液相色譜儀自動進樣器樣品室溫度的校準(zhǔn)

黃彬磊，曾憲鈺，李貝琦

（上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院，上海 201114）

液相色譜儀由輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等部分組成，根據(jù)固定相和流動相間吸附和分配系數(shù)的差異，將樣品各組分分離，先后進入到檢測器中，由數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄得到色譜圖，根據(jù)保留時間與響應(yīng)值進行定性、定量分析。從1903 年俄國植物學(xué)家Tswett 發(fā)明柱吸附色譜技術(shù)，到20世紀(jì)70年代初高效液相色譜儀出現(xiàn)，再到2004 年美國沃特世公司首次推出商品化的超高效液相色譜儀[1]，直至今天，液相色譜儀以其高分辨率、高靈敏度、高分離效率等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)于生物醫(yī)藥[2-3]、食品檢測[4-5]、環(huán)境分析[6-7]、石油化工[8]、紡織品檢測[9]等各種領(lǐng)域。

液相色譜儀的進樣系統(tǒng)可以分為自動進樣器與手動進樣器大類，相比于手動進樣器，使用自動進樣器可以大大節(jié)約液相色譜檢測的時間成本，當(dāng)前大多數(shù)的液相色譜儀都配備了自動進樣器。隨著液相色譜儀自動進樣器的不斷發(fā)展，目前不少自動進樣器具備了樣品室溫度控制的功能。因為在液相色譜檢測中，一些對溫度敏感的樣品對要求樣品室溫度應(yīng)控制在一定范圍內(nèi)。比如中國藥典中阿奇霉素[10]、頭孢呋辛鈉[11]的相關(guān)檢測中都對樣品室的溫度有要求。特別在液相色譜儀自動進樣器飛速發(fā)展的今天，自動進樣器樣品室容納的樣品數(shù)量越來越多，在樣品室中放置一批樣品后儀器便連續(xù)長時間工作，這樣的情況經(jīng)常出現(xiàn)，而對于溫度敏感的樣品在樣品室中長時間儲存時，必須對樣品室的溫度進行控制，以免樣品變質(zhì)。因此液相色譜儀自動進樣器的溫度控制功能十分重要，而溫度控制是否準(zhǔn)確、均勻、穩(wěn)定，則需要通過計量校準(zhǔn)來確認(rèn)。

目前現(xiàn)有的液相色譜儀國家檢定規(guī)程JJG 705—2014 《液相色譜儀檢定規(guī)程》[12]和液相色譜儀的國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 26792—2019 《高效液相色譜儀》[13]中均沒有涉及進樣器。液相色譜儀自動進樣器的國家標(biāo)準(zhǔn) GB/T 38125—2019 《液相色譜儀用自動進樣器》[14]中則沒有涉及樣品室溫度。有學(xué)者對液相色譜儀自動進樣器的校準(zhǔn)與測試進行了研究[15-18]，但都不涉及樣品室溫度。筆者針對液相色譜儀自動進樣器樣品室溫度提出相關(guān)的校準(zhǔn)項目、校準(zhǔn)方法、技術(shù)指標(biāo)與校準(zhǔn)設(shè)備，以保證其溫度控制的準(zhǔn)確性和溯源性。自動進樣器樣品室溫度校準(zhǔn)所使用的設(shè)備，除了傳統(tǒng)的有線溫度傳感器，還有近些年生物化學(xué)計量領(lǐng)域應(yīng)用較多的小型無線溫度傳感器，筆者從結(jié)構(gòu)適應(yīng)性和實際測量結(jié)果對兩者進行了對比分析。

1 液相色譜儀自動進樣器樣品室的溫控原理和布局結(jié)構(gòu)

目前液相色譜儀自動進樣器樣品室多采用帕爾貼元件進行溫度控制，風(fēng)扇從樣品室區(qū)域抽取空氣，使空氣通過冷卻/加熱模塊，并按照設(shè)置的目標(biāo)溫度進行冷卻或加熱。在冷卻模式中，帕爾貼元件冷卻的一側(cè)會發(fā)生冷凝，該冷凝水會通過管道導(dǎo)出至自動進樣器樣品室之外。通過冷卻/加熱模塊形成的恒溫空氣再流動至樣品盤區(qū)域并均勻分布于樣品盤各處，實現(xiàn)對樣品盤上樣品瓶的有效控溫。對其溫度進行計量校準(zhǔn)，溫度傳感器的布點位置也需要選擇在樣品瓶所在的位置。

液相色譜儀自動進樣器樣品室的布局結(jié)構(gòu)對于其溫度校準(zhǔn)方法及校準(zhǔn)設(shè)備的選擇有不小的影響，而目前液相色譜儀廠家型號眾多，樣品室布局結(jié)構(gòu)也有不小的差異。筆者對主流液相色譜儀自動進樣器樣品室的布局結(jié)構(gòu)進行了分類，分類方法主要基于自動進樣器樣品盤的切換方式。當(dāng)前液相色譜儀自動進樣器的結(jié)構(gòu)朝著大量樣品瓶與多樣品盤的方向發(fā)展，一個自動進樣器往往有不止一個樣品盤，而樣品盤之間的切換方式對于自動進樣器樣品室溫度的計量操作有較大的影響。筆者將其分為三類，分別為抽屜式、旋轉(zhuǎn)式和固定式。抽屜式指樣品盤放置在類似抽屜的結(jié)構(gòu)中，可拉出或推進，放置好的樣品盤再通過自動進樣器的機械操作移動到指定位置進樣，如Agilent 1260/1290 Infinity Ⅱ Multisampler進樣器、SHIMADZU SIL-30AC 自動換架器進樣器。旋轉(zhuǎn)式是指多個樣品盤之間以旋轉(zhuǎn)的方式進行切換，每一次旋轉(zhuǎn)只有部分樣品盤會出現(xiàn)在操作者可操作的區(qū)域，其它樣品盤則處于非操作區(qū)域，不可取放樣品，如Thermo Fisher Ultimate 3000 進樣器，Waters Alliance e2695 進樣器。固定式如Agilent 1200 系列進樣器、Agilent 1260/1290 Infinity Ⅱ進樣器、Waters ACQUITY 系列進樣器。如果所有樣品盤可同時出現(xiàn)在操作者可操作的區(qū)域，即使以旋轉(zhuǎn)方式切換樣品盤，仍將其歸為固定式，因為其不影響樣品室溫度校準(zhǔn)中傳感器的布點操作，如Thermo Fisher Vanquish進樣器。

2 液相色譜儀自動進樣器樣品室溫度的校準(zhǔn)項目和校準(zhǔn)方法

液相色譜儀自動進樣器的樣品盤是多孔位的，其溫度控制是要實現(xiàn)對所有孔位的有效控溫，這類多孔位的溫度控制類似于聚合酶鏈反應(yīng)分析儀（PCR）的96 孔板和化學(xué)需氧量（COD）測定儀消解爐消解孔的控溫。雖然樣品孔位數(shù)量、樣品體積和溫度范圍與上述兩者都有區(qū)別，但是液相色譜儀自動進樣器樣品室溫度的校準(zhǔn)項目的設(shè)立可以參考這兩者的國家計量技術(shù)規(guī)范，即JJF 1527—2015 《聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》[19]與JJG 975—2002 《化學(xué)需氧量（COD）測定儀檢定規(guī)程》[20]。以上兩個國家計量技術(shù)規(guī)范中均設(shè)立了溫度示值誤差和溫度均勻性兩個校準(zhǔn)項目，用以考察其溫度是否準(zhǔn)確、均勻。而準(zhǔn)確性與均勻性對于液相色譜儀自動進樣器樣品室的溫度而言也是至關(guān)重要的，其溫度必須準(zhǔn)確才能保證樣品室中的樣品處于所需的溫度環(huán)境中，其溫度也必須均勻才能保證樣品瓶放置在不同的孔位都能夠得有效的控溫。溫度示值誤差的溫度測量點選取5、20、35 ℃，因為目前市場上的液相色譜儀自動進樣器標(biāo)明的樣品室溫度控制范圍絕大多數(shù)為（4～40） ℃，選取的以上三個溫度測量點位于該溫控范圍的高、中、低三個位置，用以考察自動進樣器樣品室在高、中、低三個溫度區(qū)間的控溫效果。另外多數(shù)液相色譜儀的使用者對于其自動進樣器樣品室的控溫需求是保持低溫，因此特別選取5 ℃這個靠近溫控范圍下限的溫度測量點。

除了準(zhǔn)確性與均勻性以外，樣品室溫度的穩(wěn)定性也很重要，因為在液相色譜儀的使用中，樣品瓶在樣品室中保存十幾小時的情況是經(jīng)常出現(xiàn)的?？紤]到計量的時間成本，溫度穩(wěn)定性的測量時間不宜過長，參考JJG 705—2014 《液相色譜儀檢定規(guī)程》[12]中柱箱溫度穩(wěn)定性的測量時間為1 h，故將自動進樣器樣品室溫度穩(wěn)定性的測量時間設(shè)置為1 h。

液相色譜儀自動進樣器樣品室溫度的具體校準(zhǔn)項目和校準(zhǔn)方法如下。

2.1 溫度示值誤差

根據(jù)樣品室與樣品盤的結(jié)構(gòu)，均勻選取不少于6個樣品孔位，將溫度傳感器置于所選樣品孔位中，樣品室溫度分別設(shè)置為5、20、35 ℃，待溫度穩(wěn)定后讀取各個溫度傳感器測量值Ti，求其算術(shù)平均值Tm，按式（1）計算各個溫度測量點的示值誤差：

式中：T0——樣品室溫度設(shè)定值，℃；

Tm——樣品室各溫度點測量平均值，℃；

ΔT——溫度示值誤差，℃。

2.2 溫度均勻性

取2.1所得溫度傳感器測量值Ti中的最大值Tmax與最小值Tmin，按式（2）計算各個溫度測量點的溫度均勻性：

式中：Tmax——各孔位溫度測量值中的最大值，℃；

Tmin——各孔位溫度測量值中的最小值，℃；

ΔTu——溫度均勻性，℃。

2.3 溫度穩(wěn)定性

按照2.1布點位置和測量方式，樣品室溫度設(shè)置為20 ℃，待溫度穩(wěn)定后讀取第一次溫度測量值Tt,1，然后每隔10 min讀取一次溫度測量值Tt,i，直至第60 min讀取第7次溫度測量值Tt,7。每次溫度測量值均為各孔位溫度的算術(shù)平均值，按式（3）計算得到溫度穩(wěn)定性：

式中：Tt,max——7次溫度測量值中的最大值，℃；

Tt,min——7次溫度測量值中的最小值，℃；

ΔTs——溫度穩(wěn)定性，℃。

3 技術(shù)指標(biāo)

液相色譜儀自動進樣器樣品室的溫度主要影響樣品的儲存，而樣品的儲存溫度一般不會過于苛刻，因此其技術(shù)指標(biāo)相較于液相色譜儀柱箱溫度可適當(dāng)放寬。JJG 705—2014 《液相色譜儀檢定規(guī)程》[12]中柱箱溫度最大允許誤差為±2 ℃，柱箱溫度穩(wěn)定性為≤1 ℃/h，因此將自動進樣器樣品室溫度示值誤差和溫度穩(wěn)定性的技術(shù)指標(biāo)分別設(shè)定為±3 ℃和≤2 ℃/h，溫度均勻性的指標(biāo)設(shè)定為≤3 ℃見表1。

表1 液相色譜儀自動進樣器樣品室溫度的計量特性技術(shù)指標(biāo)

4 校準(zhǔn)設(shè)備

4.1 校準(zhǔn)設(shè)備的技術(shù)要求

溫度測量設(shè)備：測量范圍為（4～40） ℃，分辨率不大于0.1 ℃，最大允許誤差±0.3 ℃，能夠同時測量不少于6個孔位的溫度。需根據(jù)液相色譜儀自動進樣器樣品室的結(jié)構(gòu)選擇有線溫度測量方式與無線溫度測量方式。

4.2 有線溫度測量方式

有線溫度測量方式是采用有線的溫度傳感器，如熱電偶等，將其插入需要測量的孔位進行溫度測量。這種測量方式的優(yōu)勢為有線溫度傳感器價格較低，一般計量機構(gòu)均有配備，不需要另行購置。并且JJG 705—2014 《液相色譜儀檢定規(guī)程》[12]中要求測量柱箱溫度，按照規(guī)程要求，需要配備數(shù)字溫度計，若該測溫設(shè)備具備連接多個有線溫度傳感器的功能，即可直接用于測量自動進樣器樣品室溫度。

但是有線溫度測量方式有明顯的局限性。如前文所述，自動進樣器樣品室的布局結(jié)構(gòu)對校準(zhǔn)設(shè)備的選擇有較大的影響，如果樣品盤為抽屜式，連接多根有線溫度傳感器可能會導(dǎo)致其抽屜無法正常閉合，也就無法正常測量樣品室溫度。如果樣品盤為旋轉(zhuǎn)式，則其旋轉(zhuǎn)會導(dǎo)致有線溫度傳感器纏繞或牽扯，難以固定，甚至可能導(dǎo)致樣品盤切換卡頓造成損壞。因此有線溫度測量方式一般只適用于樣品盤為固定式的自動進樣器，即使是這類自動進樣器，有線溫度傳感器的連接線也有可能導(dǎo)致樣品室門不能完全閉合，測量溫度時還需要通過膠帶等方式輔助固定，否則容易導(dǎo)致溫度探頭脫離樣品孔。而如果采用無線溫度測量方式則能夠很好的避免上述這些問題。

4.3 無線溫度測量方式

隨著近幾年生物化學(xué)儀器計量校準(zhǔn)能力的提升，為了測量體積較小的96 孔板孔位中的溫度，小型無線溫度傳感器在生物化學(xué)計量領(lǐng)域也獲得了較大的發(fā)展，得到了廣泛的應(yīng)用。例如JJF 1527—2015 《聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》[19]和JJF 1874—2020 《（自動）核酸提取儀校準(zhǔn)規(guī)范》[21]中都需要使用這類小型無線溫度傳感器，其中有的是將多個傳感器集成為一塊完整的96孔板樣式，而有的小型溫度傳感器則可以各自獨立放置。這類可獨立放置的小型無線溫度傳感器正好適合于測量液相色譜儀自動進樣器樣品室的溫度，因為其可以自由移動放置在需要測量的目標(biāo)孔位上，并且液相色譜儀的樣品孔體積遠大于96孔板的樣品孔體積，因此該溫度探頭可以很容易的置于其中，液相色譜儀樣品孔上方的空間也足夠容納這類小型無線溫度傳感器。測量時將其放置在需要測量的目標(biāo)孔位，通過無線信號傳輸，將測量結(jié)果傳輸至電腦或其它相應(yīng)的數(shù)據(jù)記錄儀上。

使用無線溫度測量方式能夠完全避免有線溫度測量方式中有線溫度傳感器纏繞、牽扯、難以固定、致使樣品室閉合不嚴(yán)等諸多問題，因為這類無線溫度傳感器就像液相色譜儀的樣品瓶一樣放置于樣品孔上，樣品盤的移動和轉(zhuǎn)動都影響測定，從而對抽屜式、旋轉(zhuǎn)式、固定式各類自動進樣器都能實現(xiàn)穩(wěn)定良好的測量。并且，在實際操作中，由于沒有線的束縛，這類小型無線溫度傳感器能夠輕易的放置于樣品瓶所處的樣品孔中心位置，而有線溫度傳感器使用膠帶固定后雖然也能保證其探頭一端處于樣品孔內(nèi)，但由于空間狹小，很難保證其不出現(xiàn)貼壁或觸底的情況，對溫度測量造成一定的影響。

從測量準(zhǔn)確度上來說，無線溫度傳感器與有線溫度傳感器基本一致。JJF 1874—2020 《（自動）核酸提取儀校準(zhǔn)規(guī)范》[21]中對測溫設(shè)備也就是無線溫度傳感器最大允許誤差的要求為±0.3 ℃，而JJG 705—2014 《液相色譜儀檢定規(guī)程》[12]中對有線數(shù)字溫度計的要求也是±0.3 ℃，均能滿足液相色譜儀自動進樣器樣品室溫度測量的需求。

筆者分別采用有線溫度測量方式與無線溫度測量方式對同一臺液相色譜儀自動進樣器樣品室的溫度進行校準(zhǔn)，對比其結(jié)果。

5 無線溫度測量方式與有線溫度測量方式校準(zhǔn)結(jié)果的對比

5.1 目標(biāo)設(shè)備

Agilent 1260 Infinity Ⅱ液相色譜儀自動進樣器。

5.2 校準(zhǔn)設(shè)備

有線溫度測量儀：Vtest-1101X 型，溫度測量范圍為0～300 ℃，U=0.1 ℃（k=2），福建省計量科學(xué)研究院/微測儀器（福州）有限公司。

無線溫度測量儀：CYTC-NAE-SS型，溫度測量范圍為0～120 ℃，U=0.1 ℃（k=2），產(chǎn)越（上海）電子科技有限公司。

5.3 校準(zhǔn)結(jié)果

有線溫度測量方式與無線溫度測量方式的校準(zhǔn)結(jié)果見表2。結(jié)果表明目標(biāo)自動進樣器樣品室的溫度十分穩(wěn)定，為兩種測量方式的對比奠定基礎(chǔ)。兩種測量方式所得到的溫度測量值十分接近，兩種方法對于自動進樣器樣品室溫度的測量都是準(zhǔn)確可靠的。在溫度均勻性方面，僅在20 ℃時兩者比較一致，5 ℃和35 ℃時無線溫度測量方式所得到的溫度均勻性結(jié)果優(yōu)于有線溫度測量方式，特別是在35 ℃時無線溫度測量方式得到的均勻性結(jié)果為0.6 ℃，而有線溫度測量方式為1.3 ℃，兩者有0.7 ℃的差距。在5 ℃時兩者也有0.3 ℃的差距。產(chǎn)生這種差距的原因主要是有線溫度傳感器的連接線導(dǎo)致樣品室門不能完全閉合，致使樣品室內(nèi)溫度受到樣品室外溫度一定的干擾。當(dāng)樣品室溫度設(shè)置為20 ℃時，其與樣品室外溫度（20 ℃）接近，因此干擾較小，所測得的均勻性結(jié)果也與無線溫度測量方式基本一致。而當(dāng)樣品室溫度為5、35 ℃時，樣品室外溫度與樣品室內(nèi)溫度差距較大，產(chǎn)生的干擾也較大，所以導(dǎo)致這兩個溫度點所得到的均勻性結(jié)果與無線溫度測量方式有一定的差距。其次，樣品孔內(nèi)孔間狹小，受到連接線的阻礙，有線溫度探頭在孔內(nèi)的位置不像無線溫度探頭那么容易控制，可能出現(xiàn)貼壁或觸底的情況，不利于溫度均勻性的測量，所以溫度均勻性測量結(jié)果稍高，所以從實際測量操作及其測量結(jié)果的角度出發(fā)，無線溫度測量方式優(yōu)于有線溫度測量方式。

表2 有線溫度測量方式與無線溫度測量方式的校準(zhǔn)結(jié)果

6 結(jié)語

液相色譜儀自動進樣器樣品室的控溫效果的優(yōu)劣直接影響著液相色譜樣品的儲存和測試，為保證液相色譜儀自動進樣器樣品室溫度的準(zhǔn)確性與溯源性，結(jié)合溫控原理和布局結(jié)構(gòu)提出相關(guān)的校準(zhǔn)項目、校準(zhǔn)方法與技術(shù)指標(biāo)。關(guān)于其校準(zhǔn)設(shè)備，筆者提出了有線溫度測量方式與無線溫度測量方式兩種方法，并進行對比。兩者測量準(zhǔn)確度相當(dāng)，但無線溫度測量方式能夠適用于各種布局結(jié)構(gòu)的自動進樣器樣品室，且測量結(jié)果的均勻性也較好。而有線溫度測量方式雖然具備易于獲得且成本較低的優(yōu)勢，但由于其連接線的存在可能會導(dǎo)致抽屜式樣品室的抽屜與固定式樣品室的門無法正常閉合，對于旋轉(zhuǎn)式的樣品室則可能出現(xiàn)連接線纏繞、牽扯的狀況，致使溫度測量無法正常進行，并且由于連接線的約束，其溫度探頭一端的位置也不易控制，影響溫度均勻性的測量結(jié)果，因此無線溫度測量方式更適合用于液相色譜儀自動進樣器樣品室溫度的計量校準(zhǔn)。