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    現(xiàn)代分析技術(shù)在中藥藥效成分檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展

    2023-11-09 10:40:03張偉黃金林
    化學(xué)分析計(jì)量 2023年9期
    關(guān)鍵詞:藥效指紋圖譜

    張偉,黃金林

    (1. 淮安市食品藥品檢驗(yàn)所,江蘇淮安 223300; 2. 揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225009)

    中醫(yī)藥是中國(guó)獨(dú)特的醫(yī)藥資源和科學(xué)的文化瑰寶,在中華民族幾千年的繁衍傳承中發(fā)揮著重要作用,對(duì)世界醫(yī)藥科學(xué)的發(fā)展產(chǎn)生了巨大的推動(dòng)作用。而作為中醫(yī)藥文化體系的重要組成部分,中藥一直以來(lái)都是醫(yī)藥工作人員的研究主體。尤其自中國(guó)正式成為WTO 成員后,中藥現(xiàn)代化成為中藥研究的重要方向。但在與國(guó)際接軌的發(fā)展過(guò)程中,中藥的質(zhì)量控制及其療效的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)問(wèn)題在現(xiàn)代化中藥科學(xué)研究中日益突出[1]。早期,中藥現(xiàn)代化研究以中藥有效成分的提取、分離以及中藥質(zhì)量控制為主。經(jīng)過(guò)多年的研究,中藥中的化學(xué)組分越分越細(xì),中藥的有效成分也由單一組分到多個(gè)組分。但以上研究只是將中藥看成了各種組分的簡(jiǎn)單加和,而忽視了中藥各組分之間的相互協(xié)同作用。這種割裂式的研究,忽視了事物之間普遍聯(lián)系規(guī)律與相互作用的關(guān)系,也不符合中藥的整體觀理念,因此近年來(lái),在中藥組分研究充分的基礎(chǔ)上,中藥現(xiàn)代化研究進(jìn)入更新的與更深的發(fā)展階段—中藥藥效成分的研究。

    中藥藥效成分與中藥有效成分是兩個(gè)概念,不能完全等同[2]。尤其在中藥成方制劑中,多種中藥之間的關(guān)系、中藥多種組分之間關(guān)系更需要科學(xué)的檢出方法。目前,這種方法主要是中藥譜效關(guān)系學(xué)。它以現(xiàn)代分析技術(shù)為基礎(chǔ),運(yùn)用中藥指紋圖譜技術(shù)與藥效學(xué)研究手段分別獲取中藥指紋圖譜中的化學(xué)組分的信息與中藥的整體藥效信息,然后應(yīng)用生物信息學(xué)將這些化學(xué)信息與藥效信息有機(jī)結(jié)合起來(lái)構(gòu)建譜效關(guān)系,最后篩選出中藥中的藥效成分[3]。查閱近些年的研究成果,可以佐證中藥中一些藥效成分是有效成分,但也有很多未知的藥效成分并不是“有效成分”。

    如今現(xiàn)代分析技術(shù)在藥品研發(fā)、藥品生產(chǎn)、藥品監(jiān)管等領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用。作為中藥現(xiàn)代化研究領(lǐng)域的熱點(diǎn),中藥藥效成分的研究成果也越來(lái)越多。但一直以來(lái),檢出中藥藥效成分的現(xiàn)代分析技術(shù)應(yīng)用情況缺少一個(gè)全面的總結(jié),因此筆者對(duì)近十年來(lái)現(xiàn)代分析技術(shù)在中藥藥效成分檢測(cè)中的研究成果做一概述,以供中藥研究人員參考。

    1 色譜分析技術(shù)的應(yīng)用

    色譜分析是20 世紀(jì)發(fā)展起來(lái)的一種有效的分析與分離技術(shù),其主要原理是利用目標(biāo)組分在固定相與流動(dòng)相之間的分配系數(shù)的差異來(lái)實(shí)現(xiàn)相互分離。按照分離原理可以分為分配色譜、吸附色譜、離子交換色譜、分子排阻色譜等;按照流動(dòng)相分子聚集狀態(tài)可以分為液相色譜、氣相色譜、超臨界流體色譜法等[4]。目前,色譜法已經(jīng)成為中國(guó)藥典收載最多的現(xiàn)代分析方法,也是中藥藥效成分檢測(cè)應(yīng)用最廣泛的現(xiàn)代分析方法。

    1.1 液相色譜 (HPLC) 法

    液相色譜法是一種以液體作為流動(dòng)相的分離技術(shù),具有選擇性好,靈敏度、分離效率高等優(yōu)勢(shì)[5]。液相色譜儀常用的檢測(cè)器有紫外檢測(cè)器(UV)、二極管陣列檢測(cè)器(DAD)、電化學(xué)檢測(cè)器(ECD)、蒸發(fā)光檢測(cè)器(ELSD)等[6]。

    趙茜等[7]在研究昆侖山雪菊抗氧化藥效成分時(shí),采用高效液相色譜儀,利用吸附色譜法原理將雪菊中的化學(xué)成分進(jìn)行有效分離,并用紫外分光光度計(jì)將各個(gè)成分檢出并建立指紋圖譜,最后用灰色關(guān)聯(lián)度法將雪菊的化學(xué)信息與藥效信息有機(jī)結(jié)合起來(lái),構(gòu)建了雪菊的抗氧化譜效關(guān)系模型。結(jié)果顯示,雪菊中有5個(gè)組分可以作為抗氧化藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

    楊錫金等[8]在景天三七抗氧化活性的譜效關(guān)系研究中,根據(jù)吸附色譜法原理,用高效液相色譜儀將三七中的化學(xué)組分分離,然后用電化學(xué)檢測(cè)器檢出各組分并建立指紋圖譜。通過(guò)偏最小二乘回歸分析和灰色關(guān)聯(lián)度法研究指紋圖譜與抗氧化活性之間的譜效關(guān)系。結(jié)果表明,表沒(méi)食子兒茶素、沒(méi)食子酸酯、楊梅苷、異槲皮苷、迷迭香酸和槲皮苷等化合物為景天三七抗氧化活性的關(guān)鍵成分。

    曹陽(yáng)洋等[9]在分析紅藥子抗氧化活性藥效物質(zhì)時(shí),采用高效液相色譜儀將紅藥子的化學(xué)組分在吸附色譜中得到有效分離,借助二極管陣列檢測(cè)器建立了紅藥子指紋圖譜。通過(guò)偏最小二乘法構(gòu)建了紅藥子的譜效關(guān)系,挖掘出綠原酸、巖白菜素、隱綠原酸為紅藥子抗氧化活性的藥效物質(zhì)。

    付文鵬[10]在美洲大蠊抗肝纖維化活性部位(PA-B)物質(zhì)基礎(chǔ)初探及譜效研究中,運(yùn)用吸附色譜原理,借助高效液相色譜儀將美洲大蠊抗肝纖維化活性部位進(jìn)行組分分離,通過(guò)蒸發(fā)光檢測(cè)器檢出并建立指紋圖譜。利用灰色關(guān)聯(lián)度法與偏最小二乘回歸法研究其譜效關(guān)系,確認(rèn)4種化合物是PA-B發(fā)揮抗肝纖維化作用的藥效成分。

    孫杰[11]在研究蓮藕多糖的藥效組分時(shí),根據(jù)分子排阻色譜法原理,運(yùn)用高效液相色譜儀建立HPSEC-PDA指紋圖譜。采用多元線性回歸分析蓮藕多糖指紋特征與體外活性的相關(guān)性發(fā)現(xiàn):多糖中半乳糖醛酸有助于增強(qiáng)抗氧化活性;多糖中甘露糖含量與其HepG2 細(xì)胞抑制活性存在顯著正相關(guān)性;蛋白和/或結(jié)合蛋白與蓮藕多糖的抗氧化活性密切相關(guān)等。

    1.2 氣相色譜(GC)法

    氣相色譜法是以氣體作為流動(dòng)相的色譜分析方法,主要用于分析氣體、揮發(fā)性或半揮發(fā)性液體,不適合難揮發(fā)與不穩(wěn)定性物質(zhì)的分析[12]。

    尹蓮[13]等研究加味四妙丸有效部位群配伍藥效物質(zhì)基礎(chǔ)時(shí),采用GC技術(shù)建立指紋圖譜,運(yùn)用數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法(多元回歸分析與相關(guān)分析)構(gòu)建加味四妙丸的譜效關(guān)系,確認(rèn)了指紋圖譜中21個(gè)化學(xué)組分具有抗炎、陣痛、降尿酸藥效。

    1.3 超高效液相色譜 (UPLC) 法

    超高效液相色譜法與高效液相色譜法原理相同,兩者的主要差別在于色譜柱填料粒子大小,但超高效液相色譜法分析時(shí)間更少、靈敏度更高、分離度更好[14]。

    王惠等[15]采用UPLC技術(shù)研究蟬花抑菌抗氧化物質(zhì)基礎(chǔ),建立人工蟬花不同部位的UPLC 指紋譜圖。通過(guò)聚類分析與灰色關(guān)聯(lián)度分析建立了人工蟬花的相關(guān)譜效關(guān)系,確認(rèn)鳥(niǎo)苷、腺苷等物質(zhì)是抑菌、抗氧化功能的藥效成分。

    1.4 超高效合相色譜(UPC2)法

    超高效合相色譜法是以超臨界流體CO2為主要流動(dòng)相的分離技術(shù),它將GC 與LC 技術(shù)完美結(jié)合,同時(shí)打破了GC 與LC 技術(shù)限制,實(shí)現(xiàn)了高沸點(diǎn)、低揮發(fā)、遇熱不穩(wěn)定、柱效低等更多物質(zhì)的色譜分離[16]。

    張小藝[17]采用UPC2 技術(shù)研究藁本類藥材藥效物質(zhì),建立了藁本、遼藁本及新疆藁本藥材指紋圖譜。通過(guò)典型的相關(guān)分析方法構(gòu)建藁本類藥材譜效關(guān)系,明確了洋川芎內(nèi)酯A、阿魏酸、阿魏酸松柏酯等化學(xué)物質(zhì)具有抗炎活性;丁烯基苯酞、藁本內(nèi)酯洋、川芎內(nèi)酯C等化學(xué)物質(zhì)具有鎮(zhèn)痛活性。

    2 色譜聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用

    2.1 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)法

    液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是將液相色譜技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合,既可以實(shí)現(xiàn)對(duì)被測(cè)成分的有效分離,又能對(duì)分離開(kāi)的各個(gè)有機(jī)化合物進(jìn)行分析,最后得到每一個(gè)有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)信息[18]。

    劉林莉等[19]采用UPLC -MS/MS 液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)研究白及正丁醇提取物止血作用成分,建立了16批白及的指紋圖譜。再采用灰色關(guān)聯(lián)度分析法、雙變量相關(guān)分析法及偏最小二乘回歸分析法研究白及正丁醇提取物的譜效關(guān)系,確認(rèn)白及止血活性成分為天麻素、GymnosideⅠ、Militarine。

    南敏倫等[20]采用HPLC-MS/MS 液質(zhì)聯(lián)用儀研究忍冬葉不同溶劑提取物抗氧化物質(zhì)基礎(chǔ),建立忍冬葉11 種不同極性溶劑提取物的指紋圖譜。通過(guò)灰色關(guān)聯(lián)度法和偏最小二乘法聯(lián)合分析抗氧化作用的譜效關(guān)系,確認(rèn)3,4-二羥基肉桂酸、綠原酸、3,4-二咖啡??鼘幩帷⒛鞠菟?、槲皮素等可能是抗氧化的主要活性成分。

    2.2 氣相色譜-質(zhì)譜 (GC-MS) 聯(lián)用法

    氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用是在氣相色譜與質(zhì)譜的基礎(chǔ)上,充分利用氣相色譜高效分離優(yōu)勢(shì)與質(zhì)譜對(duì)化合物的結(jié)構(gòu)鑒定能力,進(jìn)而快速完成物質(zhì)的分離與鑒定[21]。目前,氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)與液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)已經(jīng)成為實(shí)驗(yàn)室分析鑒定的主力,尤其應(yīng)用于保健食品、化妝品及藥品中非法添加藥物成分的檢出。

    劉昱等[22]應(yīng)用GC-MS 聯(lián)用技術(shù)研究艾葉揮發(fā)油抑菌的質(zhì)量標(biāo)志物,建立15批艾葉揮發(fā)油樣品的指紋圖譜。采用灰色關(guān)聯(lián)度法分析其譜效關(guān)系,確認(rèn)艾葉揮發(fā)油抑菌活性的潛在質(zhì)量標(biāo)志物是樟腦和龍腦。

    2.3 電感耦合等離子體質(zhì)譜 (ICP-MS)法

    電感耦合等離子體質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)合運(yùn)用了電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)。該法靈敏度高,適合各類藥品從痕量到微量元素的分析,尤其是痕量重金屬元素的測(cè)定。它可以與其它色譜分離技術(shù)聯(lián)用,進(jìn)行多種元素同時(shí)測(cè)定以及元素形態(tài)、價(jià)態(tài)的分析[23]。

    陳祥暉等[24]采用ICP-MS 技術(shù)研究礦物藥白礬體外抗宮頸癌藥效組分,建立不同產(chǎn)地白礬中差異元素輪廓譜。再用灰色關(guān)聯(lián)度法將不同產(chǎn)地礦物藥白礬元素輪廓譜與抑制率關(guān)聯(lián),確定Cr、Ca、Al、K元素是白礬能夠抑制宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

    3 光譜技術(shù)的應(yīng)用

    物質(zhì)與電磁輻射相互作用時(shí),物質(zhì)內(nèi)部易發(fā)生量子化的能級(jí)躍遷而產(chǎn)生光譜學(xué)效應(yīng)[25]。光譜分析技術(shù)就是通過(guò)利用光譜學(xué)原理來(lái)對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性、定量和結(jié)構(gòu)分析的方法[26],包括紫外分光光度法、紅外光譜法、原子吸收光譜法、熒光光譜法、拉曼光譜法等。

    紀(jì)亮等[27]運(yùn)用紅外光譜技術(shù)研究梔子仁抗氧化活性物質(zhì),采集了甘草汁炮制前后的梔子仁紅外光譜。利用聚類分析、主成分分析、偏最小二乘回歸分析等方法解析紅外光譜信息與抗氧化藥效信息之間的關(guān)系,確認(rèn)西紅花苷是梔子抗氧化活性成分。

    王聃等[28]采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜(ICP-OES) 法研究自然銅及其煅淬品中Fe、Zn、Mg、Cu 等多種金屬元素與促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的譜效關(guān)系。通過(guò)采用偏最小二乘回歸法對(duì)含藥血清中的金屬元素含量與血清對(duì)成骨細(xì)胞的增殖作用進(jìn)行譜效相關(guān)性分析,得出自然銅生品與煅淬品均能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖,與其所含F(xiàn)e、Zn、Mg、Cu等金屬元素有關(guān),且與Fe的相關(guān)性最大的結(jié)論。

    4 核磁共振波譜技術(shù)的應(yīng)用

    核磁共振波譜是一種基于特定原子核在外磁場(chǎng)中吸收了與其裂分能級(jí)間能量差相對(duì)應(yīng)的射頻場(chǎng)能量而產(chǎn)生共振現(xiàn)象的分析方法,主要有氫譜(1HNMR)和碳譜(13C-NMR)兩種。氫譜是發(fā)展最早,應(yīng)用最廣泛的核磁共振波譜,也是物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析最重要的工具之一[29]。

    鄭曉芬等[30]運(yùn)用氫譜(1H-NMR)研究逍遙散乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物(XYE-E)的抗抑郁藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。采用灰色關(guān)聯(lián)分析、相關(guān)性分析及回歸分析方法將1H-NMR 圖譜中各組分特征峰的相對(duì)峰面積與藥效信息相關(guān)聯(lián),確定了與XYE-E抗抑郁藥效密切相關(guān)的物質(zhì)是柴胡皂苷和白術(shù)內(nèi)酯。

    5 結(jié)論

    近年來(lái),越來(lái)越多的研究成果證實(shí)現(xiàn)代分析技術(shù)已經(jīng)成為現(xiàn)代中藥研究與中藥現(xiàn)代化研究的重要手段。尤其以液相色譜、氣相色譜、液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用、氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)為主體的現(xiàn)代分析技術(shù)在中藥中藥效成分的檢出中發(fā)揮著主導(dǎo)作用。這不僅是中藥藥效成分有效分離的需要,更是指紋圖譜技術(shù)及其藥效組分化學(xué)信息獲取的需要。但是查閱文獻(xiàn),分離中藥藥效成分與建立指紋圖譜還有很多其它的現(xiàn)代分析技術(shù),如電化學(xué)技術(shù)[31-33]、薄層色譜法[34]、毛細(xì)管電泳法[35-38]、高速逆流色譜法[39-40]等。但是這些現(xiàn)代技術(shù)還未能廣泛應(yīng)用于中藥藥效成分的檢出。

    中藥來(lái)源復(fù)雜,組分多且含量低,很難有單一的方法可以將其藥效成分全部檢出。目前,已有的研究成果表明,單一的現(xiàn)代分析技術(shù)所檢出的中藥藥效成分是不完全的[17];同時(shí),中藥藥效成分的研究成果中存在很多藥效組分名稱未知的問(wèn)題[41-43]。因此,多種現(xiàn)代分析技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用,建立多種不同分析原理與技術(shù)的中藥指紋圖譜,構(gòu)建多維化的中藥譜效關(guān)系,是中藥藥效組分全面檢出的重要思路,也是未知中藥藥效組分名稱確認(rèn)的有效方法。

    中藥藥效成分的研究關(guān)乎中藥的質(zhì)量,因此概述近年來(lái)的研究進(jìn)展對(duì)其具有現(xiàn)實(shí)的指導(dǎo)意義與顯著的參考作用,同時(shí)也希望現(xiàn)代分析技術(shù)在中藥藥效成分檢出中具有更廣闊的應(yīng)用前景。

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