一株銅綠微囊藻溶藻真菌的分離鑒定及溶藻特性*

洪桂云 朱鈺妮 黃浚峰 朱曙光

(1.安徽建筑大學(xué)環(huán)境與能源工程學(xué)院,安徽 合肥 230601;2.建筑能效控制與評(píng)估教育部工程研究中心,安徽 合肥 230601)

近年來(lái),全球氣候變暖和水體富營(yíng)養(yǎng)化加劇導(dǎo)致藍(lán)藻水華在世界范圍內(nèi)頻繁爆發(fā),已成為全球性的水環(huán)境問(wèn)題[1-2]。藍(lán)藻水華不僅破壞淡水生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能[3],而且其代謝過(guò)程中還會(huì)產(chǎn)生大量有毒有害次生代謝物質(zhì),如藍(lán)藻毒素、惡臭氣體等,從而影響水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和飲用水的安全[4-6]。銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)是常見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)藍(lán)藻水華藻種之一,太湖、巢湖、滇池曾多次爆發(fā)銅綠微囊藻水華,因此尋找高效經(jīng)濟(jì)的防止藻類爆發(fā)的方法成為眼下人們重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題。

目前,國(guó)內(nèi)外主要的藻類控制方法有物理法、化學(xué)法和生物法3大類。物理法能直接消除水中的藻類,且不產(chǎn)生二次污染,但成本高,難以大規(guī)模應(yīng)用[7]?；瘜W(xué)法工藝簡(jiǎn)單,操作方便,但不能從根本上改善水質(zhì),且容易造成二次污染[8]。生物法因其經(jīng)濟(jì)、高效、環(huán)境友好的特點(diǎn)逐漸成為控藻的主流方法[9-10]。自然界中有許多微生物對(duì)藻類具有抑制作用,包括放線菌[11]、真菌[12-13]、細(xì)菌[14]等。MOHAMED等[15]搜集了1960—2021年關(guān)于水華藍(lán)藻控制的文獻(xiàn)共145篇,其中關(guān)于細(xì)菌對(duì)藍(lán)藻生長(zhǎng)影響的論文多達(dá)95篇,而關(guān)于真菌溶藻能力和溶藻方式的報(bào)道相對(duì)較少,目前只有15種真菌被鑒定為能夠抑制和裂解藍(lán)藻細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn),真菌對(duì)銅綠微囊藻的降解速率可能比細(xì)菌更快[16]。因此,本研究從富營(yíng)養(yǎng)化水體及附近土壤中分離篩選出一株溶藻真菌,研究其溶藻特性、溶藻方式及溶藻效果,為利用溶藻真菌控藻提供更多實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試藻種

銅綠微囊藻購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院淡水藻種庫(kù)(FACHB),經(jīng)活化后接種于BG11培養(yǎng)基,置于恒溫光照條件下培養(yǎng),溫度設(shè)置為25 ℃,光照強(qiáng)度設(shè)置為2 000 lx,光暗比為12 h∶12 h,每天早中晚3次手動(dòng)振蕩搖勻預(yù)培養(yǎng)7 d。

1.2 溶藻菌株的分離與鑒定

在安徽建筑大學(xué)校內(nèi)兩個(gè)小池塘各取500 mL水樣,并在水樣采集地附近各取距地面10 cm處的潮濕土樣10 g。水樣采回后立即經(jīng)0.8 μm濾膜粗過(guò)濾,再過(guò)0.45 μm纖維濾膜,然后把0.45 μm纖維濾膜剪成小份,投入150 mL液體察氏培養(yǎng)基中,30 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h。土樣取回后溶入500 mL蒸餾水中并在150 r/min下振蕩2 h,靜置,取10 mL上清液加入到150 mL液體察氏培養(yǎng)基中,30 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組,為150 mL液體察氏培養(yǎng)基,30 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h。在培養(yǎng)后的5瓶菌液中各取10 mL,按體積比1∶9加入預(yù)培養(yǎng)后的銅綠微囊藻藻液中。取黃化藻液,平板劃線分離單菌落,在30 ℃下培養(yǎng)72 h后選20種形態(tài)、大小各異的單菌落,再進(jìn)行復(fù)選,取最早使藻液黃化的溶藻真菌菌株JHQ3進(jìn)一步研究。

用TaKaRa試劑盒提取溶藻真菌菌株脫氧核糖核酸(DNA)[17],采用瓊脂糖凝膠電泳分析所提取的DNA。以提取的DNA為模板,用真菌的ITS通用引物對(duì)真菌基因組進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增,其中上游引物為P1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’),下游引物為P2(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)。擴(kuò)增條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增得到的目的片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后,在紫外燈下切割并收集長(zhǎng)度為500 bp左右的片段,經(jīng)Axygene膠回收試劑盒純化后測(cè)序。將測(cè)得的序列用DNAstar軟件編輯后,在美國(guó)國(guó)家生物信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)中利用Blast軟件與GenBank中已知的ITS序列進(jìn)行同源性比較,選取同源性較高的序列利用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3 菌株JHQ3生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

采用干重法測(cè)定生長(zhǎng)曲線。將菌株JHQ3接種于100 mL液體察氏培養(yǎng)基中制成菌懸液,150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h,使菌懸液渾濁,取5 mL加入500 mL滅菌的液體察氏培養(yǎng)基,繼續(xù)150 r/min振蕩培養(yǎng)。每隔12 h取出10 mL用定量濾紙過(guò)濾,過(guò)濾前記錄濾紙質(zhì)量,過(guò)濾后100～105 ℃烘干后再次稱量,過(guò)濾前后的質(zhì)量差為菌體干重。繪制以時(shí)間為橫坐標(biāo),菌體干重為縱坐標(biāo)的曲線,即為菌株JHQ3的生長(zhǎng)曲線。結(jié)果表明,JHQ3在0～4 h處于停滯期,4～36 h處于對(duì)數(shù)期,36～72 h處于穩(wěn)定期,72 h后進(jìn)入衰亡期。處于穩(wěn)定期時(shí)真菌生物量最大,故后續(xù)選取穩(wěn)定期菌液作為原菌液進(jìn)行溶藻實(shí)驗(yàn)。

1.4 菌株JHQ3溶藻方式探究

對(duì)分離得到的菌株JHQ3原菌液采取3種方式處理:10 000 r/min離心10 min,得到上清液a;移走上清液后的離心渣用滅菌后的液體察氏培養(yǎng)基定容至5 mL,使菌體重新懸浮,得到菌懸液b;不作處理為原菌液c。分別將上清液a、菌懸液b和原菌液c按體積比1∶99接種至預(yù)培養(yǎng)后的銅綠微囊藻藻液中進(jìn)行溶藻實(shí)驗(yàn)?？瞻讓?duì)照組不加菌液,用相同體積的BG-11培養(yǎng)基代替。6 d后采用超聲輔助熱乙醇提取/分光光度法測(cè)定葉綠素a,并按式(1)計(jì)算溶藻率。

1.5 菌株JHQ3的溶藻特性研究

1.5.1 菌液濃度對(duì)溶藻效果的影響

將原菌液分別稀釋至100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6,按體積比1∶99分別接種至預(yù)培養(yǎng)后的銅綠微囊藻藻液中進(jìn)行溶藻實(shí)驗(yàn),并設(shè)置對(duì)照組不加菌液(下同),6 d后測(cè)定葉綠素a并計(jì)算溶藻率。

(1)

1.5.2 光照時(shí)間對(duì)溶藻效果的影響

將原菌液按體積比1∶99接種至預(yù)培養(yǎng)后的銅綠微囊藻藻液中進(jìn)行溶藻實(shí)驗(yàn),光暗比考察了12 h∶12 h和24 h∶0 h兩組,分別設(shè)了對(duì)照組,6 d后測(cè)定葉綠素a并計(jì)算溶藻率。

1.5.3 培養(yǎng)溫度對(duì)溶藻效果的影響

將原菌液按體積比1∶99接種至預(yù)培養(yǎng)后的銅綠微囊藻藻液中進(jìn)行溶藻實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)溫度考察了20、25、30 ℃,并分別設(shè)置對(duì)照組,6 d后測(cè)定葉綠素a并計(jì)算溶藻率。

1.5.4 pH對(duì)溶藻效果的影響

將液體察氏培養(yǎng)基pH分別調(diào)整為5、6、7、8、9,將原菌液按體積比1∶99接種至預(yù)培養(yǎng)后的銅綠微囊藻藻液中進(jìn)行溶藻實(shí)驗(yàn),并分別設(shè)置對(duì)照組,6 d后測(cè)定葉綠素a并計(jì)算溶藻率。

1.5.5 添加表面活性劑對(duì)溶藻效果的影響

將1 mL原菌液轉(zhuǎn)接到100 mL液體察氏培養(yǎng)基中,30 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h,分別加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%的乙二胺四乙酸(EDTA)和Tween-80,繼續(xù)振蕩培養(yǎng)2 d,將此時(shí)的原菌液按體積比1∶99接種至預(yù)培養(yǎng)后的銅綠微囊藻藻液中進(jìn)行溶藻實(shí)驗(yàn),并設(shè)置對(duì)照組,6 d后測(cè)定葉綠素a并計(jì)算溶藻率。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶藻菌株的分離與鑒定結(jié)果

將PCR擴(kuò)增JHQ3產(chǎn)物與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(見(jiàn)圖1),發(fā)現(xiàn)菌株JHQ3與AspergillussydowiiMEF105(KT315450)聚于一枝,因此鑒定菌株JHQ3為薩氏曲霉菌屬(Aspergillussydowii)。

圖1 菌株JHQ3的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.2 溶藻菌株JHQ3的溶藻方式

由圖2可見(jiàn),原菌液c和菌懸液b的溶藻效果好,溶藻率分別達(dá)到98.21%、91.07%,不過(guò)上清液a也可通過(guò)釋放的胞外物質(zhì)達(dá)到溶藻效果,其溶藻率為71.43%。由此說(shuō)明,該溶藻菌株主要通過(guò)自身直接裂解藻細(xì)胞溶藻,也通過(guò)分泌胞外活性物質(zhì)溶藻[18],故可判斷溶藻菌株JHQ3的溶藻方式是直接溶藻和間接溶藻并存,且以直接溶藻方式為主[19]。

圖2 溶藻菌株JHQ3的溶藻方式探究

2.3 菌株JHQ3的溶藻特性

2.3.1 菌液濃度對(duì)銅綠微囊藻的溶藻效果影響

由圖3可見(jiàn),原菌液(菌液濃度100)溶藻率最高,達(dá)到97.56%,稀釋至10-1、10-2、10-3的菌液溶藻率分別為92.68%、85.37%、12.20%,菌液濃度稀釋至10-3以下,溶藻效果較差。菌液濃度是反映細(xì)菌密度的重要參數(shù)。洪桂云等[20]研究細(xì)菌不同菌液濃度對(duì)銅綠微囊藻的去除效果也表明,菌液濃度越高,溶藻效果越好,與本研究結(jié)論一致。

圖3 不同菌液濃度的溶藻效果

2.3.2 光照時(shí)間對(duì)銅綠微囊藻的溶藻效果影響

由圖4可見(jiàn),在光暗比為12 h∶12 h時(shí)溶藻效率高于24 h∶0 h時(shí),說(shuō)明接近自然光照條件能夠使溶藻菌起到更好的溶藻效果,有利于實(shí)際應(yīng)用。

圖4 不同光照時(shí)間的溶藻效果

2.3.3 培養(yǎng)溫度對(duì)銅綠微囊藻的溶藻效果影響

由圖5可見(jiàn),在30 ℃培養(yǎng)溫度下,溶藻率為94.06%,溶藻效果較好,25、20 ℃培養(yǎng)溫度下,溶藻率分別為81.44%、61.06%,這是因?yàn)樗_氏曲霉菌屬的適宜生長(zhǎng)溫度為30～37 ℃,因此實(shí)際應(yīng)用溶藻菌JHQ3控藻時(shí),溫度宜控制在30 ℃以上。

2.3.4 pH對(duì)銅綠微囊藻的溶藻效果影響

由圖6可見(jiàn),pH為7時(shí)溶藻效果最優(yōu),溶藻率達(dá)83.39%;pH為9時(shí)溶藻效果最差,溶藻率只有50.00%,說(shuō)明溶藻菌株JHQ3在堿性條件下會(huì)受到較大抑制,能耐一定的酸性,但在中性條件下對(duì)銅綠微囊藻的溶藻效果最好。朱葉飛等[21]、劉茜[22]得出pH為6時(shí)溶藻效果最好,袁軻婷等[23]得出pH為8時(shí)溶藻效果最好,與本研究比較接近。

圖6 不同pH的溶藻效果

2.3.5 添加表面活性劑對(duì)銅綠微囊藻的溶藻效果影響

由圖7可見(jiàn),與對(duì)照組相比,添加表面活性劑Tween-80或EDTA均會(huì)抑制JHQ3溶藻,而且添加EDTA的抑制效果比添加Tween-80更為明顯。

圖7 添加表面活性劑的溶藻效果

3 結(jié) 論

(1) 從校園環(huán)境中篩選到溶藻效果較好的溶藻真菌菌株JHQ3。通過(guò)ITS序列分析,初步鑒定菌株JHQ3為薩氏曲霉菌屬。

(2) 溶藻菌株JHQ3的溶藻方式研究表明,該菌株溶藻方式以直接溶藻為主,間接溶藻為輔。

(3) 溶藻菌株JHQ3原菌液的溶藻率最高可達(dá)97.56%,該菌株在30 ℃下溶藻效果最好,溶藻率可以達(dá)到94.06%,pH為7時(shí)溶藻效果達(dá)83.39%,光暗比12 h∶12 h時(shí)溶藻效果較好,表面活性劑對(duì)溶藻真菌JHQ3有一定的抑制作用,EDTA的抑制作用要大于Tween-80的抑制作用。