lncRNA TMPO-AS1 在食管癌組織中的表達及臨床意義

王鵬飛 施磊健 崔寶生 周驍宇 張 潔

食管癌（EC）的發(fā)病率較高，目前臨床治療主要包括手術治療、放射治療和化學治療等，患者的預后較差[1-2]。EC 的發(fā)病與飲食習慣、家族遺傳史、抑癌基因失活及促癌基因激活等有關[3-4]，其發(fā)病機制尚未完全明確，探索EC 發(fā)病的分子機制，對早期診治EC 具有重要意義。研究表明長鏈非編碼RNA（lncRNA）和miRNA 均參與了EC 的發(fā)生和進展[5-6]。胸腺生成素反義RNA1（TMPO-AS1）是一種lncRNA，其在EC 組織中呈高表達，可促進EC 細胞增殖、侵襲，其可能是治療EC 的潛在靶標[7]。miR-498 在EC 組織中呈低表達，可通過影響細胞自噬發(fā)揮抑癌作用，其也可能是治療EC的潛在靶標[8]。Gao 等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，TMPO-AS1可通過靶向調(diào)節(jié)miR-498 表達水平，進而調(diào)節(jié)EC的進展。目前TMPO-AS1 在EC 組織中的表達情況，以及其與miR-498 表達及EC 患者預后的關系尚未明確，本研究對此進行了探索，以期為EC 患者的臨床診治及預后預測提供參考依據(jù)。

1 臨床資料與方法

1.1 臨床資料

選取2016 年8 月至2019 年8 月南通大學附屬啟東醫(yī)院收治的84 例EC 患者的EC 組織和癌旁組織（距EC 組織邊緣≥4 cm）。84 例患者中男性49 例，女性35 例；年齡44～73 歲，平均年齡為（59.62±9.41）歲，＜60 歲41 例，≥60 歲43例；酗酒51 例，不酗酒33 例；腫瘤中、高分化57 例，低分化27 例；鱗癌54 例，腺癌30 例；腫瘤直徑＜4 cm 44例，≥4 cm 40例；TNM分期Ⅲ期26例，Ⅰ～Ⅱ期58 例。

納入標準：（1）經(jīng)組織病理學檢查初次確診為EC；（2）入院前未接受靶向、免疫、放射及化學治療；（3）入院檢查資料及術后隨訪資料完善；（4）患者接受了EC 根治手術。排除標準：（1）既往有食管手術史；（2）合并嚴重心、肺、肝、腎功能障礙；（3）合并全身感染性疾病、血液及免疫系統(tǒng)疾?。唬?）合并反流性食管炎、胃潰瘍、Barrett 食管；（5）合并胃癌、胰腺癌或其他腫瘤。所有入選患者及家屬均簽署知情同意書，本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 標本收集 將手術切除的EC 組織和癌旁組織用0.9% Nacl 溶液清洗后立即置于液氮罐中，過夜后置于-80 ℃冰箱。

1.2.2 實時熒光定量PCR 法檢測組織中TMPOAS1、miR-498 表達水平 在冰上研碎EC 組織和癌旁組織，加入TRIzol 試劑 （購自美國Invitrogen 公司）提取總RNA，應用EpiNext Hi-Fi cDNA Synthesis Kit試劑盒（購自美國Epigentek 公司）將總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，應用Perfectstart SYBR Green qPCR master mix 試劑盒（購自北京索萊寶科技有限公司）、實時熒光定量PCR 儀（購自美國ABI 公司）擴增cDNA，獲取TMPO-AS1、miR-498 的循環(huán)閾值（Ct 值）。反應條件：98.5 ℃預變性8 min；之后96.5 ℃變性30 s，62.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共40 個循環(huán)。lncRNA TMPO-AS1、miR-498 分別以GAPDH、U6 為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算TMPOAS1、miR-498 相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 隨訪

對84 例EC 患者采用門診復查或電話詢問的方式定期隨訪36 個月，以EC 患者手術次日為隨訪起點，隨訪截至2022 年8 月30 日或以患者死亡為隨訪終點，記錄EC 患者的生存情況。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用配對樣本t檢驗；計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Pearson 相關性分析探討EC 組織中TMPO-AS1 與miR-498 的相關性。采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，以Log-Rank 檢驗分析EC 組織中TMPO-AS1、miR-498 表達水平與患者預后的關系。采用COX 回歸分析探討EC 患者預后的影響因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 EC 組織和癌旁組織中TMPO-AS1、miR-498表達水平比較

與癌旁組織相比，EC 組織中TMPO-AS1 表達水平顯著升高，miR-498 表達水平顯著降低（P均＜0.05）。見表2。

表2 EC 組織和癌旁組織中TMPO-AS1、miR-498 表達水平比較

2.2 EC 組織中TMPO-AS1、miR-498 表達水平與患者臨床病理特征的關系

因數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，故以EC 組織中TMPO-AS1、miR-498 表達水平的平均值（2.29、0.41）為最佳截斷值，將≤最佳截斷值的EC 患者設為TMPO-AS1 低表達組（41 例）、miR-498 低表達組（44 例），將＞最佳截斷值的EC 患者設為TMPOAS1 高表達組（43 例）、miR-498 高表達組（40 例）。χ2檢驗結(jié)果顯示，EC 組織中TMPO-AS1、miR-498 表達水平與腫瘤分化程度、TNM 分期均有相關性（P均＜0.05），而與性別、年齡、是否酗酒、病理類型及腫瘤直徑均無相關性（P均＞0.05）。見表3。

表3 EC 組織中TMPO-AS1、miR-498 表達水平與患者臨床病理特征的關系/例（%）

2.3 EC 組織中TMPO-AS1 與miR-498 表達水平的相關性分析

Pearson 相關性分析結(jié)果顯示，EC 組織中TMPO-AS1 與miR-498 表達水平呈負相關（r＝-0.567，P＝0.000）。見圖1。

圖1 EC 組織中TMPO-AS1 與miR-498 表達水平的相關性分析

2.4 EC 組織中TMPO-AS1、miR-498 表達水平與患者預后的關系

對84 例EC 患者隨訪36 個月，死亡34 例，總生存率為59.52%。Kaplan-Meier 生存曲線分析結(jié)果顯示，TMPO-AS1 高表達組EC 患者的平均生存時間（25.95 個月，95%CI：22.98～28.93）短于TMPO-AS1 低表達組（33.39 個月，95%CI：31.55～35.23），Log-Rank 檢驗結(jié)果顯示，TMPO-AS1 高、低表達組的累積生存率差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝15.516，P＜0.001）；miR-498 低表達組EC 患者的平均生存時間（25.82 個月，95%CI：22.94～28.70）短于miR-498 高表達組（33.73 個月，95%CI：31.88～35.57），Log-Rank 檢驗結(jié)果顯示，miR-498高、低表達組的累積生存率差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝20.458，P＜0.001）。見圖2。

圖2 EC 組織中TMPO-AS1、miR-498 表達水平與患者預后的關系 A TMPO-AS1 表達水平與患者預后的關系 B miR-498 表達水平與患者預后的關系

2.5 EC 患者預后的影響因素分析

以分化程度（低分化＝0，中、高分化＝1）、TNM 分期（Ⅰ～Ⅱ期＝0，Ⅲ期＝1）、TMPO-AS1（低表達＝0，高表達＝1）、miR-498（高表達＝0，低表達＝1）為自變量，以EC 患者預后（預后良好＝0，預后不良＝1）為因變量進行分析。單因素COX 回歸分析結(jié)果顯示，分化程度、TNM 分期、TMPOAS1和miR-498均是影響EC患者預后的重要因素（P均＜0.05）。多因素COX 回歸分析結(jié)果顯示，TNM分期Ⅲ期、TMPO-AS1 高表達和miR-498 低表達均是影響EC 患者預后的獨立危險因素（P均＜0.05）。見表4。

3 討論

EC 患者的早期癥狀不明顯，出現(xiàn)吞咽困難癥狀時患者多數(shù)已進展至晚期，預后較差[10-11]。因此，探索EC 發(fā)病的分子機制，尋找可以早期診斷EC及預測患者預后的生物標志物具有重要意義[12]。

lncRNA 是一類長度超過200 個核苷酸的RNA分子，不具備編碼蛋白質(zhì)功能，其可調(diào)控miRNA降解、染色質(zhì)重構，參與EC 等多種腫瘤細胞的增殖、凋亡等生物學過程，與胃癌、結(jié)腸癌、EC 等腫瘤的病理變化相關[13-14]。有研究顯示，TMPOAS1 在胃癌組織中表達上調(diào)，其可促進胃癌細胞增殖、遷移及血管新生，與患者的預后密切相關[15]。Luo 等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，TMPO-AS1 在食管鱗狀細胞癌組織中呈過表達，其可通過促進腫瘤細胞增殖、遷移進而促進食管鱗狀細胞癌進展，提示TMPOAS1 可能是治療食管鱗狀細胞癌的分子靶標。本研究結(jié)果顯示，EC 組織中TMPO-AS1 表達水平較癌旁組織顯著升高，與吳愷等[7]的研究結(jié)果一致，提示TMPO-AS1 可能與EC 的病理變化有關，推測高表達的TMPO-AS1 可能通過靶向調(diào)節(jié)miRNA等相關基因的表達，促進EC 細胞侵襲、遷移、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），并促進血管新生[7,16]，表明TMPO-AS1 在EC 中起著促癌作用，其具體機制有待深入研究。此外，本研究結(jié)果還顯示，EC 組織中TMPO-AS1 表達水平與腫瘤分化程度、TNM 分期相關，提示TMPO-AS1 可能與EC 進展有關，檢測EC 組織中TMPO-AS1 表達水平有助于評估EC患者的病情及指導治療方案的制定。本研究進一步發(fā)現(xiàn)，TMPO-AS1 高表達與EC 患者累積生存率較低有相關性，表明TMPO-AS1 有潛力成為預測EC 患者預后的標志物。

miRNA 是一類長度為21～23 個核苷酸的內(nèi)源性RNA 分子，其也不能編碼蛋白質(zhì)，可與信使RNA（mRNA）結(jié)合影響mRNA 的翻譯和降解，進而調(diào)節(jié)靶基因的表達，參與EC 等腫瘤細胞的增殖、凋亡，影響血管新生，與肝細胞癌、EC 等腫瘤的發(fā)病密切相關[17-18]。有研究發(fā)現(xiàn)miR-498 在EC 組織中表達下調(diào)，其可抑制EC 細胞的侵襲、遷移和EMT，提示其參與了EC 的進展，可能是診治EC的分子靶標[19]。此外，Jin 等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-498 在食管鱗狀細胞癌組織中表達下調(diào)，其可與靶基因結(jié)合影響食管鱗狀細胞癌的生長、轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示EC 組織中miR-498 表達水平較癌旁組織顯著降低，這與Li 等[8]和Wang 等[19]的研究結(jié)果一致，提示miR-498可能與EC發(fā)生和進展相關，推測miR-498 可能通過與靶基因結(jié)合影響EC 細胞的增殖、侵襲和EMT 等過程，從而影響EC 的病理改變。本研究還發(fā)現(xiàn)在低分化、TNM 分期Ⅲ期患者中，EC 組織中miR-498 呈低表達的患者占比較高，提示miR-498 可能與EC 進展相關，檢測EC組織中miR-498 表達水平有助于評估EC 患者的病情及指導個體化治療方案的制定，并提示miR-498可能是評估EC 疾病嚴重程度的生物標志物。此外，本研究結(jié)果顯示，miR-498 低表達與EC 患者累積生存率較低有相關性，表明miR-498 有潛力成為預測EC 患者預后的生物標志物。

Gao 等[9]的研究發(fā)現(xiàn)TMPO-AS1 與miR-498的表達水平相關，因此本研究探討了EC 組織中TMPO-AS1 與miR-498 表達水平的關系，結(jié)果顯示兩者呈負相關，提示TMPO-AS1 可能與miR-498 共同調(diào)控EC 的發(fā)生和進展，推測TMPO-AS1 通過與miR-498 靶向結(jié)合以協(xié)同影響EC 細胞的增殖、遷移和EMT，從而影響EC 的進展，但其具體機制仍有待深入探討。本研究還發(fā)現(xiàn)，TNM 分期Ⅲ期、TMPO-AS1 高表達和miR-498 低表達均是影響EC患者預后的獨立危險因素，提示檢測EC 組織中TMPO-AS1、miR-498 表達水平有助于早期診治EC及預測預后。

綜上所述，EC 組織中TMPO-AS1 表達上調(diào)，miR-498 表達下調(diào)，兩者呈負相關。TMPO-AS1 和miR-498 與腫瘤分化程度、TNM 分期及患者預后等均顯著相關，有助于評估EC 患者的病情及預后預測。由于本研究的樣本量較小，對患者的隨訪時間較短，可能使結(jié)果產(chǎn)生偏倚。今后將增大樣本量，延長隨訪時間，并進行多中心研究，以進一步驗證本研究結(jié)論。