富勒醇促進(jìn)小鼠皮膚創(chuàng)面愈合的療效及機(jī)制

梁富程,何志強(qiáng),張偉楠,鞏志丹,范曉棠,魯元剛

（1. 陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院整形美容科，重慶 400042；2. 中國人民解放軍31411部隊(duì)，遼寧 沈陽 110020；3. 陸軍軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)心理系軍事認(rèn)知心理學(xué)教研室，重慶 400038）

臨床上燒創(chuàng)傷、腫瘤及潰瘍等常導(dǎo)致皮膚創(chuàng)面不能愈合或無愈合傾向，不僅增加了治療難度，還加重了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，已成為一個棘手的公共問題[1]。研究發(fā)現(xiàn)，各種致病因素會引起核因子κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）信號通路的持續(xù)激活，并促進(jìn)白介素1β（interleukin-1β,IL-1β）、白介素6（interleukin-6,IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）等炎癥因子的釋放，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥過程的持續(xù)存在[2]。持續(xù)的炎癥狀態(tài)和異常的炎癥因子分泌會導(dǎo)致傷口愈合停留在炎癥階段，是臨床上皮膚創(chuàng)面遷延不愈的重要原因[3]。目前，針對創(chuàng)面延遲愈合的治療方法仍不能很好地解決炎癥問題，導(dǎo)致病情反復(fù)，效果不佳。因此，尋找一種新型主動抗炎藥物促進(jìn)皮膚創(chuàng)面的愈合，從而實(shí)現(xiàn)創(chuàng)面解剖和功能的重建與修復(fù)具有重要意義[4-5]。

富勒醇（fullerenol,FUL）作為一種新型的生物材料，是具有多羥基的C60分子，因其具有性質(zhì)穩(wěn)定、價(jià)格低廉、較好的生物相容性等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛關(guān)注。但其生物合成過程中可能會產(chǎn)生大量的有機(jī)溶劑及酸堿，限制了其應(yīng)用。本研究所采用的富勒醇通過催化劑輔助機(jī)械化學(xué)方法合成，可提高產(chǎn)量且不需要純化[6]。在抑郁癥及放射性皮炎等動物模型中，富勒醇表現(xiàn)出良好的抗氧化活性和化學(xué)抗炎等功能[6-7]；但其對小鼠皮膚創(chuàng)面愈合的影響目前尚不清楚。基于此，本研究建立小鼠皮膚創(chuàng)面模型，觀察經(jīng)富勒醇治療的效果并初步探討其機(jī)制，以期為臨床皮膚創(chuàng)面修復(fù)提供新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

6～8周齡雄性健康C57BL/6小鼠24只，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司[生產(chǎn)許可證號：SYXK(渝)2017-0002]，體質(zhì)量18～23 g，每籠4只飼養(yǎng)，自由飲水、飲食，環(huán)境溫度21～24 ℃，相對濕度50%～60%，維持12 h光照/12 h黑暗的晝夜交替節(jié)律。所有實(shí)驗(yàn)均在陸軍軍醫(yī)大學(xué)軍事認(rèn)知心理學(xué)教研室動物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 主要試劑

富勒醇根據(jù)高能物理研究所和國家納米科學(xué)技術(shù)中心（中國北京）的報(bào)告合成，并溶于0.9%生理鹽水中（10 mg/mL）。RIPA裂解緩沖液購自上海碧云天公司，ELISA試劑盒購自廈門慧佳科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國賽默飛公司，脫毛膏購自法國薇婷公司，HE染色試劑盒購自上海碧云天公司，Masson染色試劑盒購自上海貝博生物公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及模型建立

將24只小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（對照組）、模型組+生理鹽水組（NS組）及模型組+富勒醇組（FUL組），每組8只。給予小鼠1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，背部術(shù)區(qū)備皮后，于俯臥位固定，術(shù)區(qū)常規(guī)碘伏消毒，乙醇脫碘，脫毛膏脫毛。真手術(shù)組建模：通過打孔的方式在小鼠背部作2個直徑6 mm的圓形全層皮膚缺損創(chuàng)面，術(shù)后單籠喂養(yǎng)[8-9]。建模成功后，立即給予FUL組小鼠腹腔注射10 mg/kg富勒醇[6]，其余2組注射等體積生理鹽水。各組小鼠每日給藥1次，連續(xù)7 d。干預(yù)結(jié)束后，麻醉狀態(tài)下處死小鼠，取材制作切片并進(jìn)行相應(yīng)檢測。

1.4 皮膚創(chuàng)面愈合率的計(jì)算

治療后第3、7天，數(shù)碼相機(jī)采集小鼠皮膚創(chuàng)面圖片，利用Image J軟件分析圖像，每只小鼠的創(chuàng)面面積取平均值，創(chuàng)面愈合率=（創(chuàng)面初始面積-第n天創(chuàng)面面積）/創(chuàng)面初始面積×100%。

1.5 HE染色

采用HE染色試劑盒，將創(chuàng)緣石蠟切片放入二甲苯中，梯度乙醇水化后，依次放入蘇木素、伊紅染液進(jìn)行染色，然后梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片并拍照。分析圖像，計(jì)算上皮爬行距離及肉芽組織厚度。

1.6 Masson染色

采用Masson染色試劑盒，將創(chuàng)緣切片脫蠟（方法同HE染色），依次加入蘇木素、麗春紅、苯胺藍(lán)等進(jìn)行染色，梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片后拍照。分析圖像，統(tǒng)計(jì)膠原容積分?jǐn)?shù)。

1.7 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)

每組分離3只小鼠皮膚創(chuàng)面樣本，在4 ℃的RIPA裂解緩沖液中研磨勻漿，4 ℃下以15 000 r/min離心裂解產(chǎn)物10 min，使用二辛可寧酸試劑盒測定蛋白濃度。將樣品（每泳道10 μL）在10% SDS-PAGE上以80 V分離120 min，然后以220 mA轉(zhuǎn)移到PVDF膜上120 min。5%脫脂牛奶室溫封閉3 h。然后將膜與IL-1β（1∶1 000）、IL-6（1∶1 000）、TNF-α（1∶1 000）、NF-κB（1∶1 000）、β-actin (1∶10 000）一抗孵育，再與辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗孵育。通過增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法觀察膜上的特異性蛋白條帶。使用Image Lab軟件計(jì)算條帶的灰度值。

1.8 RT-qPCR檢測相關(guān)mRNA表達(dá)

每組分離3只小鼠皮膚創(chuàng)面樣本，研磨勻漿后置于4 ℃ TRIzol試劑中，加入200 μL氯仿，劇烈振蕩15 s，4 ℃下以12 000 r/min離心裂解產(chǎn)物10 min。取水相溶液，添加200 μL 70%乙醇(無RNase水配制)到吸附柱。離心后，使用Nano Drop 2000分光光度計(jì)測定RNA濃度，按照說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR儀進(jìn)行RT-qPCR，采用比較周期閾值方法定量RNA的相對量。引物見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.9 ELISA檢測血清炎癥因子水平及氧化應(yīng)激水平

干預(yù)結(jié)束后，每組取6只小鼠血液常溫放置2 h后離心，得到血清樣本；取創(chuàng)緣組織采用預(yù)冷的PBS清洗，去除血跡及多余筋膜，剪碎并稱重。組織和PBS（含蛋白酶抑制劑）按照質(zhì)量體積比1∶9混勻，充分研磨后，以3 000 r/min離心10 min，獲取組織勻漿。按照說明書操作，使用比色法分別計(jì)算血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量及創(chuàng)緣組織中丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性。

1.1 0 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，2組間比較采用配對樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體質(zhì)量變化

各組小鼠每天的體質(zhì)量無明顯變化（P＞0.05），見圖1，說明富勒醇對小鼠的生長發(fā)育無明顯影響。

圖1 小鼠每日體質(zhì)量變化圖

2.2 小鼠創(chuàng)面愈合情況

NS組和FUL組小鼠的創(chuàng)面均隨著時間推移不斷變小，在同一時間點(diǎn)，F(xiàn)UL組小鼠的愈合率均高于NS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 小鼠創(chuàng)面愈合情況

2.3 小鼠創(chuàng)面HE染色及Masson染色

HE染色結(jié)果顯示，治療后第7天，與NS組相比，F(xiàn)UL組上皮結(jié)構(gòu)連續(xù)、完整，上皮爬行距離遠(yuǎn)，肉芽組織更厚，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Masson染色結(jié)果顯示，治療后第7天，F(xiàn)UL組的膠原纖維更加密集且排列整齊，膠原容積分?jǐn)?shù)高于NS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)，見圖3。

圖3 小鼠創(chuàng)面組織HE染色及Masson染色

2.4 各組小鼠創(chuàng)面組織IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB的蛋白表達(dá)水平比較

治療后第7天，F(xiàn)UL組小鼠皮膚創(chuàng)面組織的IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB的蛋白表達(dá)水平均低于NS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但FUL組以上蛋白表達(dá)水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖4。

圖4 小鼠創(chuàng)面組織炎癥因子的蛋白表達(dá)

2.5 各組小鼠創(chuàng)面組織IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表達(dá)水平比較

RT-qPCR結(jié)果顯示，治療后第7天，F(xiàn)UL組的創(chuàng)面組織炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)均低于NS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但FUL組以上炎癥因子mRNA的表達(dá)與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖5。

圖5 小鼠創(chuàng)面組織炎癥因子的mRNA表達(dá)

2.6 各組小鼠血清炎癥因子及創(chuàng)面組織氧化應(yīng)激水平比較

ELISA結(jié)果顯示，治療后第7天，F(xiàn)UL組的血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平均低于NS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），F(xiàn)UL組以上血清炎癥因子水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與NS組相比，F(xiàn)UL組創(chuàng)面組織的MDA含量明顯下降，SOD活性明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但FUL組氧化應(yīng)激水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖6。

圖6 小鼠血清炎癥因子及創(chuàng)面組織氧化應(yīng)激水平

3 討論

創(chuàng)面修復(fù)是一個復(fù)雜而有序的生物學(xué)過程，大致可以分為出血炎癥期、細(xì)胞增殖期、組織重塑期，三個時期相互獨(dú)立又彼此緊密聯(lián)系。皮膚傷口修復(fù)的關(guān)鍵因素是傷口炎癥、傷口收縮和上皮再形成[10]。皮膚創(chuàng)面難治愈的主要原因在于其不遵循正常有序的愈合過程，可能出現(xiàn)角化細(xì)胞遷移障礙、創(chuàng)面上皮化困難、炎癥因子持續(xù)釋放、巨噬細(xì)胞比例失調(diào)等。既往研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)面難愈合與氧化應(yīng)激和炎癥過程持續(xù)存在有關(guān)，炎癥和氧化應(yīng)激之間相互作用，互為因果[11]。目前，藥物治療均無法達(dá)到理想效果，精準(zhǔn)調(diào)節(jié)炎癥過程，并解決傷口過度氧化應(yīng)激問題是促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵。

出血炎癥期作為創(chuàng)面愈合的初期，也是傷口的第一道防御機(jī)制，對整個愈合過程至關(guān)重要[12]。炎癥反應(yīng)中的抗炎和促炎因子是一把雙刃劍，適度炎癥對組織修復(fù)有益，但過度炎癥不利于傷口愈合[13]。適度炎癥可以激活中性粒細(xì)胞，釋放炎癥因子，同時激活機(jī)體釋放轉(zhuǎn)化生長因子、血小板衍生生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子和表皮生長因子等，這些生長因子會吸引更多的免疫細(xì)胞參與創(chuàng)面的愈合過程。NF-κB是一種參與先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，其適度活化對于機(jī)體抵御創(chuàng)傷、感染等具有重要意義，過度活化又可誘導(dǎo)IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子的過度表達(dá)；TNF-α也可以激活NF-κB通路的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，NF-κB通路的激活又可以誘導(dǎo)多種炎癥介質(zhì)的表達(dá)，形成一個自分泌增強(qiáng)的回路，加劇炎癥反應(yīng)。本研究中，F(xiàn)UL組IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB的表達(dá)水平較NS組均有不同程度下降，說明富勒醇具有調(diào)節(jié)傷口炎癥的能力，其可以調(diào)控創(chuàng)緣NF-κB的水平，從而減少創(chuàng)面周圍組織及血液中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)，有助于創(chuàng)面正常愈合。

皮膚創(chuàng)面的局部微環(huán)境被破壞，如氧化應(yīng)激水平升高、血液灌注不良等，會導(dǎo)致創(chuàng)面愈合困難[14-15]。因此，調(diào)節(jié)創(chuàng)面氧化應(yīng)激水平也極為重要。MDA是脂質(zhì)與氧自由基反應(yīng)形成的產(chǎn)物之一，其與皮膚創(chuàng)面不愈合密切相關(guān)[16]。氧自由基可加快巨噬細(xì)胞遷移，引起炎癥和促纖維化細(xì)胞因子的釋放，進(jìn)一步刺激活性氧產(chǎn)生。過量的活性氧可通過激活對氧化還原狀態(tài)敏感的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB從而促進(jìn)促炎因子的表達(dá)，進(jìn)一步上調(diào)血管細(xì)胞黏附分子-1、細(xì)胞間黏附分子-1及單核細(xì)胞趨化蛋白-1等與炎癥相關(guān)的基因產(chǎn)物的表達(dá)，加劇炎癥反應(yīng)；此外，自由基所致的氧化應(yīng)激與炎癥通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)而相互影響，形成自由基-氧化應(yīng)激-炎癥-氧化應(yīng)激-自由基的惡性循環(huán)。氧化應(yīng)激通過氧化加重炎癥反應(yīng)，炎癥通過炎癥介質(zhì)促進(jìn)氧化。本研究結(jié)果顯示，與NS組相比，F(xiàn)UL組小鼠創(chuàng)面組織中MDA水平顯著降低，而SOD水平顯著升高，說明經(jīng)富勒醇治療后，傷口周圍的氧化應(yīng)激水平下降，表明富勒醇在抑制炎癥反應(yīng)的同時，可降低傷口周圍組織中的氧化應(yīng)激水平，協(xié)同降低炎癥水平，共同促進(jìn)皮膚創(chuàng)面的愈合。

再上皮化和傷口收縮是影響傷口愈合的另一重要因素。急性損傷的治療需要快速有效的上皮化過程以恢復(fù)皮膚完整性。皮膚愈合需要新生上皮在傷口床上擴(kuò)張[17-19]。本研究HE染色結(jié)果顯示，與NS組相比，F(xiàn)UL組新生上皮更長，肉芽組織更厚，說明富勒醇可促進(jìn)再上皮化。有效的傷口收縮有利于縮短愈合時間，而膠原纖維的沉積與有序排列對于提高傷口組織重塑也有不可或缺的作用[20-21]。本研究Masson染色結(jié)果顯示，F(xiàn)UL組較NS組有更多的膠原纖維沉積，膠原結(jié)構(gòu)排列更密集，膠原容積分?jǐn)?shù)更高，說明富勒醇可加快傷口收縮，從而促進(jìn)傷口愈合。

綜上，富勒醇可有效促進(jìn)小鼠皮膚創(chuàng)面愈合，其機(jī)制可能與富勒醇抑制NF-κB信號通路及下游炎癥因子表達(dá)，從而減輕炎癥、氧化應(yīng)激，促進(jìn)傷口再上皮化和增強(qiáng)傷口收縮有關(guān)。本研究結(jié)果可為臨床上創(chuàng)面的相關(guān)治療提供參考和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但本研究為動物實(shí)驗(yàn)，其臨床有效性和實(shí)用性仍有待進(jìn)一步證實(shí)。