一株不動(dòng)桿菌JBX-006對(duì)聚丙烯酰胺的降解特性研究*

王 睿 朱子恒 舒文明 余維初 孫文秀#

(1.長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,湖北 荊州 434025;2.長(zhǎng)江大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,湖北 荊州 434025)

聚丙烯酰胺(PAM)是一種線型水溶性高分子聚合物,是丙烯酰胺均聚物與共聚物的統(tǒng)稱,溶于水后具增稠性、減阻性、增黏性、助留性等性能,被廣泛應(yīng)用在石油開(kāi)采、水處理、紡織和造紙等領(lǐng)域[1-4]。研究表明,PAM在油田生產(chǎn)提高開(kāi)采率后大量殘存于廢棄的采出液中,排放入土壤環(huán)境后會(huì)緩慢降解為丙烯酰胺,進(jìn)而改變地下水的理化性質(zhì),對(duì)人和動(dòng)物的大腦造成毒害作用[5-6]。然而,如何高效降解PAM仍是目前亟需解決的問(wèn)題。

近年,PAM污染土壤的修復(fù)主要采用化學(xué)降解法[7]。化學(xué)降解法能夠?qū)⒋蟛糠諴AM降解成小分子有機(jī)物,但投資和運(yùn)行成本較高,易造成二次污染[8-9]。生物降解因其無(wú)污染、低成本的特點(diǎn)成了聚合物無(wú)害化處理的新途徑,受到了很多研究者的關(guān)注[10-11]。因此,從不同環(huán)境中分離微生物來(lái)降解PAM也就成了該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[12]。從含PAM的廢水及污泥中分離到的芽孢桿菌(Bacillussp.)[13]72,[14]、克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)[15]、梭菌(Clostridiumbifermentans)[16]等可以在一定程度上降解PAM,但降解率不高。改變培養(yǎng)時(shí)的營(yíng)養(yǎng)條件等可以促進(jìn)微生物對(duì)PAM的降解[17-18]。夏彥淵等[19]發(fā)現(xiàn)優(yōu)化碳源、氮源、培養(yǎng)溫度后,混合菌對(duì)PAM的降解率明顯提高,可達(dá)到32.6%。李淑芹等[20]發(fā)現(xiàn)在以PAM為唯一碳氮源條件下,優(yōu)化培養(yǎng)溫度和初始pH可以提高枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)對(duì)PAM的降解率,最高降解率可達(dá)45.04%。但實(shí)際上上述研究中的微生物降解PAM的效率仍然偏低,難以在實(shí)際應(yīng)用中達(dá)到長(zhǎng)效修復(fù)的目的。有研究發(fā)現(xiàn),金屬離子可以與PAM鏈上的羧酸根陰離子發(fā)生靜電相互作用,也可以與水中溶解氧共同作用斷裂PAM骨架,從而使PAM降解[21],這為進(jìn)一步提高微生物對(duì)PAM的降解率提供了新的思路。

因此,本研究從大慶油田周邊土壤樣品中分離出1株P(guān)AM降解效果最好的細(xì)菌,采用單因素和正交試驗(yàn)分析了外碳源、外氮源、金屬離子等因素對(duì)其降解PAM的影響,弄清其降解特性,以期為提高微生物降解PAM提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種來(lái)源

菌種分離自大慶油田周邊土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基:酵母粉5.00 g/L,胰蛋白胨10 g/L,NaCl 10.0 g/L,調(diào)pH為7。

馴化培養(yǎng)基:一定濃度的PAM,酵母粉0.05 g/L,NaCl 0.5 g/L,K2HPO41.0 g/L,MgSO40.1 g/L,調(diào)pH為7。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基:PAM 300 mg/L,NaCl 5.0 g/L,K2HPO40.5 g/L,KH2PO40.5 g/L,MgSO40.1 g/L,調(diào)pH為7。

營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基:PAM 300 mg/L,酵母粉5.00 g/L,胰蛋白胨10.0 g/L,NaCl 10.0 g/L,瓊脂15 g/L,調(diào)pH為7。

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基:牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5.0 g/L、瓊脂15 g/L,調(diào)pH為7。不加瓊脂則為牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基。

1.2 方 法

1.2.1 PAM降解菌的分離、富集和馴化

稱取3 g土壤接種于100 mL富集培養(yǎng)基中,在30 ℃、140 r/min的振蕩條件下培養(yǎng)48 h得到富集菌液。取5 mL富集菌液接種于100 mL含0.6 g/L PAM的馴化培養(yǎng)基中,同樣在30 ℃、140 r/min的振蕩條件下培養(yǎng)7 d,再取5 mL馴化液依次轉(zhuǎn)接到含0.9、1.2、1.5、1.8、2.0 g/L PAM馴化培養(yǎng)基中,逐級(jí)馴化培養(yǎng)。取最終馴化液1 mL涂布在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上,30 ℃下倒置培養(yǎng)24 h。挑取平板上不同菌落在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中進(jìn)行劃線培養(yǎng),將純化的單菌落接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,30 ℃培養(yǎng)24 h,加入與菌液體積相同的30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))無(wú)菌甘油,分裝至菌種保存管(1 mL/管),-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 測(cè)定并計(jì)算PAM降解率

采用淀粉-碘化鎘分光光度法[22]測(cè)定PAM并計(jì)算降解率。

1.2.3 PAM降解菌的形態(tài)學(xué)與生理生化鑒定

將分離得到的單菌落接種到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后,觀察菌落的大小、形狀等特征[23]。同時(shí),把上述分離得到的單菌制備成涂片標(biāo)本,經(jīng)革蘭氏染色后觀察細(xì)菌形態(tài);進(jìn)行葡萄糖產(chǎn)酸、H2S產(chǎn)生、檸檬酸鹽利用、淀粉利用、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、VP實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)、明膠利用、蔗糖利用、鼠李糖利用等生理生化鑒定[24]。

1.2.4 PAM降解菌的分子生物學(xué)鑒定

采用TIANGEN細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸(DNA)試劑盒提取供試菌株的DNA,利用通用引物16F(5’-AGAGTTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和16R(5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)對(duì)細(xì)菌的16S rDNA進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增,擴(kuò)增體系(50 μL):2×Taq PCR Master Mix 25 μL,引物16F和16R(10 μmol/L)各2 μL,模板DNA 2 μL,雙蒸水19 μL;擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性5 min后,95 ℃變性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,34個(gè)循環(huán),再72 ℃延伸10 min。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像檢測(cè)條帶大小,擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,所得結(jié)果經(jīng)美國(guó)國(guó)家生物信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后,挑選相關(guān)序列,在MEGA 7.0軟件中采用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.5 不同外碳源對(duì)降解PAM的影響

以營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中酵母粉的濃度為參考,分別在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入5 g/L葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖、乙酸鈉作為外碳源,并以原基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對(duì)照。準(zhǔn)確量取50 mL上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基置于150 mL錐形瓶中,接種2%(體積分?jǐn)?shù),下同)菌液后置于30 ℃、140 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)5 d,測(cè)定PAM并計(jì)算降解率。

1.2.6 不同外氮源對(duì)降解PAM的影響

以營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中胰蛋白胨的濃度為參考,分別在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10.0 g/L脲、硝酸鉀、酵母粉、蛋白胨、氯化銨作為外氮源,并以原基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對(duì)照。準(zhǔn)確量取50 mL上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基置于150 mL錐形瓶中,接種2%菌液后置于30 ℃、140 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)5 d,測(cè)定PAM并計(jì)算降解率。

1.2.7 金屬離子對(duì)降解PAM的影響

以不加金屬離子的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對(duì)照,分別在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加Fe3+、Mn2+、Fe2+、Cu2+(金屬離子質(zhì)量濃度均為30 mg/L[25]115)。準(zhǔn)確量取50 mL上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基置于150 mL錐形瓶中,接種2%菌液后置于30 ℃、140 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)5 d,測(cè)定PAM并計(jì)算降解率。

1.2.8 單因素試驗(yàn)初步探究外碳源、外氮源和金屬離子的量

準(zhǔn)確量取50 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基置于150 mL錐形瓶中,接種2%菌液后分別加入1、3、5、7、9 g/L的最優(yōu)外碳源,置于30 ℃、140 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)5 d,研究影響降解PAM的最優(yōu)外碳源量。同樣的方法考察不同最優(yōu)外氮源、最優(yōu)金屬離子的量,最優(yōu)外氮源考察了2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 g/L,最優(yōu)金屬離子考察了10、20、30、40、50 mg/L。

1.2.9 正交試驗(yàn)確認(rèn)外碳源、外氮源和金屬離子的量

在單因素試驗(yàn)初步確定外碳源蔗糖、外氮源硝酸鉀和金屬離子Fe2+的量基礎(chǔ)上,采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)一步確認(rèn)它們的量。正交試驗(yàn)的因素和水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素和水平

2 結(jié)果與分析

2.1 PAM降解菌的分離與鑒定

從大慶油田周邊土壤中分離到11株P(guān)AM降解菌,分別命名為JBX-001～JBX-011,它們的原始PAM降解率依次為29.59%、22.66%、33.78%、21.64%、40.56%、42.24%、39.30%、28.62%、23.08%、29.93%、28.03%,可見(jiàn)JBX-006的原始PAM降解率最高,因此以JBX-006為PAM優(yōu)勢(shì)降解菌,因此對(duì)JBX-006進(jìn)一步富集和馴化。

通過(guò)牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn),JBX-006菌落呈圓形,大小2～3 mm,表面濕潤(rùn)有隆起,菌落淡黃,不透明,邊緣光滑平整。

生理生化鑒定表明,JBX-006的革蘭氏染色、葡萄糖產(chǎn)酸、H2S產(chǎn)生、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、VP實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)均為陰性,能夠利用檸檬酸鹽和淀粉,不能利用明膠、蔗糖和鼠李糖。由菌落形態(tài)學(xué)與菌株生理生化鑒定結(jié)果可初步判定JBX-006為不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)。

瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在1 500 bp左右有一特異性條帶。測(cè)序結(jié)果表明,菌株JBX-006的16S rDNA長(zhǎng)度為1 493 bp,經(jīng)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),與不動(dòng)桿菌屬的相似度達(dá)到99%。采用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(見(jiàn)圖1),JBX-006與不動(dòng)桿菌屬聚為一類,根據(jù)距離可確定為瓊氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterjunii)。該菌在30 ℃、pH 7.0左右時(shí),7 d可對(duì)水體中十六烷烴降解率高達(dá)75%[26]。

圖1 JBX-006的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.2 PAM優(yōu)勢(shì)降解菌JBX-006的降解特性

2.2.1 外碳源對(duì)不動(dòng)桿菌JBX-006降解PAM的影響

碳是構(gòu)成生物體的必需元素,碳源是影響PAM降解菌生長(zhǎng)和降解性能的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。PAM是高分子有機(jī)物,微生物利用外碳源才能更好地釋放特定酶使PAM酰胺鍵斷裂,變?yōu)樾》肿游镔|(zhì)[27]。從圖2可以看出,不同外碳源會(huì)影響JBX-006對(duì)PAM的降解效果。加入蔗糖、可溶性淀粉和乙酸鈉可以提高JBX-006對(duì)PAM的降解率,降解率分別為70.66%、59.17%、44.41%,比對(duì)照分別增加27.54、16.07、1.30百分點(diǎn),而加入葡萄糖和乳糖后,JBX-006對(duì)PAM的降解率反而降低,因此蔗糖可作為最優(yōu)外碳源。

圖2 不同外碳源對(duì)PAM降解的影響

2.2.2 外氮源對(duì)不動(dòng)桿菌JBX-006降解PAM的影響

氮亦是構(gòu)成生物體的必需元素,氮源影響著PAM降解菌的生長(zhǎng)和降解性能。有研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)含有PAM的環(huán)境中添加外氮源后,微生物會(huì)利用添加的外氮源快速生長(zhǎng),釋放酰胺酶切斷PAM的酰胺鍵,然后再利用由此產(chǎn)生的氮源大量繁殖,加快降解PAM的速度[28]。從圖3可以看出,不同氮源也會(huì)影響JBX-006對(duì)PAM的降解效果。加入硝酸鉀可以提高JBX-006對(duì)PAM的降解率,降解率為52.18%,比對(duì)照增加9.08百分點(diǎn),但加入脲、蛋白胨、酵母粉、氯化銨后,JBX-006對(duì)PAM的降解率降低。因此,硝酸鉀為最優(yōu)外氮源。

圖3 不同外氮源對(duì)PAM降解的影響

2.2.3 金屬離子對(duì)不動(dòng)桿菌JBX-006降解PAM的影響

金屬離子是影響微生物降解PAM的一個(gè)重要因素,特別是無(wú)機(jī)鹽可為微生物機(jī)體提供生命活動(dòng)必需的無(wú)機(jī)離子,起到參與酶合成、調(diào)節(jié)滲透壓平衡等作用[25]117。由圖4可知,不同的金屬離子對(duì)PAM降解有較大影響。加入Cu2+、Mn2+、Fe3+后,JBX-006對(duì)PAM的降解率降低,這可能是因?yàn)榻饘匐x子與PAM發(fā)生化學(xué)交聯(lián),形成不溶的聚合物膠團(tuán),使得JBX-006不能很好地利用PAM。但是,Fe2+可以促進(jìn)JBX-006降解PAM,使PAM降解率相比對(duì)照提高25.08百分點(diǎn),這與卞立紅等[25]116報(bào)道的研究結(jié)果基本一致。由此確定Fe2+為最優(yōu)金屬離子。

圖4 不同金屬離子對(duì)PAM降解的影響

2.2.4 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖5可見(jiàn),在試驗(yàn)范圍內(nèi),當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入不同濃度的蔗糖、硝酸鉀和Fe2+時(shí),JBX-006對(duì)PAM的降解率均呈先升高后降低的趨勢(shì),可以發(fā)現(xiàn)最優(yōu)蔗糖添加量為5 g/L、最優(yōu)硝酸鉀添加量為10.0 g/L、最優(yōu)Fe2+添加量為30 mg/L。

圖5 蔗糖、硝酸鉀、Fe2+添加量對(duì)PAM降解的影響

2.2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

JBX-006降解PAM的正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2,通過(guò)極差分析發(fā)現(xiàn),蔗糖的影響最大,Fe2+的影響最小,蔗糖、硝酸鉀、Fe2+的最優(yōu)添加量分別為5 g/L、10.0 g/L、30 mg/L,與單因素試驗(yàn)結(jié)果一致。在正交試驗(yàn)得到的最佳條件下,驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),JBX-006對(duì)PAM的降解率可達(dá)81.65%,遠(yuǎn)高于對(duì)照,也高于前人報(bào)道的不同細(xì)菌對(duì)PAM的降解率[13]74。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié) 論

在大慶油田周邊土壤中富集、馴化、分離獲得1株可高效降解PAM的優(yōu)勢(shì)菌JBX-006,經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)鑒定為瓊氏不動(dòng)桿菌。該菌株生長(zhǎng)的最優(yōu)外碳源、最優(yōu)外氮源和最優(yōu)金屬離子分別是蔗糖、硝酸鉀和Fe2+,在5 g/L蔗糖、10.0 g/L硝酸鉀、30 mg/L Fe2+的最優(yōu)條件下,30 ℃培養(yǎng)5 d對(duì)300 mg/L的PAM的降解率可達(dá)81.65%。