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    氣相色譜法測定交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的修飾度

    2023-10-25 05:12:10王寶群甄政安林莎莎陳醒鄒圣燦李亞利
    化學(xué)分析計量 2023年9期
    關(guān)鍵詞:丙三醇載氣透明質(zhì)

    王寶群,甄政安,林莎莎,陳醒,鄒圣燦,李亞利

    (青島琛藍海洋生物工程有限公司,山東青島 266100)

    透明質(zhì)酸(HA)是由D-葡糖醛酸和N-乙醛基-D-氨基葡糖雙糖單位重復(fù)連接組成的一種鏈性聚陰離子黏多糖[1-3],是構(gòu)成皮膚、玻璃體、關(guān)節(jié)滑液和軟組織的成分,具有獨特的理化性質(zhì)和生物學(xué)功能[4]。天然的透明質(zhì)酸易被體內(nèi)的透明質(zhì)酸酶迅速降解,在體內(nèi)保持時間短,限制了其在臨床上的應(yīng)用[5-8]。為了解決這個問題,通常使用交聯(lián)劑對其進行化學(xué)修飾,穩(wěn)固透明質(zhì)酸在體內(nèi)的維持時間[9-13]。目前常使用的交聯(lián)劑有二乙烯基砜(DVS)[14]和1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)[15]。

    修飾度是指交聯(lián)劑修飾透明質(zhì)酸凝膠的程度,是凝膠的重要性能指標(biāo)之一。修飾度又分為懸掛修飾度和交聯(lián)修飾度(懸掛修飾指BDDE 分子只有一端與HA 分子連接,另一端游離;交聯(lián)修飾指BDDE分子兩端同時與HA 分子連接,也叫有效交聯(lián))[16]。修飾度與凝膠的降解能力、吸漲程度緊密相關(guān)[17-19]。利用測量修飾度可以反應(yīng)凝膠的物理化學(xué)性能,并直接影響凝膠體內(nèi)降解性能,從而影響產(chǎn)品的生物安全性;當(dāng)交聯(lián)度偏小時,會影響凝膠的穩(wěn)定性和抗降解性;當(dāng)交聯(lián)度偏大時,會引起人體的排斥反應(yīng),從而增加凝膠植入的風(fēng)險[14]。楊彪[20]等使用酶解法將凝膠降解為雙糖,采用分子排阻色譜法對產(chǎn)物分離,然后使用H-NMR和質(zhì)譜儀分析,利用面積歸一法計算凝膠的修飾度,但該方法操作繁瑣,檢測周期長。

    筆者以丙三醇為外標(biāo),利用氣相色譜法檢測交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠經(jīng)酸解后得到的樣品中丙三醇濃度,再計算出凝膠的修飾度,該方法不僅簡便、快速,而且具有較高的精密度和準(zhǔn)確性。

    1 實驗部分

    1.1 主要儀器與試劑

    精密電子天平:PX224ZH/E 型,感量為0.1 mg,奧豪斯儀器(常州)有限公司。

    氣相色譜儀:島津-GC2014C型,配有氫火焰離子化(FID)檢測器,日本島津公司。

    恒溫攪拌器:HJ-6B 型,金壇市城東新瑞儀器廠。

    超聲波清洗器:KQ-600DE型,昆山市超聲儀器有限公司。

    pH計:PHS-3E型,上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

    離心機:GL-20G-II型,上海安亭科學(xué)儀器廠。

    丙三醇標(biāo)準(zhǔn)品:質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于99.7%,上海麥克林試劑有限公司。

    無水乙醇:高效液相色譜級,天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

    氫氧化鈉:分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

    氫溴酸:分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

    高純氮氣:質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.999%。

    交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠樣品:20220606 批,自制樣品。

    實驗用水為超純水。

    1.2 色譜條件

    色譜柱:PEG-20M毛細管柱(30.0 m×0.32 mm,0.50 μm);檢測器溫度:290 ℃;載氣:高純氮氣,流量為30 mL/min;進樣口溫度:270 ℃;進樣方式:分流進樣,分流比為20∶1;色譜柱流量:2.00 mL/min,吹掃氣:高純氮氣,流量為3.0 mL/min;柱溫:程序升溫,初始溫度為60 ℃,再以5 ℃/min 速率升溫至230 ℃,保持10 min。

    1.3 溶液配制

    丙三醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液:1 mg/mL,精確稱取10 mg丙三醇標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL 容量瓶中,加入無水乙醇定容。

    丙三醇系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:分別取丙三醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.25、0.50、0.75、1.25、2.50 mL,各加入到1只25 mL容量瓶中,用無水乙醇定容,混勻,過0.22 μm濾膜。所得系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度分別為10、20、30、40、50 μg/mL。

    樣品溶液:精確稱取1 g 透明質(zhì)酸凝膠樣品于10 mL具塞玻璃管中,加入氫溴酸5 mL,混合均勻,于沸水中煮50 min,將溶液轉(zhuǎn)移至燒杯中,用6 mol氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液至中性(pH 7.0~7.2)。將燒杯置于數(shù)顯多頭磁力恒溫攪拌器上,于65 ℃以轉(zhuǎn)速400~500 r/min 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),至燒杯中無液體,靜置放涼;加入5 mL 無水乙醇,于超聲器中超聲30 min 后轉(zhuǎn)移至離心管中離心20 min,用注射器吸取上清液,過0.22 μm濾膜。

    1.4 實驗步驟

    使用氣相色譜儀按照1.2 色譜條件檢測丙三醇系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、色譜峰面積為縱坐標(biāo)進行線性回歸,建立丙三醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線;同法檢測樣品溶液,利用色譜峰面積外標(biāo)法計算出樣品中丙三醇的質(zhì)量濃度,將所得丙三醇濃度帶入式(1)計算凝膠樣品的修飾度Dm:

    式中:V——無水乙醇總體積,mL;

    ρ——樣品溶液中丙三醇的質(zhì)量濃度,mg/L;

    ρHA——樣品溶液中透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量濃度,mg/mL;

    mHA——樣品溶液中透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量,g。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 實驗條件優(yōu)化

    2.1.1 酸解溫度和酸解時間的選擇

    制備樣品時,需通過酸解透明質(zhì)酸凝膠樣品得到丙三醇,而不同酸解溫度會影響樣品的酸解程度和速度,最終影響丙三醇的含量測定結(jié)果。分別采用常溫酸解和沸水酸解兩種方式處理樣品,對比丙三醇色譜峰面積測定值,并確定最終酸解條件。經(jīng)試驗比較,稱取同一批次且質(zhì)量相同的凝膠樣品進行酸解,分別在沸水酸解、常溫消解條件下,酸解40、50、60 min,經(jīng)測試后對比丙三醇色譜峰面積,結(jié)果見圖1。由圖1可知,沸水酸解樣品丙三醇色譜峰面積遠大于常溫酸解丙三醇色譜峰面積,且沸水酸解時間到達50 min后,丙三醇色譜峰面積再無明顯增加,說明沸水酸解條件下,凝膠能更快降解。綜合考慮,最終選擇沸水酸解,酸解時間為50 min。酸解方式的確定使得樣品降解的更徹底,且大幅縮短制樣的周期。

    圖1 不同酸解溫度和酸解時間的丙三醇色譜峰面積

    2.1.2 載氣流量的選擇

    載氣流量是氣相檢測中的重要參數(shù),直接影響氣相色譜峰的分離度、色譜柱理論塔板高度、柱效等指標(biāo)。一般情況下,選擇的載氣流量范圍在10~100 mL/min。當(dāng)載氣流量設(shè)置過低時,樣品的擴散能力減弱,增加色譜柱的使用,從而影響色譜柱的柱效;當(dāng)載氣流量設(shè)置過高時,會影響樣品在色譜柱內(nèi)的保留,并且會影響色譜柱的柱效,間接影響檢測結(jié)果。根據(jù)多次實驗結(jié)果和實際色譜柱柱效表明,選擇30 mL/min的載氣流量為最適流量。

    2.1.3 色譜柱升溫速率的選擇

    采用程序升溫方法進行丙三醇含量的測定,其中升溫速率的快慢會對色譜峰有明顯的影響。升溫速率高會降低色譜峰的分離度,升溫速率低又會增加檢測時間,因此需要確定最佳升溫速率。分別設(shè)置升溫速率為5、25 ℃/min進行試驗,結(jié)果見圖2。

    圖2 不同升溫速率的凝膠樣品的氣相圖譜

    由圖2可知,在其它試驗條件相同的情況下,當(dāng)升溫速率為5 ℃/min 時,丙三醇峰的分離度為2.998;當(dāng)升溫速率為25 ℃/min 時,丙三醇的分離度為0.109。分離度過低會導(dǎo)致被測物質(zhì)中各組分分離不完全,因此選擇升溫速率為5 ℃/min。

    2.2 方法專屬性

    精密量取丙三醇標(biāo)準(zhǔn)工作溶液、樣品溶液、丙三醇加標(biāo)凝膠樣品溶液各1 mL,按照1.4步驟檢測,色譜圖見圖3。由圖3可知,三種溶液的保留時間均在同一位置,在目標(biāo)峰出現(xiàn)的位置確屬于待檢測的丙三醇峰,證明該方法的專屬性很高,檢測過程中不會出現(xiàn)雜峰的干擾。

    圖3 丙三醇標(biāo)準(zhǔn)工作溶液、消解前后的凝膠溶液色譜圖

    2.3 方法精密度

    配制6 份凝膠樣品溶液,按1.4 方法進行檢測,考察凝膠樣品丙三醇含量和保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,試驗結(jié)果列于表1。由表1 可知,樣品中丙三醇含量測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.13%,保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.02%,表明該方法的重現(xiàn)性很好,具有很高的精密度,能夠滿足定量分析的要求。

    表1 精密度試驗結(jié)果

    2.4 穩(wěn)定性測定

    取1份凝膠樣品溶液,每隔3 h,按照1.4方法檢測1 次樣品,測定結(jié)果列于表2。由表2 可知,計算得丙三醇峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.77%,表明在15 h內(nèi),樣品中丙三醇含量是穩(wěn)定的。

    表2 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

    2.5 線性關(guān)系和方法檢出限

    按1.4 方法檢測丙三醇系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液計算線性方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明,丙三醇質(zhì)量濃度在8.16~122 μg/mL 范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好,線性方程為y=3 266.9x-8 404.7,線性相關(guān)系數(shù)r=0.999 7。

    以3倍信噪比對應(yīng)的丙三醇質(zhì)量濃度確定檢出限為0.037 μg/mL,以10 倍信噪比對應(yīng)的丙三醇質(zhì)量濃度確定定量限為0.83 μg/mL。

    2.6 樣品加標(biāo)回收試驗

    稱取已知組分含量的透明質(zhì)酸凝膠樣品溶液,用標(biāo)準(zhǔn)加入法分別測定40.13、36.48、32.83 μg/mL 3個添標(biāo)水平下丙三醇的回收率,每組樣品6份,結(jié)果見表3。由表3 數(shù)據(jù)可知,丙三醇平均回收率為99.17~99.94%,表明該方法的準(zhǔn)確度很高,滿足樣品的分析要求。

    表3 樣品加標(biāo)回收試驗結(jié)果

    3 結(jié)語

    通過優(yōu)化樣品處理和檢測條件,建立了測定交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠修飾度的氣相色譜法,經(jīng)方法學(xué)驗證,所建立的方法具有重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高、檢出限低等優(yōu)點,證明該方法可高效、準(zhǔn)確的檢測透明質(zhì)酸凝膠樣品中的丙三醇含量,再通過計算即可得到凝膠樣品的修飾度。

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