中藥重樓活性成分與藥理作用機(jī)制研究※

●張明洋 劉 芳 陳 川 余 桉 張蓬陽 劉忠濤 劉 瑩

（長(zhǎng)春科技學(xué)院 吉林 長(zhǎng)春 130600）

重樓又名草河車、枝花頭等，臨床常用主要來源于重樓屬植物七葉一枝花和云南重樓的根莖中，在我國(guó)云南、貴州等地分布較多，是中藥組方清熱解毒通淋湯的重要成分[1]。具有清熱解毒、抗腫瘤、消炎鎮(zhèn)靜、止血化淤的功效，現(xiàn)已從本屬植物中分離鑒定出甾體皂苷、黃酮類化合物、脂肪酸酯類化合物等50余種，其中甾體皂苷、黃酮類化合物占總化合物的80%[2-3]近年來重樓藥用價(jià)值逐漸受到臨床重視，為更好開發(fā)利用重樓屬植物資源，本文對(duì)其化學(xué)成分及其活性作用進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

重樓中藥材（干貨，購于淘治大藥房 ）；來自（長(zhǎng)春科技學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室）的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌；無水乙醇；大孔樹脂（HPD-100）；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品；DPPH；FeSO4；H2O2；水楊酸；鄰苯三酚；Tris。

1.2 設(shè)備

中藥粉碎機(jī)、微波爐、HL-2型恒流泵；自動(dòng)部分收集器；搖床。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 重樓粗提物制備 重樓粉碎，過篩（20目），密封儲(chǔ)存。取重樓粉20 g，用0·2 L 70%乙醇浸泡4 h后，200 W微波下提取230 s，將提取液過濾，蒸發(fā)得到重樓粗提物浸膏。

1.3.2 重樓黃酮的純化 將購買的HPD-100大孔樹脂裝柱，裝柱前先在乙醇溶液中浸泡12 h，使HPD-100溶脹，次日裝柱，乙醇沖至流出液無混濁產(chǎn)生，用H2O沖至沒有乙醇味即可。在色譜柱上端加入粗提液。靜態(tài)，吸附4 h，然后用30%乙醇（3BV）進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，濃縮，干燥得皂苷精提物，記為HPD-a。接著用40%乙醇（3BV）進(jìn)行洗脫，得到的提取物記為HPD-b。最后用50%乙醇（3BV）洗脫，得到的提取物記為HPD-c，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品依次測(cè)得其含量。

1.3.3 重樓抑菌能力的驗(yàn)證

1.3.3.1 抑菌圈試驗(yàn) 取重樓粗提物10 mg，加蒸餾水10 mL溶解，配以10 mg/mL的重樓粗提液，經(jīng)微孔濾膜（0·45 μm）過濾、去渣，制成抗菌實(shí)驗(yàn)用待測(cè)液。將培養(yǎng)基倒入平板。靜等20 min，無菌條件下取每種細(xì)菌懸浮液100 μL，緩慢加入平板。菌液注入后將其涂勻。此時(shí)平板內(nèi)鋪滿對(duì)應(yīng)的菌液。將濾紙浸泡在抗菌實(shí)驗(yàn)待測(cè)液中，用鑷子夾住濾紙，并將其放在含細(xì)菌的平板上。每組平行測(cè)試2次，培養(yǎng)溫度為37℃。24 h后，比較抑菌圈大小。

1.3.3.2 最小抑菌濃度（MIC）的確定 取重樓粗提物0·1 g溶于10 mL蒸餾水，得重樓粗提取液待用。按比例進(jìn)行稀釋，然后對(duì)重樓粗提物進(jìn)行MIC的測(cè)定，其中，空白對(duì)照組選擇蒸餾水，陽性對(duì)照選擇0·1 mg/mL青霉素溶液。判定標(biāo)準(zhǔn)：觀察待測(cè)組試管的渾濁度，前提是空白對(duì)照試管出現(xiàn)渾濁，陽性管呈透明狀態(tài)的。

1.3.4 重樓抗氧化能力的驗(yàn)證

1.3.4.1 清除羥自由基（·OH）的活性研究 參考張正旭等[4]的方法，先配制6 mmol/L硫酸亞鐵溶液，再將30% H2O2配制成8·8 mmol/L溶液，以上均為現(xiàn)配。將無水乙醇作為溶劑配制成6 mmol/L水楊酸乙醇溶液。表1的內(nèi)容進(jìn)行具體試驗(yàn)。得到的吸光值代入公式，即可得到清除率。選取Vc作為陽性對(duì)照，對(duì)照品和每個(gè)樣品配制5個(gè)不同的濃度，每個(gè)濃度做3次平行實(shí)驗(yàn)。

表1 OH自由基清除能力反應(yīng)系統(tǒng)

清除率=[（A-C）-（B-D）]/（A-C）×100%

1.3.4.2 清除超氧陰離子的活性研究 參考馮嬌等[5]的方法并加以改進(jìn)，配制好0·05 mol/L，pH8·2，Tris-HCl緩沖液，配制2·5 mmol/L鄰苯三酚，10 mol/L的濃鹽酸及不同濃度的待測(cè)樣品。根據(jù)表2的內(nèi)容進(jìn)行試驗(yàn)。得到的吸光值代入公式，即可得到清除率。選取Vc作為陽性對(duì)照，對(duì)照品和每個(gè)樣品設(shè)置5個(gè)不同的濃度，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。超氧陰離子清除率=（A0-A1）/A0× 100%式中，A1 為加入樣品的反應(yīng)液吸光值，A0 為用Tris-HCl 緩沖液代替樣品的反應(yīng)液吸光值。

表2 超氧陰離子清除能力反應(yīng)系統(tǒng)

1.4.4.3 DPPH自由基的清除力測(cè)定 參考馬澤剛等[6]的方法并加以改進(jìn)，以95%乙醇溶解DPPH粉末，配制得到0·002% DPPH溶液，避光保存。將樣品依次稀釋成不同的濃度梯度。根據(jù)表3的內(nèi)容進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。得到的吸光值代入公式，即可得到清除率。選取Vc作為陽性對(duì)照，對(duì)照品和每個(gè)樣品設(shè)置5個(gè)不同的濃度，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。清除率=［A空-（A樣-A對(duì)）］/A空×100%

表3 DPPH清除能力反應(yīng)體系

2 結(jié)果與分析

2.1 重樓黃酮的純化

采用不同濃度乙醇試劑對(duì)重樓粗提液進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液合并濃縮，烘干備用，標(biāo)注為HPD-a、HPD-b、HPD-c。其提取率分別為0·98%、2·13%、1·74%。

2.2 重樓抑菌效果分析

2.2.1 抑菌圈試驗(yàn) 如表4所示，重樓粗提液對(duì)金黃色葡萄球菌有良好的抑菌效果，對(duì)表皮葡萄球菌，大腸桿菌有一定的抑菌作用，但效果不明顯。

表4 抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 最低抑菌濃度的測(cè)定

由表5可知，重樓粗提液對(duì)大腸桿菌的抑菌作用在三種常見細(xì)菌中表現(xiàn)一般，在濃度為5 mg/mL時(shí)，表現(xiàn)為抑菌作用；如要對(duì)表皮葡萄球菌有抑制作用，則濃度需達(dá)到為1·25 mg/mL。當(dāng)粗提液濃度為0·625 mg/mL時(shí)，就可以對(duì)金黃色葡萄球菌產(chǎn)生抑制作用。

表5 最低抑菌濃度測(cè)定

2.3 重樓黃酮的抗氧化結(jié)果分析

2.3.1 羥自由基（·OH）清除能力比較 重樓粗提物、純化后的重樓黃酮組分都具有一定的羥自由基（·OH）清除作用；在濃度為8 mg/mL時(shí)重樓粗提物的清除效果和重樓黃酮組分HPD-b相當(dāng)。重樓黃酮組分HPD-b清除率可達(dá)68·5%。

圖1 羥自由基（·OH）清除能力比較

2.3.2 超氧陰離子清除能力比較 重樓粗提物、黃酮組分HPD-b均對(duì)超氧陰離子有較好的清除能力，而重樓黃酮組分HPD-c、HPD-a雖然效果沒有上述兩個(gè)組分好，但當(dāng)濃度達(dá)到3 mg/mL時(shí)，也有超過50%的清除率。

圖2 超氧陰離子清除能力比較

2.3.3 DPPH自由基清除能力比較 重樓粗提物、純化后的重樓黃酮組分都具有一定的DPPH自由基清除能力，在濃度為4 mg/mL時(shí)，黃酮組分HPD-b對(duì)DPPH自由基的清除率可達(dá)65·78%，在此濃度下，清除率大小為Vc＞HPD-b＞粗提物＞HPD-c＞HPD-a。

圖3 DPPH自由基清除能力比較

3 結(jié)論

通過初探重樓粗提物抑菌情況，結(jié)果表明，重樓粗提物對(duì)金黃色葡萄球菌有良好的抑菌效果，這為重樓在抑菌方面的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。通過對(duì)重樓粗提物進(jìn)行進(jìn)一步純化，得到三組黃酮組分HPD-a、HPD-b、HPD-c，其中組分HPD-b提取率可達(dá)到2·13%。通過三種體外抗氧化實(shí)驗(yàn)比較粗提物和三種組分的抗氧化能力，結(jié)果表明重樓粗提物和重樓黃酮都具有良好的體外抗氧化能力。其中黃酮組分HPD-b比重樓粗提物的抗氧化能力更好，但均弱于Vc。