xì)胞劃痕愈合率及細(xì)胞侵襲數(shù)量均顯著升高；CDK5RAP1 基因敲低時(shí)，HCT-116 細(xì)胞的存活率、細(xì)胞克隆率、細(xì)胞劃痕愈合率及細(xì)胞侵襲數(shù)量均顯著降低，表明CDK5RAP1 在CRC 中起著促癌作用，CDK5RAP1 表達(dá)下調(diào)可抑制CRC的發(fā)生和進(jìn)展。為了探索CDK5RAP1 在機(jī)體內(nèi)的作用，本研究將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HCT-116 細(xì)胞皮下注射到裸鼠體內(nèi)，5 周后發(fā)現(xiàn)CDK5RAP1 低表達(dá)的si-CDK5RAP1 組裸鼠的移植瘤質(zhì)量明顯低于CON 組，表明CDK5RAP1 參與了裸鼠體內(nèi)CRC 的發(fā)生。

Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路與細(xì)胞的增殖、分化、遷移和存活相關(guān)[13]。該信號(hào)通路異常激活是CRC發(fā)生和進(jìn)展的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素，可促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和復(fù)發(fā)[14]。β-Catenin 是Wnt/β-Catenin 通路的關(guān)鍵調(diào)控因子，β-Catenin 進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子（TCF）結(jié)合，激活下游基因（CD44 和c-Myc）的轉(zhuǎn)錄，從而增強(qiáng)CRC 的干性并促進(jìn)CRC 進(jìn)展[15]。Axin1 是Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路的重要負(fù)向調(diào)節(jié)劑，Axin1低表達(dá)會(huì)導(dǎo)致β-Catenin 和下游癌基因過度轉(zhuǎn)錄，從而促使腫瘤發(fā)生。多種腫瘤中存在Axin1 表達(dá)下調(diào)，如肝細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌和胃癌，誘導(dǎo)Axin1 表達(dá)上調(diào)是Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路依賴性腫瘤的新療法[16-18]。CD133 和CD44 是人CRC 干細(xì)胞的重要標(biāo)志物，CD133 是腫瘤干細(xì)胞上表達(dá)的五跨膜糖蛋白，CD44 參與腫瘤細(xì)胞的增殖、黏附和遷移[19]。SOX2 可驅(qū)動(dòng)腫瘤干細(xì)胞的特性，促進(jìn)腫瘤發(fā)生和侵襲，Jiang 等[20]的研究發(fā)現(xiàn)miR-30-5p 過表達(dá)可顯著降低HEK293 和Caco2 細(xì)胞的CD133 和SOX2 表達(dá)，并可降低CRC 干細(xì)胞中Wnt/β-Catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)靶基因（Axin2 和Myc）的表達(dá)水平。本研究也發(fā)現(xiàn)CDK5RAP1 高表達(dá)可使SW480 細(xì)胞的成球率及β-Catenin、c-Myc、CD133、CD44、SOX2的蛋白表達(dá)水平升高，并可使Axin1 的蛋白表達(dá)水平降低，而敲低CDK5RAP1 表達(dá)則可使HCT-116細(xì)胞的成球率及β-Catenin、c-Myc、CD133、CD44、SOX2 的蛋白表達(dá)水平降低，并可使Axin1 的蛋白表達(dá)水平升高，該結(jié)果表明CDK5RAP1 可調(diào)節(jié)細(xì)胞的干性，并提示CDK5RAP1 可通過調(diào)控Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路參與CRC 的發(fā)生。本研究還發(fā)現(xiàn)加入Wnt 激活劑HLY78 后，HLY78 可進(jìn)一步促進(jìn)CDK5RAP1 高表達(dá)的SW80 細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及干性，也可逆轉(zhuǎn)CDK5RAP1 低表達(dá)對(duì)HCT-116 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和干性的抑制，進(jìn)一步驗(yàn)證了CDK5RAP1 可靶向Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路參與CRC 的發(fā)生和進(jìn)展。

綜上所述，CDK5RAP1 在CRC 中呈高表達(dá)，可促進(jìn)CRC 細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和干性，而敲低CDK5RAP1 表達(dá)可通過Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路抑制CRC 細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和干性。目前CDK5RAP1 靶向Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路的直接作用靶點(diǎn)尚未明確，今后的研究將對(duì)此進(jìn)行深入探索，為CDK5RAP1 在CRC 的臨床靶向治療提供理論依據(jù)。