lncRNA RPPH1 通過調(diào)控miR-326/TCF4 信號(hào)通路影響胃癌細(xì)胞增殖和遷移的機(jī)制研究

符 亮 鐘 靜 鄧小康 雷明華

胃癌是一種起源于胃黏膜上皮細(xì)胞的消化道惡性腫瘤。胃癌的發(fā)病率和病死率目前均處于較高水平，其發(fā)生和進(jìn)展受多種因素的影響，包括飲食習(xí)慣、細(xì)菌感染和遺傳等[1-2]。目前胃癌的治療方式包括手術(shù)治療、化學(xué)治療和靶向治療等。近年來，研究者在腫瘤治療領(lǐng)域已經(jīng)取得了重大突破，但是腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移依然是胃癌治療中的棘手問題[3]，因此需要對(duì)胃癌的發(fā)生和進(jìn)展機(jī)制進(jìn)一步探究，尋找更有效的治療方法。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類保守性較差、組織特異性較強(qiáng)、長度超過200 個(gè)核苷酸的非編碼RNA。研究表明，lncRNA 具有調(diào)控腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、耐藥、免疫逃逸等功能[4-5]。例如，lncRNA MEG3 可調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖和遷移，lncRNA EIF3J-DT 可通過調(diào)控自噬而影響胃癌化學(xué)治療的療效[6-7]。此外，亦有研究發(fā)現(xiàn)lncRNA RPPH1（下文簡(jiǎn)稱RPPH1）可調(diào)控多種腫瘤的病理過程，如其可促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移及M2 型巨噬細(xì)胞極化，還可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展等[8-9]。目前關(guān)于RPPH1 對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和遷移的影響的報(bào)道較少，本文對(duì)此進(jìn)行探究，旨在為胃癌發(fā)生和進(jìn)展的作用機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2019 年6 月至2021 年8 月在三亞市人民醫(yī)院接受胃癌根治術(shù)的30 例胃癌患者的腫瘤組織和癌旁正常組織（距腫瘤組織邊緣＞5 cm）標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)組織病理學(xué)分析確診為胃癌；（2）為原發(fā)性胃癌，符合胃癌根治術(shù)指征并接受胃癌根治術(shù)治療；（3）術(shù)前未行放射、化學(xué)治療，且無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；（4）均對(duì)本研究知情同意。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)20190508003）。

人胃癌細(xì)胞BGC-823、MGC-803、AGS、SGC-7901、MKN-45，以及人正常胃上皮細(xì)胞 GES-1 均購自國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)；腎上皮細(xì)胞293T購自中科院上海細(xì)胞庫；LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒、TRIzol 試劑盒均購自賽默飛世爾科技有限公司；5× All-In-One RT MasterMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒、BlasTaqTM2× qPCR MasterMix 試劑盒均購自愛必夢(mèng)生物科技有限公司；CCK-8 試劑盒、RIPA 蛋白提取試劑盒均購自沈陽萬類生物科技有限公司；Transwell 小室購自康寧生物科技有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)試劑盒購自漢恒生物科技（上海）有限公司；兔抗人TCF4 抗體、兔抗人GAPDH抗體、山羊抗人免疫球蛋白G（IgG）抗體均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

BGC-823、MGC-803、AGS、SGC-7901、MKN-45 和GES-1 細(xì)胞均培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，293T 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中。所有細(xì)胞均置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至融合度達(dá)80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組

將MGC-803 細(xì)胞分為Control 組（轉(zhuǎn)染RPPH1 siRNA 陰性對(duì)照、miR-326 inhibitor 陰性對(duì)照和TCF4 siRNA 陰性對(duì)照）、si-RPPH1 組（轉(zhuǎn)染RPPH1 siRNA、miR-326 inhibitor 陰性對(duì)照和TCF4 siRNA陰性對(duì)照）、si-RPPH1+miR-326 inhibitor 組（轉(zhuǎn)染RPPH1 siRNA、miR-326 inhibitor 和TCF4 siRNA 陰性對(duì)照） 及si-RPPH1+miR-326 inhibitor+siTCF4組（轉(zhuǎn)染RPPH1 siRNA、miR-326 inhibitor 和TCF4 siRNA）。使用LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按照試劑盒說明書操作，轉(zhuǎn)染24 h 后取各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

1.4 RPPH1 和miR-326 的表達(dá)水平檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測(cè)RPPH1 和miR-326 的表達(dá)水平。使用TRIzol 試劑盒提取胃癌組織、癌旁正常組織，以及BGC-823、MGC-803、AGS、SGC-7901、MKN-45 和GES-1 細(xì)胞的總RNA，使用核酸定量?jī)x進(jìn)行總RNA 定量，取500 ng RNA，使用5× All-In-One RT MasterMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，60 ℃ 10 min，95 ℃ 3 min。 所 得cDNA 按 照BlasTaqTM2× qPCR MasterMix 試劑盒說明書進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系：BlasTaqTM2× qPCR MM 10 μL，正向引物 0.5 μL，反向引物 0.5 μL，DNA 模板2 μL，Nuclease-free H2O 7 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)處理3 min；之后95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃1 min，共40 個(gè)循環(huán)。分別以GAPDH 和U6 作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算RPPH1 和miR-326 的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 細(xì)胞增殖能力檢測(cè)

使用CCK-8 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。將轉(zhuǎn)染后的各組MGC-803 細(xì)胞稀釋至1×105個(gè)/mL，接種于96 孔板（每孔100 μL），并設(shè)置0 h、24 h、48 h和72 h對(duì)應(yīng)的孔板，每組3個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。在0 h、24 h、48 h 和72 h 取出對(duì)應(yīng)的孔板，每孔加入10 μL CCK-8 試劑，混勻后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處各孔的光密度 （OD）值。

1.6 細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測(cè)

采用Transwell 小室法檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。將轉(zhuǎn)染后的各組MGC-803 細(xì)胞用不含血清的DMEM 培養(yǎng)基稀釋至5×105個(gè)/mL，取200 μL接種于 Transwell 小室中，用于檢測(cè)細(xì)胞遷移能力；另取200 μL 接種于鋪有Matrigel 膠的Transwell 小室中，用于檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力。Transwell 小室置于含600 μL 10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基的24孔板中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，取出小室，小室底部用無水甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色3 min，清洗3 次后在顯微鏡下觀察并拍照，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞的遷移數(shù)目和侵襲數(shù)目。

1.7 RPPH1、miR-326 和TCF4 的靶向關(guān)系檢測(cè)

采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)RPPH1與miR-326、miR-326 與TCF4 的靶向關(guān)系。根據(jù)starBase 數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)RPPH1 與miR-326 的結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù)TargetScan 數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miR-326 與TCF4 的結(jié)合位點(diǎn)。使用LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒將RPPH1 質(zhì)粒（RPPH1 WT）、RPPH1 突變質(zhì)粒（RPPH1 MUT）、TCF4 質(zhì)粒 （TCF4 WT）、TCF4 突變質(zhì)粒（TCF4 MUT）轉(zhuǎn)染至293T 細(xì)胞，然后將miR-326 mimic 和miR-326 mimic 陰性對(duì)照（miR-NC）分別轉(zhuǎn)染至上述細(xì)胞，最后使用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

1.8 TCF4 的表達(dá)水平檢測(cè)

采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)組織和細(xì)胞中TCF4的表達(dá)水平。按照RIPA 蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白，經(jīng)蛋白定量后，每組取10 μg 蛋白，在80 V 條件下進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白120 min，轉(zhuǎn)膜90 min，PVDF 膜封閉1.5 h，加入以1 ∶1 000 比例稀釋的抗TCF4 抗體、抗GAPDH抗體，4 ℃孵育過夜；TBST 清洗3 次后，加入以1 ∶2 000 比例稀釋的山羊抗人IgG 抗體，室溫孵育1 h，洗膜，用ECL 試劑盒顯影，拍照，并進(jìn)行定量分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），2組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RPPH1 在胃癌組織和胃癌細(xì)胞中的表達(dá)水平

qRT-PCR 法檢測(cè)結(jié)果顯示，與癌旁正常組織比較，胃癌組織中RPPH1 的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），見圖1A；與人正常胃上皮細(xì)胞GES-1比較， 人胃癌細(xì)胞BGC-823、MGC-803、AGS、SGC-7901、MKN-45 中RPPH1 的表達(dá)水平均顯著升高（P均＜0.001），且其在MGC-803 細(xì)胞中的表達(dá)水平最高，見圖1B。

圖1 不同組織及細(xì)胞中RPPH1 的表達(dá)水平比較 A 胃癌組織與癌旁正常組織比較 B 人胃癌細(xì)胞與人正常胃上皮細(xì)胞比較

2.2 RPPH1、miR-326 和TCF4 的靶向關(guān)系

RPPH1 與miR-326 的結(jié)合位點(diǎn)，以及miR-326與TCF4 的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖2A、圖2B 所示。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染RPPH1 WT 的293T 細(xì)胞在轉(zhuǎn)染miR-326 mimic后，其相對(duì)熒光強(qiáng)度顯著低于轉(zhuǎn)染miR-NC 的細(xì)胞（P＜0.001）；而轉(zhuǎn)染RPPH1 MUT 的293T 細(xì)胞在分別轉(zhuǎn)染miR-326 mimic 和miR-NC 后，兩者的相對(duì)熒光強(qiáng)度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2C，這表明miR-326 是RPPH1 的靶基因。此外，轉(zhuǎn)染TCF4 WT 的293T 細(xì)胞在轉(zhuǎn)染miR-326 mimic后，其相對(duì)熒光強(qiáng)度顯著低于轉(zhuǎn)染miR-NC 的細(xì)胞（P＜0.001）；而轉(zhuǎn)染TCF4 MUT 的293T 細(xì)胞在分別轉(zhuǎn)染miR-326 mimic 和miR-NC 后，兩者的相對(duì)熒光強(qiáng)度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2D，這表明TCF4 是miR-326 的靶基因。qRT-PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control 組比較，si-RPPH1 組中miR-326 的表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見圖2E。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control 組比較，si-RPPH1 組中TCF4 的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.001）；與si-RPPH1 組比較，si-RPPH1+miR-326 inhibitor 組中TCF4 的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.001），見圖2F、圖2G。

圖2 RPPH1 對(duì)miR-326/TCF4 信號(hào)通路的影響 A RPPH1 與miR-326 的結(jié)合位點(diǎn) B TCF4 與miR-326 的結(jié)合位點(diǎn) C RPPH1 與miR-326 的靶向關(guān)系 D TCF4 與miR-326 的靶向關(guān)系 E Control 組和si-RPPH1 組中miR-326 的表達(dá)水平比較 F Control 組、si-RPPH1 組和si-RPPH1+miR-326 inhibitor 組中TCF4 的蛋白電泳圖 G 各組中TCF4 的表達(dá)水平比較

2.3 胃癌組織中RPPH1、miR-326 和TCF4 表達(dá)水平的相關(guān)性分析

根據(jù)qRT-PCR 法和蛋白質(zhì)印跡法的檢測(cè)結(jié)果，應(yīng)用GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行分析，結(jié)果顯示胃癌組織中RPPH1 與miR-326 的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r＝-0.504，P＜0.001），RPPH1 與TCF4 的表達(dá)水平呈正相關(guān)（r＝0.672，P＜0.001），而miR-326 與TCF4的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r＝-0.499，P＜0.001）。見圖3。

2.4 RPPH1 對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力的影響

結(jié)果顯示，與Control 組比較，si-RPPH1 組細(xì)胞增殖能力顯著減弱（P＜0.01）；與si-RPPH1 組比較，si-RPPH1+miR-326 inhibitor 組細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)（P＜0.05）；與si-RPPH1+miR-326 inhibitor組比較，si-RPPH1+miR-326 inhibitor+siTCF4 組細(xì)胞增殖能力顯著減弱（P＜0.05）。見圖4。

2.5 RPPH1 對(duì)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

Transwell 小室法檢測(cè)結(jié)果顯示，si-RPPH1 組的細(xì)胞遷移數(shù)目和侵襲數(shù)目均顯著少于Control組（P均＜0.01），si-RPPH1+miR-326 inhibitor 組的細(xì)胞遷移數(shù)目和侵襲數(shù)目均顯著多于si-RPPH1組（P均＜0.05），而si-RPPH1+miR-326 inhibitor+siTCF4 組的細(xì)胞遷移數(shù)目和侵襲數(shù)目均顯著少于si-RPPH1+miR-326 inhibitor 組（P均＜0.05）。見圖5。

圖5 各組細(xì)胞的遷移和侵襲能力比較 A 各組細(xì)胞的Transwell 小室法檢測(cè)結(jié)果比較 結(jié)晶紫染色 ×400 B 各組細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目比較

3 討論

lncRNA 是一類對(duì)多種腫瘤具有調(diào)控作用的非編碼RNA，其調(diào)控機(jī)制涉及腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、化學(xué)治療耐藥、放射治療抗性及免疫逃逸等病理過程[10]，其可能成為腫瘤診斷和治療的靶點(diǎn)。研究表明，RPPH1 與食管癌的不良預(yù)后密切相關(guān)，并且可以調(diào)控腫瘤的放射治療敏感性[11]。有研究報(bào)道，RPPH1 與胃癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[12]，但關(guān)于RPPH1 對(duì)胃癌發(fā)生和進(jìn)展的影響及相關(guān)機(jī)制的研究尚不完善。本文探究了RPPH1 對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響及機(jī)制，旨在為胃癌的治療提供參考。

以往研究報(bào)道，多種lncRNA 在胃癌中差異表達(dá)，如lncRNA LINC00342 和lncRNA CRNDE 在胃癌患者的腫瘤組織中呈高表達(dá)[13-14]。本研究結(jié)果顯示，RPPH1 在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織，并且其在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)水平亦顯著高于人正常胃上皮細(xì)胞，這提示RPPH1 可能具有調(diào)控胃癌發(fā)生和進(jìn)展過程的作用。lncRNA的主要調(diào)控機(jī)制之一是作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性 RNA（ceRNA）發(fā)揮miRNA 的“分子海綿”作用，從而抑制 miRNA 表達(dá)[15]；而miRNA 發(fā)揮調(diào)控功能的機(jī)制為靶向結(jié)合信使RNA（mRNA）的3' UTR 區(qū)域，進(jìn)而抑制靶基因翻譯[16]。RPPH1 已被報(bào)道可在多種腫瘤中調(diào)控miRNA/mRNA 信號(hào)通路進(jìn)而影響腫瘤的病理過程，如Wu 等[9]的研究發(fā)現(xiàn)RPPH1可通過調(diào)控miR-326/WNT2B 信號(hào)通路影響非小細(xì)胞肺癌的病程，Zhang 等[17]的研究發(fā)現(xiàn)RPPH1 可通過下調(diào)乳腺癌組織中miR-122 的表達(dá)而抑制腫瘤進(jìn)展。本研究通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了miR-326 為RPPH1 的靶基因，而TCF4 為miR-326 的靶基因，并指出RPPH1 可通過調(diào)控miR-326表達(dá)而影響TCF4 的表達(dá)水平；此外，本研究還發(fā)現(xiàn)胃癌組織中RPPH1 與miR-326 的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，RPPH1 與TCF4 的表達(dá)水平呈正相關(guān)，而miR-326 與TCF4 的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，這進(jìn)一步提示RPPH1、miR-326 和TCF4 均與胃癌的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)。Jiang 等[18]的研究表明，lncRNA LINC01270 可調(diào)控胃癌組織中miR-326 的表達(dá)水平；亦有研究發(fā)現(xiàn)，miR-133a-5p 可通過下調(diào)TCF4 的表達(dá)而抑制胃癌進(jìn)展[19]；此外，有研究表明H19/miR-152-3p/TCF4 信號(hào)通路可通過調(diào)控胃癌細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化而影響化學(xué)治療藥物的耐藥性[20]。由此推測(cè)，RPPH1 可能通過調(diào)控miR-326/TCF4 信號(hào)通路而促進(jìn)胃癌的發(fā)生和進(jìn)展。本研究結(jié)果表明，抑制RPPH1 表達(dá)后胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均顯著減弱，而miR-326 的表達(dá)上調(diào)；如抑制RPPH1 表達(dá)的同時(shí)抑制miR-326 的表達(dá)，則胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng)，且TCF4 的表達(dá)上調(diào)；如抑制RPPH1 和miR-326 表達(dá)的同時(shí)抑制TCF4 表達(dá)，那么胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力又將顯著減弱，這提示RPPH1 可通過調(diào)控miR-326/TCF4 信號(hào)通路影響胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

綜上所述，RPPH1 在胃癌組織和胃癌細(xì)胞中均呈高表達(dá)，并可能通過調(diào)控miR-326/TCF4 信號(hào)通路影響胃癌細(xì)胞的增殖和遷移，但是RPPH1 是否能夠成為胃癌診斷和治療的新靶點(diǎn)還需今后進(jìn)一步探究。