連續(xù)流動(dòng)分析法測定泡菜中總氮、硝酸鹽、亞硝酸鹽的樣品處理

劉李蕾，白農(nóng)恩，祁福良，楊曉燕，2，佘容，2

（1. 大理大學(xué)東喜瑪拉雅研究院，云南大理 671003； 2. 云南省高校洱海流域保護(hù)與可持續(xù)發(fā)展研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國三江并流區(qū)域生物多樣性協(xié)同創(chuàng)新中心，云南大理 671003）

連續(xù)流動(dòng)分析法是一種利用濕化學(xué)法，通過空氣片段連續(xù)流動(dòng)分析技術(shù)對(duì)液體樣品理化指標(biāo)進(jìn)行自動(dòng)分析的新手段，因具有高效，便捷，精密度、準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)，成為當(dāng)前水質(zhì)理化指標(biāo)測定的首要選擇[1-3]。連續(xù)流動(dòng)分析儀具備自動(dòng)稀釋和過濾樣品的功能優(yōu)勢，但是在實(shí)際操作過程中，由于蠕動(dòng)泵管吸取樣品量及濾膜使用壽命受限，若樣品不均勻或存在較大顆粒，極易造成濾膜損壞、泵管堵塞、測定效率低下、測定值不準(zhǔn)確等問題[1-2]，因此連續(xù)流動(dòng)分析法樣品處理格外重要。

膠體為一類介于粗分散系和溶液之間的分散體系，如牛奶、豆?jié){等都具有膠體特性[3-7]，生產(chǎn)實(shí)踐和科學(xué)研究通常需要分析膠體類樣品的理化性質(zhì)。膠體因存在較大顆粒物以及絮狀物，導(dǎo)致液體極易不均勻，無法滿足連續(xù)流動(dòng)分析法的測定條件，需要對(duì)膠體樣品進(jìn)行均質(zhì)化處理。膠體類樣品的處理難以通過常見的沉降、過濾和澄清等機(jī)械分離方法實(shí)現(xiàn)[6]。在工業(yè)上廣泛使用的磁場絮凝、冷凍絮凝等方法雖然使沉降效率提高[6]，但額外添加的電解質(zhì)可能干擾樣品理化指標(biāo)的測定結(jié)果。目前尚無相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)以及明確的樣品處理方法。

泡菜是生活中最常見的發(fā)酵食品之一，利用泡菜進(jìn)行微生物群落構(gòu)建研究，從中探索最適發(fā)酵微生物配比，篩選具抗氧化活性等功能性菌種逐漸成為生態(tài)學(xué)、食品學(xué)、應(yīng)用醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域的新趨勢[8-13]。在這些研究中，經(jīng)常需要掌握泡菜湯中的理化因子變化規(guī)律。

當(dāng)前的泡菜理化指標(biāo)多局限于pH、酸度、鹽度和亞硝酸鹽的測定[14-18]，其它指標(biāo)的測定鮮有報(bào)道。由于泡菜湯具有一定粘性，通過激光筆照射具有明顯的丁達(dá)爾效應(yīng)[19]，因此泡菜湯具有膠體特性，一般過濾方法不能滿足連續(xù)流動(dòng)分析法的需求。膠體的膠粒在電場中的偏移與膠粒所帶電荷有關(guān)，而膠體凝聚除了可加相反電荷的溶膠外，還可通過加熱來實(shí)現(xiàn)[3-7]，據(jù)此，筆者探究了適用于連續(xù)流動(dòng)分析法的膠體類樣品的處理方法，以期為該類樣品的精確、快速測定提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

連續(xù)流動(dòng)分析儀：AA3型，德國Seal公司。

實(shí)驗(yàn)室純水系統(tǒng)：Master-S30UVF型，上海和泰儀器有限公司。

電子天平：PX224ZH型，感量為0.1 mg，奧豪斯儀器（常州）有限公司。

恒溫振蕩器：SHA-B 型，常州澳華儀器有限公司。

超聲波清洗機(jī)：SB25-12 DTD 型，寧波新芝生物科技股份有限公司。

磺胺、N-1-萘基乙二胺二鹽酸、硫酸聯(lián)氨：優(yōu)級(jí)純，西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司。

N-1-萘基乙二胺二鹽酸鹽：分析純，西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司。

磷酸、聚氧乙烯月桂醚Brij-35、硫酸銅、硫酸鋅、四硼酸鈉、過硫酸鉀、鹽酸、焦磷酸鈉、硝酸鉀：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

氫氧化鈉：優(yōu)級(jí)純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

顯色劑A：稱取5 g磺胺、0.25 gN-1-萘基乙二胺二鹽酸，50 mL 磷酸，用去離子水溶解后，定容至500 mL。

氫氧化鈉溶液1：稱取10 g 氫氧化鈉，3 mL 磷酸，用去離子水稀釋定容至1 000 mL，然后加入20%聚氧乙烯月桂醚Brij-35 溶液1 mL，避光保存，每周更新。

硫酸聯(lián)氨溶液1：加入硫酸銅儲(chǔ)備液10 mL（0.001 g/mL)，硫酸鋅儲(chǔ)備液10 mL（0.01 g/mL)和2 g硫酸聯(lián)氨，用去離子水稀釋到1 000 mL。

潤濕劑：取20 mL 20%聚氧乙烯月桂醚溶液Brij-35稀釋到100 mL，每月更新。

消解溶液：取14 g 四硼酸鈉、3 g 氫氧化鈉、7 g過硫酸鉀，用去離子水稀釋至1 000 mL，每周更新。

顯色劑2：取10 g磺胺、0.5 gN-1-萘基乙二胺二鹽酸鹽和150 mL 鹽酸，用去離子水稀釋至1 000 mL。

硫酸聯(lián)氨溶液2：移取2.4 g 硫酸聯(lián)氨、0.65 mL硫酸銅儲(chǔ)備溶液（0.012 g/mL），12 mL硫酸鋅儲(chǔ)備溶液（0.033 6 g/mL），用去離子水稀釋到1 000 mL，每周更新。

氫氧化鈉溶液2：取氫氧化鈉11.5 g、焦磷酸鈉7 g，用去離子水稀釋至1 000 mL 后加入2 mL 22%聚氧乙烯月桂醚溶液Brij-35，每2周更新。

硝酸鉀標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：ρ(N)=1 000 mg/L，稱取7.218 g硝酸鉀溶于去離子水中，轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中并定容混勻，盛于試劑瓶中。4 ℃下避光保存，至少穩(wěn)定6個(gè)月。

硝酸鉀標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：ρ(N)=100 mg/L，量取10.00 mL硝酸鉀標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中，用去離子水定容并混勻，盛于試劑瓶。4 ℃下避光保存，可穩(wěn)定1個(gè)月。

硝酸鉀標(biāo)準(zhǔn)使用溶液：ρ(N)=10 mg/L，準(zhǔn)確量取10.00 mL硝酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液于100 mL容量瓶中，用去離子水定容并混勻，盛于試劑瓶。4 ℃下避光保存，可穩(wěn)定7 d。

泡菜湯樣品：自制。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

取泡菜湯樣品50 mL 于50 mL 離心管中，顛倒多次后，分別取1.5 mL 于1.8 mL 離心管中，以15 000 轉(zhuǎn)速離心10 min，隨后取上清液加入另一只離心管中備用，之后按照以下7種方式處理：

（1）取離心后的樣品上清液50 μL到5 mL離心管中，加去離子水稀釋至100倍體積。

（2）取上清液稀釋至100倍體積后，在99%超聲強(qiáng)度下超聲5 min，使泡菜汁與稀釋水進(jìn)一步混勻。

（3）取上清液在99%超聲強(qiáng)度下超聲5 min，后稀釋至100 倍體積，稀釋后樣本在99%超聲強(qiáng)度下超聲5 min。

（4）取稀釋后的上清液，置于漩渦震蕩儀上震蕩5 min。

（5）取上清液液漩渦震蕩5 min后，取樣品稀釋至100倍體積，再次進(jìn)行漩渦震蕩5 min。

（6）取上清液稀釋至100倍體積后，將放有樣品的離心管在75 ℃ 水浴和超聲（99%強(qiáng)度）處理5 min。

（7）取上清液于75 ℃水浴中超聲（99%強(qiáng)度）處理5 min 后，取樣稀釋至100 倍體積，稀釋后的樣品重復(fù)一次超聲處理。

上述每個(gè)處理組在離心后，后續(xù)的具體處理方式都進(jìn)行5 次重復(fù)，（平行取樣35 份，每5 份樣品采取同一種處理方式，每份樣品平行測定3次，總共得到105 個(gè)數(shù)據(jù)），并添加3 杯去離子水樣作為空白對(duì)照。

1.2.2 樣品總氮和硝酸鹽/亞硝酸鹽含量測定

分別對(duì)上述處理后的樣品進(jìn)行總氮和硝酸鹽/亞硝酸鹽含量測定。

實(shí)驗(yàn)流程為：首先檢查儀器各原件是否符合測定標(biāo)準(zhǔn)要求，確定符合后再依次打開設(shè)備的各組件，檢查連接管是否連接好、是否存在漏液現(xiàn)象，待系統(tǒng)穩(wěn)定后，將試劑管插入相應(yīng)試劑，待基線穩(wěn)定設(shè)立分析，設(shè)定增益后，在進(jìn)樣時(shí)間為49 s，清洗時(shí)間60 s，測定波長為550 nm 的條件下加入質(zhì)量濃度分別為5、3.5、2、1.0、0.5、0.1、0.05、0.01 mg/L 的系列硝酸鉀標(biāo)準(zhǔn)工作溶液、3 個(gè)空白樣品及泡菜湯樣品進(jìn)行各指標(biāo)的測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品處理方法

在使用連續(xù)流動(dòng)分析儀測定樣品時(shí)，很容易因?yàn)闃悠返臉O小差異造成波動(dòng)，如樣品存在微小顆粒、混合不均勻等[1-2]，所以在測定理化指標(biāo)時(shí)需要盡可能的減少平行間的差異。而在使用連續(xù)流動(dòng)分析儀測定泡菜類樣品理化指標(biāo)（總氮、硝酸鹽/亞硝酸鹽含量）時(shí)，通常面臨兩個(gè)主要問題：（1）樣品中含有懸浮的不均勻絮狀物和顆粒物；（2）理化指標(biāo)值（樣品中總氮、硝酸鹽/亞硝酸鹽含量）過高，液體具有一定粘稠度，稀釋混勻困難。

二者均不利于獲得更準(zhǔn)確的檢測值。

泡菜湯樣品具有膠體特性，而膠體一般采用添加電解質(zhì)絮凝、提高溫度的方式處理[3-7]，基于此，采用離心、漩渦震蕩、超聲、溫度等不同操作組合，以便在不添加其它化合物的情況下獲取更為均勻的泡菜湯原液，以解決第一個(gè)問題。使用去離子水對(duì)原始樣品進(jìn)行稀釋，通過物理方式協(xié)助獲取均質(zhì)稀釋液，即可解決第二個(gè)問題。

2.2 儀器工作條件的設(shè)定

儀器工作條件參照儀器使用說明書（標(biāo)準(zhǔn)曲線判別系數(shù)R2=0.999 9）。因?yàn)楫?dāng)前缺乏連續(xù)流動(dòng)分析儀測定泡菜樣品的國家標(biāo)準(zhǔn)，采用水質(zhì)測定條件，通過對(duì)0.5 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)液的總氮和硝酸鹽/亞硝酸鹽兩個(gè)指標(biāo)進(jìn)行6 次測定，以確定連續(xù)流動(dòng)分析儀在相應(yīng)工作參數(shù)下的準(zhǔn)確性和精密度，試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 儀器精密度試驗(yàn)結(jié)果

由表1 可知，測定結(jié)果平均值與標(biāo)準(zhǔn)值得偏差不超過0.01，6次測定結(jié)果較標(biāo)準(zhǔn)值均無顯著偏差，滿足水質(zhì)測定要求。

2.3 方法的精密度

使用AA3型連續(xù)流動(dòng)分析儀對(duì)7個(gè)處理組各5份樣品測定值間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行計(jì)算，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 方法精密度試驗(yàn)結(jié)果

在使用AA3 型連續(xù)流動(dòng)分析儀測定膠體類樣本如泡菜湯的理化指標(biāo)時(shí)，僅采用一般的離心和稀釋處理方式不能滿足測定要求，必須進(jìn)一步處理才能使測定結(jié)果更準(zhǔn)確、穩(wěn)定。

由表2可知，在7個(gè)處理方式下測定泡菜湯硝酸鹽/亞硝酸鹽和總氮時(shí)，最佳的是第7 組處理方式，即：樣品離心后取上清液，在75 ℃水浴、99%超聲強(qiáng)度下處理5 min，稀釋處理后重復(fù)一次溫度超聲操作。結(jié)果驗(yàn)證，經(jīng)過熱處理，促使膠體聚沉，可以獲得更為澄清的上清液，利于后期使用設(shè)備進(jìn)行樣品理化指標(biāo)的測定。據(jù)此，加熱處理膠體類樣品在連續(xù)流動(dòng)分析儀測定中具有較大的開發(fā)潛能，未來可在其它理化指標(biāo)測定中進(jìn)一步探究。

2.4 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)

對(duì)樣品按照第7 組方式進(jìn)行處理，并進(jìn)行樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)泡菜湯樣品中總氮、硝酸鹽/亞硝酸鹽測定結(jié)果分別見表3、表4。

表3 加標(biāo)泡菜湯樣品總氮測定結(jié)果

表4 加標(biāo)泡菜湯樣品硝酸鹽/亞硝酸鹽測定結(jié)果

由表3、表4 可知，在將樣品溶液稀釋至100 倍體積后，總氮質(zhì)量濃度大于1 mg/L 的條件下，加標(biāo)回收率為97.5%，滿足標(biāo)準(zhǔn)要求的加標(biāo)回收率容許范圍[20]。在硝酸鹽/亞硝酸鹽質(zhì)量濃度小于1 mg/L的情況下，加標(biāo)回收率為89.0%，部分樣品的加標(biāo)回收率未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求[21-22]，可能是膠體樣品存在目前尚未發(fā)現(xiàn)的影響硝酸鹽/亞硝酸鹽測定的特性?；诖耍ㄗh建立膠體類樣品硝酸鹽/亞硝酸鹽檢測方法時(shí)，質(zhì)量控制要求應(yīng)不同于水質(zhì)等已有方法中的要求，并加強(qiáng)對(duì)膠體類樣本特性的研究，以盡快排除其影響，提高該指標(biāo)的測量準(zhǔn)確度。

3 結(jié)語

泡菜湯樣品離心后取上清液，在75 ℃水浴中99%強(qiáng)度下超聲處理5 min，再稀釋至100 倍體積，后重復(fù)一次上述處理，超聲和溫度的共同作用可使樣品混合均勻，有利于連續(xù)流動(dòng)分析儀對(duì)泡菜湯中的硝酸鹽/亞硝酸鹽和總氮含量進(jìn)行測定，該方法的精密度和準(zhǔn)確性得到驗(yàn)證。這種處理方式簡單，易于實(shí)現(xiàn)，適用于粘稠度高的溶液或膠體類樣本，可在后續(xù)試驗(yàn)中繼續(xù)探討。同時(shí)，在缺乏使用連續(xù)流動(dòng)分析儀測定膠體理化性質(zhì)的國家標(biāo)準(zhǔn)的情況下，該方法可以為類似的樣品處理提供借鑒。